Введение к работе
Актуальность темы. Моноклональные антитела (мАт) благодаря их селективности и чувствительности являются чрезвычайно важным инструментом при исследовании структурно-функциональных особенностей белков. В фундаментальных исследованиях мАт используются для идентификации и локализации белков, для дифференциации клеток различных типов, для очистки белка или для исследования экспрессии белков. Эпитопное картирование - определение областей на поверхности белковой глобулы, к которым специфичны различные мАт - является важным шагом для характеристики взаимодействия антиген-антитело. Картирование важно для определения специфичности антител, для предсказания перекрестной реактивности, при разработке вакцин и дизайне лекарственных средств, для понимания фундаментальных аспектов белок-белковых взаимодействий.
Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, КФ 3.4.15.1) - Zn-зависимая пептидил-дипептидаза, состоящая из двух доменов (N- и С-) в составе одной полипептидной цепи, является одним из главных регуляторов кровяного давления, вовлечен в метаболизм нейропептидов, иммунную и репродуктивную функции. В связи с этим новое знание свойств и особенностей этого фермента может иметь терапевтическое будущее.
Показано, что в крови людей содержатся в низких концентрациях аутоантитела практически ко всем группам эндогенных антигенов. При развитии таких патологий, как системный склероз, красная волчанка, в крови увеличивается уровень аутоантител к АПФ [Станислав и др., 2001; Balyasnikova et al., 2002]. Таким образом, данные антитела могут служить индикатором развития патологии. Поэтому картирование эпитопов мАт, специфичных к разным областям на поверхности молекулы фермента, возможно, даст шанс понять развитие данных заболеваний на молекулярном уровне, а также применить полученные знания для диагностики этих патологий.
Ранее была получена панель из 8 мАт к N-домену АПФ и идентифицированы их эпитопы связывания на поверхности белка. Работы по эпитопному картированию N-домена продемонстрировали важный исследовательский, диагностический и даже терапевтический потенциал данных антител: мАт были успешно использованы для количественного определения АПФ в растворе методом ELISA и на поверхности клеток жидкостной цитометрией [Danilov et al., 2003], для исследования структуры и функций АПФ [Skirgello et al., 2006; Balyasnikova et al., 2007], для доставки ферментов к легочному эндотелию, как метод диагностики легочно-сосудистых заболеваний [Danilov et al., 1989]. С помощью иммунопреципитации клеток мАт ВВ9 к N-домену АПФ было показано, что АПФ экспрессируется гематопоэтическими клетками на всех стадиях гематопоэза [Ramshaw et al., 2001 ]. Таким образом, возможно, АПФ участвует в физиологической регуляции гематопоэза.
В то же время С-домен АПФ остается практически не изученным с иммунохимической точки зрения.
Целью работы явилось эпитопное картирование С-домена АПФ с помощью панели из 8 мАт, специфичных к С-домену фермента; определение областей на поверхности С-домена, пространственно сближенных с N-доменом, и построение на основе этих данных модели двудоменного АПФ; иммунохимическая характеристика АПФ в норме и при развитии ряда системных заболеваний.
Научная новизна и практическая значимость. Определена конкурентность связывания панели из 8 мАт, специфичных к С-домену АПФ, с тестикулярным АПФ (тАПФ), представляющим собой С-домен, содержащий уникальную N- конце вую 36-аминокислотную последовательность. Выявлены три пары мАт, эпитопы связывания которых перекрываются друг с другом на поверхности С-домена фермента в значительной степени. На основе полученных данных построена диаграмма, показывающая конкурентный и неконкурентный характер связывания мАт с С-доменом АПФ.
Выявлены три пары мАт, которые, связываясь с АПФ человека, не связываются с АПФ шимпанзе, С-домен которого отличается от С-домена человека двумя заменами аминокислотных остатков. Проведен анализ связывания мАт с пятью химерами АПФ, одна из которых содержала N-домен и 125 аминокислотных остатков из С-домена, остальные четыре представляли собой С-домен, в котором ряд аминокислотных остатков заменен на гомологичные из N-домена, и пятью мутантами тАПФ, один из которых содержал замену Asp616Leu, остальные - замены остатков Asn некоторых потенциальных сайтов гликозилирования на остатки Gin.
На основе полученных данных предложено расположение эпитопов связывания 8 мАт на поверхности С-домена фермента.
Выявлены мАт 4ЕЗ, ингибирующие активность тестикулярного АПФ. Для ряда мАт определены константы диссоциации комплексов АПФ-мАт.
Выявлены мАт 1Е10, эпитоп связывания которых на поверхности С-домена прикрыт N-доменом в составе полноразмерного фермента. На основе конкуренции мАт, специфичных к разным доменам фермента, за связывание с соматическим АПФ (сАПФ), выявлены участки на поверхности N- и С-доменов АПФ, пространственно сближенные друг по отношению к другу в составе полноразмерного фермента.
На основе экспериментальных данных впервые предложена модель двудоменного фермента.
Анализ образцов АПФ из почек, легких и семенной жидкости MALDI-TOF спектрометрией показал, что в АПФ из почек и легких гликозилирован потенциальный сайт гликозилирования Asn685, входящий в эпитопы связывания мАт 3F11 и 2Н9, а в АПФ из семенной жидкости гликозилирован потенциальный сайт гликозилирования Asn666, располагающийся в эпитопах связывания мАт 1Е10 и 4ЕЗ.
Впервые показано различное связывание мАт с соматическим АПФ из различных тканей и биологических жидкостей: почек, легких, сыворотки и семенной жидкости. Более того, показано, что связывание некоторых мАт с АПФ плазмы крови в норме (АПФ продуцируют эндотелиальные клетки) и при развитии патологии - саркоидоза и болезни Гоше (дополнительным источником АПФ в кровь являются саркоидные гранулемы и макрофаги) - различается. Таким образом, показана возможность применения мАт для выявления АПФ, продуцируемого другими клетками (не эндотелием, как в норме) в крови, полученные данные, возможно, в будущем могут быть использованы для упрощения диагностики саркоидоза и болезни Гоше.
Мутанты и химеры АПФ были любезно предоставлены профессором Е. Sturrock из Университета Кейптауна, ЮАР; моделирование углеводной цепи, а также открытой конформации С-домена проводили в рамках совместной работы с к.ф.н., с.н.с. Упоровым И.В., плазма крови пациентов с саркоидозом и хроническим обструктивным бронхитом, а также донорская плазма были предоставлены Институтом Фтизиопульмонологии ММА им. Сеченова, плазма крови пациентов с болезнью Гоше - Медико-генетическим научным центром РАМН; статистический анализ результатов проводили в рамках совместной работы с к.ф.-м.н., доц. Яровой Е.Б. (Мех.-мат. ф-т, МГУ).
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ - 2006» (Москва, 2006); Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); VI Симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 2007); IV Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007); American Thoracic Society International Conference (Toronto, 2008); Всероссийской школе-семинаре "Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы" (Белгород, 2008); V Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009); International Conference "Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications" (Arkhangelsk, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (Главы 1-3), экспериментальной части (Глава 4), описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (Главы 5-10), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 151 страницах, содержит 4 таблицы и 51 рисунок. Список литературы включает 178 ссылок.
