Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Хитозан, структура, получение и применение хитозана в биомедицинских и ветеринарных исследованиях 10
1.1.1 Структура хитозана 10
1.1.2 Физико-химические свойства хитозана 12
1.1.3 Применение хитозанав медицине и ветеринарии 13
1.1.4 Модификация хитозана 17
1.1.5 Наночастицы на основе хитозана 20
1.2 Механизм взаимодействия хитозана с клетками 22
1.2.1 Роль заряда хитозана и наночастиц на его основе 23
1.2.2 рН органелл клетки 27
1.2.3 Внутриклеточный транспорт хитозана 33
1.3 Явление флуоресценции и его применение в биологии 40
2. Собственные исследования 47
2.1 Материалы и методы 47
2.1.1 Материалы 47
2.1.2 Лабораторное оборудование 48
2.1.3 Синтез и характеристика производных хитозана 49
2.1.4 Физико-химические методы исследования 52
2.1.5 Исследование биологической активности хитозанов in vitro 55
2.2 Результаты исследований 58
2.2.1 Изучение спектральных параметров фотоактивируемого флуорофора ТМР-NN-813 58
2.2.2 Изучение внутриклеточного транспорта флуорофора ТМР-NN-813 63
2.3 Получение и характеристика панели производных хитозана с различными
физико-химическими свойствами, несущих флуоресцентную метку 67
2.4 Анализ внутриклеточного транспорта производных хитозана 89
3. Обсуждение полученных результатов по
4. Выводы 115
5. Практическое использование полученных результатов 116
6. Рекомендации по использованию научных выводов 118
7. Список использованной литературы 119
- Физико-химические свойства хитозана
- Роль заряда хитозана и наночастиц на его основе
- Исследование биологической активности хитозанов in vitro
- Изучение внутриклеточного транспорта флуорофора ТМР-NN-813
Физико-химические свойства хитозана
Форма существования хитозана в кислых растворах активно изучается. Так, в работах Корчагиной Е.В. и Филипповой О.Е. показано спонтанное формирование комплексов [Korchagina Е., 2012; Korchagina Е., 2010], размер которых не зависит от исходной массы хитозана, при этом число индивидуальных молекул в комплексе зависит от массы исходного хитозана. Введение гидрофобных групп (n-додецил) также не оказывало влияния на размер комплексов. Аналогичные данные, показывающие спонтанное формирование агрегатов молекулярными хитозанами, были ранее получены и в нашей группе [Свирщевская Е., 2011].
Не только хитозан способен самособираться в супрамолекулярные комплексы, но и его производное с отрицательным зарядом - сукциноилхитозан, также формирует наночастицы спонтанно. Так, в растворе фруктозы с сукциноилхитозаном формировались наночастицы, которые спонтанно включали доксорубицин, противоопухолевый антибиотик [Qiu Y., 2013].
Хитозан - одно из самых известных и изученных производных хитина. Повышенный интерес к хитозану наблюдался во второй половине прошлого века в связи с возможность его применения как радиопротектора. В данное время непрерывно происходит расширение области применения этого полисахарида. Другими областями применения хитозана являются химическая технология, биотехнология, текстильная промышленность, получение медицинских и ветеринарных материалов (например, шовных нитей), пищевая промышленность, косметическая промышленность, сельское хозяйство (растениеводство и животноводство), медицина и ветеринария. Благодаря своим уникальным свойствам, хитозан нашел широкое применение в различных отраслях науки, медицины и ветеринарии. Хитозан обладает биосовместимостью, биодеградируемостью (разлагается под действием природных ферментов), бактериостатичностью (тормозит рост и размножение бактерий), иммуностимулирующей активностью, превосходной сорбционной способностью. Из-за заряда хитозан связывает вещества разной природы, например, соли тяжелых металлов, радионуклиды, ДНК, холестериновый комплекс и жиры низкой плотности, белки, пептиды и т. д. [Abram А., 2010]. В настоящее время областями применения хитозана являются медицина, ветеринария, фармацевтика, производство продуктов питания, сельское хозяйство, очистка воды, производство бумаги, косметология, хроматография и другие [Abram А., 2010].
Вследствие особенностей строения хитин и хитозан обладают волокно- и пленкообразующими свойствами. Благодаря биосовместимости с тканями человека, низкой токсичности, биодеградируемости, способности усиливать регенеративные процессы при заживлении ран, хитозан представляет огромный интерес для медицины и ветеринарии, например для получения микроносителей для систем доставки терапевтических препаратов (антибиотиков, антивирусных, противоопухолевых и антиаллергенных препаратов), также в виде пленок (мембран). Включение лекарственных средств в такие пленки создает условия для постепенного поступления активных соединений в ткани, обеспечивая эффект пролонгирования действия. Хитозан может быть использован для лечения гнойных и ожоговых ран путем включения препаратов в структуру волокон хитозана для увеличения эффективности использования терапевтических ферментов.
Одно из современных направлений в биомедицине и биотехнологии является биокапсулирование. Под биокапсулированием понимают создание различных полимерных систем в форме гидрогелевых нано- и микрочастиц, нано-и микрокапсул или полимерных пленок с включенным в них биоматериалом. Биоматериал может быть представлен различными биологически активными веществами (белками, ферментами, ДНК, пептидами, низкомолекулярными гормонами, антибиотиками и др.), а также живыми клетками [Janes К., 2001].
Наиболее удобный традиционный способ введения лекарств - пероральный - позволяет избежать связанных с инъекциями боли и риска инфицирования. Более того, лекарственные формы, предназначенные для перорального приема, дешевле парентеральных, поскольку для их приготовления не нужны стерильные условия. Кишечная стенка представляет собой основной барьер, через который терапевтические вещества могут проникать в кровоток. Небольшие молекулы, такие как аминокислоты и сахара, могут свободно преодолевать стенку кишечника за счет активного транспорта через клеточную мембрану, для крупных молекул, таких как белки, мембрана клеток практически непроницаема. Для успешного проникновения крупных молекул необходимо включить их в гидрофобные микрочастицы, которые путем эндоцитоза смогут попасть внутрь кишечной стенки.
В настоящее время известны примеры успешного использования целого ряда полимерных систем на основе хитозана для доставки через слизистые оболочки и контролируемого высвобождения биологически активных веществ при их пероральном введении. Основные требования к таким лекарственным формам: обеспечение защиты лекарственного вещества от действия протеолитических ферментов и кислой среды желудка (рН 12) и контролируемое высвобождение лекарства в нейтральной среде (рН 7,0-7,4) тонкого кишечника или прямой кишки. Например, английские ученые предложили разработку новых полимерных микрочастиц на основе комплекса гиалуроновой кислоты/хитозана для назальной доставки гентамицина, которая оказалась в 30-40 раз эффективнее, чем доставка этого антибиотика в виде раствора или сухого порошка [Ramadas М., 2000]. Испанские ученые предложили использовать хитозановые носители для доставки доксорубицина для терапии рака [Tozaki Н., 1997]. Ряд лабораторий занимается разработкой хитозановых микрокапсул с включенным в них инсулином для перорального введения этого препарата [Desai М., 1997; Desai М., 1996].
Роль заряда хитозана и наночастиц на его основе
Фотоактивируемый флуоресцентный краситель TMP-NN-813 [Belov V. et al, 2010] (любезно предоставлен Беловым В.Н., Германия) растворяли в диметилформамиде (ДМФА) в концентрации 10 мг/мл и хранили при -20С. Для работы с культурами клеток использовали конечную концентрацию 2 мкг/мл. Для фотоактивации TMP-NN-813 использовали лазер с длиной волны 405 нанометров, встроенный в конфокальный микроскоп Eclipse ТЕ2000 (Nikon); для тотальной фотоактивации использовали УФ лампу трансиллюминатора.
Конфокальный микроскоп Nicon Eclipse С1+ («Nikon», Япония); проточный цитофлуориметр Coulter XL; микроскоп Diavert; спектрофлюориметр Varian Сагу Eclipse; рН-метр WTW inoLab; шкаф холодильный Minicoldlab 2203; аналитически весы Sartorius; спектрофотометр Ultrospec II; роторный испаритель Rotavapor LG-108; установка для документирования гелей UVP BioDoc IT System; комплектная установка для сублимационной сушки Heto FD 1.0; концентратор SpeedVac Savant SVC-1 ООН с ловушкой-холодильнком Savant RT 49 100А и вакуумным насосом НВР-1,25Д; система для очистки воды MiliQRt; термошейкер BioSan MSH 3D; блок питания Elf-4 PS-400; низкотемпературный кельвинатор Sanyo UltraLow -135С; мешалка пространственная MultiBio 3D; автоклав MODEL 25Х-2; инкубатор Heraeus; ламинарный шкаф Gelaire FlowLab; планшетный ридер Labsystems Multiscan; сухожаровой шкаф Heraeus; анализатор субмикронных частиц Coulter Electronics Inc.Model N4MD; инкубатор ASSAB; микроскоп инвертированный OPTON; ламинарный бокс Flufrance; система хроматографическая Gilson; насос GILSON; ванна ультразвуковая; весы электронные Sartorius; абсорциометр; шейкер-инкубатор G24; источник тока EPS 500/400; спектрофотометр NanoVue; автоклав Sanyo MLS-24204; трансиллюминатор VB-ECX 15МУФ-спектрофотометр Shimadzu UV-1601 PC («Shimadzu», Япония); рН - метр HI 8314 («Hanna Instruments», Португалия); магнитная мешалка («IKA», Германия); центрифуга СМ50 для микропробирок («Elmi Skyline», Латвия), центрифуга Sigma 4-16 К («Sigma», США); кондуктометр Hanna Hi 8733 («Hanna Instruments», Румыния), спектрометр «Varian Е-112» («Varian», США), хроматограф жидкостной «Цвет-Яуза-01-АА» (НПО «Химавтоматика», Россия); атомно-силовой микроскоп «ИНТЕГРА Прима» («NT-MDT», Россия); проточный цитофлуориметр («Becton Diskinson FACScan», США).
Работа проведена по стандартным методикам [Никольский Б.П. и др., 1965]. Все образцы коммерческих хитозанов растворяли в 1% уксусной кислоте при интенсивном перемешивании в течение 10 часов. Раствор фильтровали через мелкопористый фильтр для удаления нерастворенного материала и примесей, после чего раствор титровали 12% NH4OH до рН=7.5. Наблюдали выпадение белого осадка. Для очистки хитозана от низкомолекулярных примесей смесь диализовали в течение четырех суток с многократной сменой воды. По окончании диализа полученную суспензию лиофильно высушивали. В результате очистки были получены хитозаны B-D.
Получение производных А2 и A3 с низкой степенью дезацетилирования из А1 Для получения производных той же молекулярной массы, но с разной степенью дезацетилирования проводили реацитилирование хитозана А1 по методу [Einbu А, 2007]. Для этого 5 г хитозана А1 растворяли в 250 мл 1% уксусной кислоты, добавляли 250 мл метанола и встряхивали 20 мин. Раствор делили на три порции. Во вторую и третью порцию добавляли 15 мл 2% уксусного ангидрида. Образцы А2 и A3 инкубировали при 42 С при встряхивании 15 и 40 мин соответственно. В конце инкубации в каждый образец добавляли 300 мл 1% аммония в метаноле для преципитации хитозана. Преципитаты отмывали многократно деионизованной водой и высушивали. СД определяли с помощью
ІН-ЯМР [Гюнтер X., 1984]. Среднюю ММ всех полученных производных определяли методом вискозиметрии [Малкин А. Я., 1979]. В результате были получены хитозаны Al, А2 и A3.
Получение (2-додецен-1-ил)сукциноил хитозана с амфифильными свойствами (2-додецен-1-ил)сукциноил хитозана получали по методу [Tikhonov V.E., 2008]. Хитозан А1, 5 г, растворяли в 150 мл 1% (v/v) водной уксусной кислоте при 50С, после чего добавляли 150 мл метанола. (2-Оос1есеп-1-у1)янтарный ангидрид (DDCA), 20 ммолей, растворяли в 50 мл метанола и добавляли к раствору хитозана. Смесь инкубировали при 50С и встряхивание 8 часов, после чего оставляли на ночь при комнатной температуре. Затем реакционную смесь выливали в 500 мл гидрокарбоната натрия для преципитации хитозана. Полученный гель интенсивно отмывали деионизованной водой и лиофильно высушивали. СД определяли с помощью ІН-ЯМР. Степень замещения составила по 9% по карбоксильным и жирнокислотным группам. В результате был получен хитозан Е (Таблица 3). Получение (2-додецен-1-ил)янтарный ангидрид сукциноилхитозана (2-додецен-1-ил)янтарный ангидрид сукциноилхитозана получали по методу [Tikhonov V.E., 2008]. Два грамма г хитозана Р2 растворяли в 5 % СН3СООН (40 мл) и смешивали со 160 мл СН3ОН. Янтарный ангидрид (0,24-14,6 моль/ аминогрупп) растворяли в минимальном объеме ацетона при интенсивном перемешивании, добавляли к раствору хитозана Е и оставляли на ночь при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляли 200 мл Н20 и доводили рН до 10, используя 2Н NaOH. В течение 5 суток вели диализ против дистиллированной воды, затем реакционную смесь концентрировали до 100 мл и лиофильно высушивали. По данным ХН-ЯМР СЗ составила 9% по жирнокислотным остаткам и 70% по карбоксильным группам. В результате получили хитозан F (Таблица 3). Получение производных хитозана, меченных флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) Рисунок 11. Синтез коньюгата хитозан-ФИТЦ Коньюгирование с ФИТЦ осуществляли по методу [Herzog F., 1973]. Для визуализации транспорта все производные хитозана коньюгировали с ФИТЦ, для чего положительно заряженные хитозаны Al, А2, A3, В, С, D, Е растворяли в 0,1% уксусной кислоте в концентрации 2 мг/мл, добавляли ФИТЦ в эквимолярных количествах, рН растворов доводили до 7 и оставляли на ночь при комнатной температуре.
Исследование биологической активности хитозанов in vitro
Как ТМР, так и TMP-NN-813 являются гидрофобными молекулами, нерастворимыми в воде. Сток-раствор получали в диметил формами де (ДМФА). Для определения способа попадания в клетки провели сравнение эффективности входа в клетки MDCK при 37С и на холоду, для чего культуру переносили на лед за 15 минут до эксперимента. Окрашивание наблюдали в обоих случаях, при этом можно было наблюдать за изменениями в состоянии клеток, находящихся в «холодовом стрессе» (Рисунок 19).
Несмотря на его гидрофоб часть красителя находилась в цитоплазме. Соответственно, TMP-NN-813 можно использовать для окрашивания митохондрий при короткой инкубации и цитоплазмы - при длительной инкубации, что часто может быть полезным.
Для определения мишени связывания внутри клеток использовали коммерческие трекеры органелл. Показали, что TMP-NN-813 окрашивает не только митохондрии, но и проходит в цитоплазму и ядро (Рисунок 20). Рисунок 19. Клетки MDCK через 5 (А и Г), 20 (Б и Д) и 60 (В и Г) минут инкубации с TMP-NN-813 при 37С (А-В) или при 4оС (Г-Е).
Ко-локализации с эндоплазматическим ретикулумом, лизосомами или аппаратом Гольджи не наблюдали. Использование трекера восстановленного кардиолипина в митохондриях N-акридинового оранжевого (NAO) показало, что TMP-NN-813 имеет другую картину распределения, похожую на коммерческий митохондриальныи трекер (Рисунок 20).
Использование фотоактивируемого красителя TMP-NN-813 для анализа жизнеспособности многоклеточных сфероидов опухолевых клеток
Для анализа возможности использования TMP-NN-813 для визуализации митохондрий в объемных культурах клеток были приготовлены сфероиды из клеток MDCK, НаСаТ и А431. Сфероиды инкубировали на антиадгезивной пленке PolyHEMA в тех же условиях, что и 2 D культуры. На рисунке 21 представлен Z-срез сфероида культуры клеток MDCK, окрашенный TMP-NN-813.
Наличие широкого диапазона концентраций, в котором можно использовать TMP-NN-813, позволяет визуализировать детали. Данный результат может быть полезен при изучении процесса роста сфероидов эпителиальных клеток, для которых показано наличие некротического центра и растущего внешнего слоя.
Использование фотоактивируемого красителя TMP-NN-813 для анализа апоптоза Краситель NAO используется для анализа апоптоза, при котором в митохондриях клеток накапливается окисленный кардиолипин, не связывающий NAO. Мы провели анализ визуализации апоптоза с помощью фотоактивируемого красителя TMP-NN-813. Апоптоз индуцировали в клетках MDCK с помощью 7% этанола [Луценко Г.В., 2012]. Окрашивание проводили в течение 15 минут с целью визуализировать митохондрии. Результаты исследования показали, что TMP-NN-813 окрашивает два вида митохондрий: ярко окрашены апоптотические митохондрии, которые также визуализируются с помощью NAO (Рисунок 22, белые овалы). Вторая группа митохондрий имеет типичный для данного типа линии вид удлиненных трубочек, которые не регистрируются NAO (Рисунок 22, отмечено стрелками), но визуализируются TMP-NN-813 (отмечено стрелками).
Полученные данные показали, что фотоактивируемый краситель TMP-NN-813 может использоваться для анализа состояния митохондрий в нормальных и апоптотических клетках. Его также можно использовать для анализа состояния митохондрий в культуре многоклеточных сфероидов. Краситель устойчив к выгоранию, позволяет получить высококонтрастное изображение, работает в широком диапазоне концентраций. Использование фотоактивируемого красителя позволяет увеличить число каналов регистрации при анализе методом конфокальной микроскопии.
Для понимания как происходит переход производных хитозана через мембраны клеток и какими свойствами должна обладать производная, оптимальная для доставки лекарства в клетки, мы получили 8 производных хитозана с различными физико-химическими свойствами, сгруппированные по свойствам в таблице 4. Таблица 4 - Исходные характеристики хитозанов
СД является одним из основных параметров хитозана и его производных. Значения СД влияют на такие свойства хитозана, как растворимость в водно-кислых средах, набухание в воде, способность к биодеградации, и определяют характер биологической активности хитозана. Все коммерческие препараты хитозанов имели высокую СД.
Производные хитозана с различной степенью дезацетилирования получены методом реацетилирования из исходного хитозана А1 с СД 89% по данным производителя. Реацетилирование проводили в мягких условиях, исключающих гидролиз хитозана, который может вести к изменению молекулярной массы. СД определяли методом кондуктометрического титрования и ядерным магнитным резонансом (ЯМР). Спектры ЯМР хитозанов А1-АЗ приведены на рисунке 23.
Увеличение пика ацетильной группы (пик 2) означает, что реацетилирование прошло эффективно. Расчет степени ацетилирования проведен по соотношениям пиков, соответствующих водородным и ацетильным группам. По данным ЯМР степень дезацетилирования для А1-АЗ составили 87, 50 и 40% соответственно (таблица 5).
Метод FFF является одним из наиболее универсальных подходов, позволяющих разделить молекулы и частицы различной природы, в том числе биополимеры (белки, нуклеиновые кислоты и полисахариды) и частицы биологического происхождения (вирусы, вирусоподобные частицы, липосомы и т.д.) с молекулярной массой 103-1015 г/моль и диаметром от 1 нм до 100 мкм. Он объединяет в себе группу методов, основанных на разделении наночастиц и макромолекул, находящихся в потоке жидкости под действием перпендикулярно действующих внешних физических сил, природа которых может быть различной (седиментационное или термическое поле, противодействующий поток и др.). К преимуществам данного метода можно отнести широкий диапазон размеров и молекулярных масс разделяемых образцов, мягкие условия разделения (отсутствие неподвижной фазы, высокого давления), отсутствие необходимости предварительной очистки пробы (диализ, фильтрование и т.д.), возможность использования различных растворителей, высокая точность разделения и детекции. Для анализа разделенных методом FFF популяций используются различные типы детекторов таких, как ультрафиолетовый, рефрактометрический, детектор мультиуглового светорассеяния (MALS), а также их сочетания. Сочетание фракционирования с MALS-детектором и рефрактометрическим детектором -очень удачный инструмент для определения молекулярной массы (Mw), молекулярно-массового распределения (MD) и радиуса инерции молекул и частиц в разделяемых образцах. В связи с этим данный метод находит широкое применение для анализа различных полимерных систем, в том числе для характеристики природных полисахаридов (амилоза, амилопектин, пуллулан, декстран, альгинат и т.п.).
Данные распределения хитозанов А1-АЗ по фракциям в ассиметрическом потоке приведены на рисунках 25-27. На рисунках А показано распределение фракций хитозана по времени выхода из капилляра, оцениваемое по рефракции света (синия линия) и методом статического светорассеяния (красная линия). Сдвиг данных осуществляется из-за особенностей метода динамического светорассеяния, при котором больший вклад вносят более крупные объекты. Рисунки Б показывают распределение по молекулярной массе хитозанов А1-АЗ в разных фракциях, что подсчитывается по формуле Дебая пакетом программного обеспечения, встроенного в систему FFF.
Численный анализ ММ первой фракции фитозанов А1-АЗ приведен в трех вариантах: n, w и z, что соответствует числовой, весовой и объемной массе молекул. Чаще всего принимают за массу w-average, что соответствует весовой массе, оценивающей вклад крупных объектов. Данные по n, w и z ММ хитозанов А1-АЗ приведены в таблице 6, куда также включили данные по определению ММ методом вискозиметрии. Суммарные данные по зависимости ММ от СД представлены также на рисунке 28.
Изучение внутриклеточного транспорта флуорофора ТМР-NN-813
Системы доставки лекарств предназначены для переноса терапевтического агента в больной орган или пораженную ткань. Обычно под системой доставки лекарств понимают носители из небелковых (липидных, углеводных, искусственных полимеров) молекул, упакованных в липосомы (липиды) или наночастицы. Такие системы доставки активно разрабатываются для терапии рака, эндокринных и аутоиммунных заболеваний. Несмотря на 20-летниюю историю разработки таких систем, успехи науки весьма скромны. Стадии клинического использования достигло меньше десятка систем доставки, большинство из которых - липосомы. Практически все носители лекарств, предназначенных для лечения системных заболеваний, вводятся внутривенно. После такого введения носитель попадает в кровь и разносится по организму. Для того, чтобы попасть в нужный орган, требуется как-то оптимизировать движение носителя. Данную проблему пытаются решить с помощью целевой доставки, под которой подразумевается коньюгация с системой доставки молекул, связывающих рецептор на клетках пораженного органа или ткани. Все взаимодействия такого рода осуществляются только на близком расстоянии (микроны) между рецептором и лигандом. Для сближения на такое расстояние система доставки должны преодолеть эндотелий сосудов, затем пройти слой межклеточного матрикса, подлежащего под сосудами, и только после этого она попадет в контакт с клетками органа или ткани. Многочисленные системы целевой доставки, хорошо работающие в руках экспериментатора, оказываются бесполезными в клинике [см. обзор Bae YH. et al, 2011]. Разработка каждой отдельной системы стоит значительных денег. Учитывая бесконечное разнообразие биоорганических молекул, создавать все новые и новые системы не имеет смысла, если не разобраться в причинах отсутствия эффективности как целевой доставки, так и систем доставки вообще. Работы по биораспределению частиц в организме экспериментальных животных (мышей, крыс) показывают, что 70-90% всех систем доставки оседает в печени [JHirsjarvi S., 2013; Не С, 2010]. Даже при доставке оставшихся 10-30% наночастиц в нужный орган все же возможно улучшить терапевтический эффект лекарства за счет повышения его локальной концентрации, защиты от ферментов крови, возможности доставлять комбинацию препаратов и др. Однако и эта проблема остается нерешенной. Многие из разрабатываемых систем доставки обладают собственной токсичностью, другая значительная часть не попадает в нужное место, например, в опухоль из-за слишком большого размера. Множеством экспериментов было показано, что в опухоль проходят частицы малых размеров; граница размера определяется размером пор растущих сосудов опухоли. Чаще всего лучшие результаты получают с носителями менее 100 нм [Md S., 2014; Owens D. Е., 2006]. Однако продолжаются работы по созданию и более крупных систем для терапии опухолей. Следующей нерешенной проблемой является необходимость системы доставки пройти межклеточный матрикс. Даже после того, как система попала в контакт с клеткой-мишенью возможны трудности в попадания такой системы внутрь клетки.
Данная работа была выполнена в рамках проекта 7-ой рамочной программы Евросоюза SaveMe, который разрабатывает систему доставки для терапии рака поджелудочной железы. Одной из задач являлся подбор оптимального носителя для создания наночастиц на его основе как одной из альтернатив систем доставки противоопухолевых лекарств. Хитозан является одним из наиболее перспективных полимеров для разработки систем доставки [Hoemann С. D., 2013; Yue Z., 2011; Zaki N.M., 2011; Chiu Y., 2010; Ayala V., 2013; Nam H. Y., 2009; Draget K. I., 1996]. Хитозан получают из панцирей ракообразных, что делает его доступным для получения в широких масштабах. Хитозан нетоксичен, разлагается ферментами до безвредных и полностью ассимилируемых молекул. Самое большее преимущество хитозана в том, что его молекула содержит много реакционных групп, в отличие от большинства других полимеров, например, полиэтиленгликоля, полимолочной и полигликолевой кислот и др. Наличие многочисленных реакционноспособных групп, однако, является определенной проблемой. Хитозан взаимодействует не только с молекулами воды, формируя гидратную оболочку, но и с соседними молекулами хитозана за счет гидрофобных и ванн-дер-ваальсовых сил. При получении хитозана из хитина используется гидролиз, в результате которого получают хитозан с широкой полидисперсностью, разной молекулярной массой и разной степенью дезацетилирования. Нет простых методов стандартизации хитозана, что и является основной проблемой при продвижении хитозана в клинику. Имеющиеся методы часто дают различие в результатах. В нашей работе мы столкнулись с различиями данных по степени дезацетилирования, полученных методом ядерного магнитного резонанса и кондуктометрического титрования, различиями в определении ММ разными методами, а также неопределенностью параметров хитозана при анализе методами светорассеяния. Физико-химические свойства даже переосажденных хитозанов также не удавалось стандартизовать. Так, хитозан С давал значительную фракцию крупных частиц, которая не исчезла при повторной очистке. Огромная вариация в результатах, получаемых разными группами, частично связана с этим. На этапе анализа литературных данных стало понятно, что, прежде чем разрабатывать системы доставки на основе хитозана, надо разобраться с методами его анализа.
