Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
1.1 Стресс у микроорганизмов и стресс-факторы 8
Окислительный стресс и АФК 9
Механизмы защиты микроорганизмов и их адаптация к действию стрессоров 17
Перекрестная адаптация к действию разных видов стрессового воздействия 38
Изменение характеристик процессов биосинтеза при действии стресс-факторов 40
Совместное действие стресс и антистресс-факторов. Использование света низкой интенсивности для стимулирования биологической активности 42
Галобактерии как перспективный объект исследований
Среда обитания, таксономическая и биохимическая характеристика галобактерии 46
Бактериородопсин и его функции 52
Особенности культивирования галобактерии и
синтеза бактериородопсина 56
1.7.4. Практическая значимость галобактерии и
бактериородопсина 62
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 65
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ 77
3.1. Культивирование дрожжей Candida tropicalis 78
3.1.1. Культивирование дрожжей С. tropicalis при
одновременном воздействии света видимого
и УФ диапазонов спектра 78
3.1.2. Исследование роста дрожжей С. tropicalis при
воздействии УФ-излучения и лазерного излучения
видимого диапазона спектра 91
3.2. Культивирование дрожжей Saccharomyces cerevisiae 98
Исследование эффекта адаптации к пероксиду водорода и ультрафиолету 99
Динамика роста и потребления субстрата при
внесении Н20г ПО
3.2.3. Разработка рекомендаций по использованию
процесса культивирования с внесением пероксида
водорода в промышленных условиях 125
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ГАЛОБАКТЕРИЙ 127
Выбор исходных и получение мутантных штаммов 127
Выявление основных факторов, определяющих активность культуры галобактерий в отношении
синтеза бактериородопсина 133
Подбор питательной среды 133
Рост и накопление БР в условиях
культивирования с подпиткой 138
Влияние интенсивности аэрации и уровня освещения 142
Состояние и доза посевного материала 147
Культивирование с добавлением отработанной культуральной жидкости 150
Исследование эффекта старения среды 153
Влияние пероксида водорода и мягкого УФ-излучения 156
4.3. Разработка способов культивирования в условиях
контролируемого окислительного стресса 161
Подготовка посевного материала 162
Культивирование при дефиците кислорода 165
Культивирование в доливном режиме 168
Культивирование с внесением антиоксидантов 169
Подбор условий освещения 170
Культивирование с селективным извлечением ингибиторов сорбентом в процессе роста 170
Совершенствование автоматизированного комплекса для культивирования галобактерий и получения бактериородопсина 172
Оценка технико-экономических показателей получения бактериородопсина по разработанному способу в сравнении
с другими вариантами 180
ВЫВОДЫ 182
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 184
Введение к работе
Совершенствование традиционных и разработка новых способов культивирования микроорганизмов является основой для получения продуктов биосинтеза и использования специфических микробных процессов в отдельных областях биотехнологии. Постоянное внимание уделяется поиску средств, позволяющих поддерживать необходимые ростовые и биосинтетические характеристики микробных продуцентов на протяжении определенной ферментационной стадии или всего жизненного цикла. Широко применяются такие методы как иммобилизация клеток, управляемое культивирование с использованием современных оперативных средств и математических моделей, направленное вмешательство в метаболические процессы и др. Отклонение сбалансированного процесса микробного синтеза от заданных оптимальных параметров ведет к ухудшению показателей биосинтеза, а нарушение этих параметров индуцирует развитие в клетках микроорганизмов состояние стресса. Состояние стресса понимается как совокупность ответных реакций, направленных на преодоление неблагоприятных изменений окружения, вызванных стрессорным воздействием.
Длительное время считали, что стресс неблагоприятно воздействует на микроорганизмы, что выражается в подавлении их физиологической активности, снижении эффективности биосинтеза. Поэтому в многочисленных исследованиях в первую очередь обращается внимание на изучение различных изменений в живых клетках в стрессовых условиях и механизмов повышения устойчивости микроорганизмов к стрессовым воздействиям.
Однако в последнее время появляется все больше данных, указывающих на ограниченность мнения о сугубо отрицательном воздействии стресс-факторов (стрессоров) на микроорганизмы [1, 2]. В определенных условиях воздействие оптимальных доз стресс-факторов может привести к улучшению ростовых характеристик [3], других показателей биосинтеза [4, 5], повышению скорости биотрансформации и разложения загрязнений [1, 6-9] и может использоваться при получении некоторых продуктов биосинтеза, например, эрго-стерина из клеток дрожжей при обработке ультрафиолетом [10]. Показано, что микробные клетки и популяции, предадаптированные к воздействию стрессоров, зачастую обладают лучшими ростовыми характеристиками, эффективнее потребляют субстрат и образуют меньше побочных внеклеточных продуктов жизнедеятельности [2, 3, 11, 12].
Таким образом, учитывая все возрастающее число публикаций и фактов, свидетельствующих о положительном воздействии оптимальных доз стрессоров на различные процессы роста, биосинтеза и биотрансформации, целесообразнее использовать понятие оптимального или контролируемого стресса как одного из путей совершенствования процессов управляемого культивирования микроорганизмов.
Контроль стресса и стресс-факторов, избирательное усиление или подавление действия их на клетки микроорганизмов может послужить дополнительным средством для совершенствования процессов управляемого культивирования микроорганизмов в лабораторных и промышленных биореакторах.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы было выяснить закономерности изменения биосинтетических и ростовых характеристик модельных микроорганизмов в условиях контролируемого окислительного стресса для совершенствования ферментационных процессов и разработки новых подходов управляемого культивирования промышленно важных микробных продуцентов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- разработать стендовую установку и программное обеспечение для исследования процессов культивирования модельных микроорганизмов в условиях контролируемого окислительного стресса;
- исследовать изменения ростовых и биосинтетических характеристик модельных микроорганизмов при воздействии УФ облучением и пероксидом водорода, подобрать оптимальные дозы стрессоров;
- проанализировать действие факторов окружения, обладающих антистрессовым эффектом при окислительном стрессе;
- исследовать устойчивость к факторам окислительного стресса микроорганизмов различного физиологического состояния;
- исследовать совместное действие стрессорных и антистрессорных факторов в процессах культивирования модельных микроорганизмов;
- разработать методы, обеспечивающие поддержание состояния оптимального окислительного стресса для увеличения выхода целевого продукта;
- разработать автоматизированную систему культивирования и синтеза целевых продуктов в условиях контролируемого окислительного стресса.
Научная новизна.
На примере дрожжей Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae и гало-бактерий Halobacterium salinarium показана перспективность использования
контролируемого окислительного стресса для повышения эффективности ферментации.
Обнаружено, что контролируемое совместное воздействие стрессоров (Н202, мягкий ультрафиолет) и антистрессорных факторов (видимый свет низкой интенсивности, антиоксиданты, удаление ингибиторов биосинтеза) улучшает ростовые и биосинтетические характеристики модельных микроорганизмов: повышает выход биомассы, удельную скорость роста, бродильную активность и устойчивость к закисленню у дрожжей, способствует поддержанию продуктивности биореактора с высокоплотностной культурой дрожжей, повышает уровень накопления бактериородопсина при минимальном накоплении каротиноидов у галобактерий. Показано, что комбинированное действие ультрафиолета и видимого света или монохроматического излучения может выступать в качестве инструмента для управления ростом гетеротрофных микроорганизмов, не чувствительных в обычных условиях (без УФ облучения) к освещению.
Для дрожжей Saccharomyces cerevisiae показана целесообразность использования посевного материала, предобработанного Н2О2. Подобраны условия выращивания засевной культуры в условиях окислительного стресса (внесение Н2Ог в предстационарной фазе роста разово в дозе 0,3-0,6 г/л при освещении суспензии фоновым дневным светом), обеспечивающие в основном процессе в аэробных или микроаэрофильных условиях увеличение удельной скорости роста на 15-25%о, выхода биомассы на 15-25%), сокращение лаг-фазы более чем в 2 раза; в анаэробных условиях - увеличение удельной скорости роста на 30—50% и сокращение времени сбраживания субстрата на 30%).
Впервые установлено, что в процессе глубинного культивирования галобактерий (ГБ) Н. salinarium рост культуры и синтез бактериородопсина (БР) в сильной степени зависят от наличия ингибиторов, предположительно продуктов химического и/или фотохимического окисления компонентов среды, образующихся при ее хранении или использовании. С учетом этих факторов получен биосинтетически активный штамм галобактерий, подобраны оптимальные условия (среда, режим аэрации, подготовка посевного материала, освещение) и разработаны режимы культивирования (доливная культура, внесение антиокси-дантов, обработка адсорбентами), позволившие увеличить содержание бактериородопсина в клетках и его выход за цикл ферментации с 70-75 мг/л за 6-7 сут. до 1700-1750 мг/л за 8 сут. при одновременном повышении стабильности
7 процесса и снижении содержания каротиноидов, что существенно упрощает процедуры выделения бактериородопсина и его очистки.
Практическая значимость.
На основе проведенных исследований, выявленных воздействий и закономерностей разработаны новые методы культивирования микроорганизмов с контролированием факторов окислительного стресса. Предложена система культивирования, названная «солнечным» биореактором, в которой среда освещается одновременно светом видимого и мягкого ультрафиолетового УФА, УФБ диапазонов (имитируется действие излучения солнца на поверхности земли) или подвергается воздействию относительно малых доз пероксида водорода и видимого света.
Для управления ферментационными процессами разработаны программное обеспечение «BioDrome 1.0», автоматизированный комплекс, и метод непрерывного контроля уровня накопления биомассы и бактериородопсина в клетках галобактерий (по цветовым оттенкам ферментационной среды). Возможности комплекса позволяют регистрировать и регулировать параметры ферментации, работать в различных режимах культивирования с обратной связью по показаниям датчиков, а также следить за процессом в режиме удаленного доступа. Отдельные элементы комплекса и разработанное программное обеспечение используются в учебном процессе в РХТУ им. Д.И. Менделеева (каф. биотехнологии, каф. процессов и аппаратов), а также в научных исследованиях на стендах ГУП НПО «Астрофизика», ВНИИ Молочной промышленности.
Вариант метода культивирования с использованием одновременного воздействия пероксида водорода и видимого света, предложен для улучшения показателей (жизнеспособности, бродильной активности) дрожжевой засевной культуры при получении спирта из зерносырья. Предложенное решение вошло в план перспективных мероприятий Серебряно-Прудского биохимического завода (Московская обл.).
Согласно предварительной технико-экономической оценке реализация предложенных решений на базе разработанного автоматизированного комплекса и предложенных методов культивирования галобактерий при промышленном получении бактериородопсина (в составе пурпурных мембран) позволит снизить стоимость его с 500-5000 руб. за 1 мг (в зависимости от чистоты продукта) до 20-100 руб. за 1 мг.
