Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1. Общая характеристика карбоксилаз 14
1.2. Эндоэргические реакции карбоксилирования, катализируемые карбоксилазами первого типа 17
1.2.1. Структура и механизм действия карбамоилфосфатсинтетаз 18
1.3. Экзоэргическое карбоксилирование 22
1.3.1. Структура и механизм действия рибулозобисфосфат- карбоксилаз/оксигеназ 22
1.4. Общая характеристика биосинтеза пуриновых нуклеотидов de novo и АИР-карбоксилаз, участвующих в этом биосинтезе 29
1.4.1. Явление С02-стимуляции ..32
1.5. Химический синтез субстратов АИР-карбоксилазы и их аналогов 34
1.6. Изучение обратимой реакции неферментативного карбоксилирования ..37
1.7. Сравнительная характеристика АИР-карбоксилаз бактерий, грибов и высших эукариот 41
1.7.1. Ферменты бактерий 42
1.7.2. Ферменты архебактерий 46
1.7.3. Ферменты грибов 47
1.7.4. Ферменты высших эукариот 49
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53
2.1. Приборы 53
2.2. Реактивы 53
2.3. Методы исследования 55
2.3.1. Спектрофотометрические методы 55
2.3.2. Использование спектроскопии ЯМР !Н для изучения реакции
обратимого превращения АИР -> КАИР 59
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 61
3.1. Химический синтез субстратов АИР-карбоксилазы 61
3.2. Характеристика АИР-карбоксилазы дрожжей Saccharomyces
cerevisiae и САИКАР-синтетазы-АИР-карбоксилазы человека 64
3.3. Изучение кинетики неферментативного декарбоксилирования 5-амино-4 карбоксиимидазолриботида и 5-амино-4-карбокси-1- метилимидазола с помощью УФ- и 'Н-ЯМР-спектроскопии 67
3.4. Изучение кинетики неферментативного карбоксилирования 5-амино-имидазолриботида и аминометилимидазола с помощью УФ-спектроскопии...71
3.5. Изучение кинетики ферментативного декарбоксилирования 5-амино-4 карбоксиимидазолриботида с помощью УФ- и ЯМР 'Н-спектроскопии 75
3.6. Изучение кинетики ферментативного карбоксилирования 5-аминоимидазолриботида с помощью УФ- и ЯМР 'Н-спектроскопии 77
3.7. Исследование мутантных и модифицированных форм АИР-карбоксилазы дрожжей 87
3.8. Эволюция фермента АИР-карбоксилазы 88
ВЫВОДЫ ...92
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 93
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 104
Введение к работе
Актуальность проблемы. Фиксация СОг клетками живых организмов осуществляется в результате реакций карбоксилирования, катализируемых ферментами двух типов. К первому типу относят карбоксилазы, катализирующие эндоэргические реакции, которые требуют энергии макроэргических соединений. Карбоксилазы второго типа ускоряют экзоэргические реакции, которые не требуют макроэргов.
К ферментам второго типа относится самый избыточный белок на Земле, D-рибулозо-І, 5-бисфосфат-карбоксилаза/оксигеназа, содержание которого в хлоропластах достигает 15-50 % от общего количества белка этих клеточных органелл [1]. Изучение механизмов ферментативных реакций карбоксилирования является фундаментальным направлением, которое, благодаря использованию генно-инженерных и биотехнологических подходов для получения микробиологических продуцентов карбоксилаз, получило, по существу, второе дыхание. Указанные подходы оказались особенно плодотворными при изучении карбоксилаз, присутствующих в клетках в низких концентрациях. Именно к таким ферментам относится АИР-карбоксилаза, катализирующая одну из промежуточных реакций [превращение 5-аминоимидазолриботида (АИР) в 5-амино-4-карбоксиимидазолриботид (КАИР)] в цепи биосинтеза пуриновых ну-клеотидов, которая протекает в клетках всех живых организмов, включая человека [2, 3].
Особый интерес к этому ферменту обусловлен тем, что охарактеризованные к настоящему времени АИР-карбоксилазы двух микроорганизмов и фермент курицы по механизму действия относятся к двум разным типам карбоксилаз. К первому типу относятся ферменты бактерии Escherichia coli и патогенных грибов Cryptococcus neoformans. Бактериальный фермент состоит из двух отдельных белковых цепей - К и Ei [4]. У грибов он представляет собой одну .белковую цепь, состоящую из двух доменов - К и Ei [5]. Фермент К (а в случае грибов домен К) в присутствии АТФ, катионов Mg и бикарбонат-аниона осуществляет N-карбоксилирование АИР с образованием промежуточного продукта реакции - карбамата (N-КАИР); фермент Ei (у грибов домен Ei) ускоряет перегруппировку карбамата в КАИР. У высших эукариот изучена АИР-карбоксилаза курицы, которая относится ко второму типу карбоксилаз. Этот фермент не содержит домена К и имеет домен Е2 (гомологичный домену Е! микроорганизмов), катализирующий прямое карбоксилирование АИР молекулой СОг [6]. Причем в этом случае N-КАИР не является субстратом фермента.
Наличие белка К или домена К у микроорганизмов создает предпосылки для целенаправленного поиска ингибиторов первой стадии ферментативной реакции, отсутствующей у высших организмов. Такие ингибиторы представляют несомненный интерес для фармакологии и медицины в качестве потенциальных лекарственных препаратов, подавляющих размножение патогенных микроорганизмов. Существенно отметить, что среди аналогов КАИР обнаружены соединения, обладающие противоопухолевой и антифунгицидной активностями [7]. Показано, что активность АИР-карбоксилазы увеличена у больных лейкозом. Однако в литературе отсутствуют данные о механизме действия АИР-карбоксилазы человека и пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae - одного из наиболее изученных эукариотических микроорганизмов, обычно используемого в качестве модельного объекта для выявления и изучения веществ, обладающих антифунгицидными свойствами.
В связи с этим цель нашей работы заключалась в исследовании свойств ферментов, выделенных из эритроцитов человека и штамма-продуцента АИР-карбоксилазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и выявлении отличий в их структуре и механизме действия.
В задачи исследования входило: синтезировать субстраты, необходимые для исследования ферментов получить препараты АИР-карбоксилазы дрожжей S. cerevisiae и человека
3) исследовать каталитические свойства ферментов дрожжей и человека в реак ции превращения N-КАИР—» КАИР изучить ферментативную реакцию карбоксилирования АИР, катализируемую дрожжевой АИР-карбоксилазой в присутствии АТФ, катионов Mg и бикарбонат-аниона исследовать модифицированные формы дрожжевой АИР-карбоксилазы, полученные методами генетической инженерии.
Полученные данные позволили нам представить следующие положения и результаты, выносимые на защиту: установлен двухстадийный механизм действия АИР-карбоксилазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и показано, что Е-домен фермента ускоряет обратимую перегруппировку N-КАИР —> КАИР показано, что ферменты дрожжей и человека по механизму действия относятся к разным классам карбоксилаз; различия в организации и механизме действия АИР-карбоксилаз микроорганизмов и человека открывают перспективу для поиска лекарственных препаратов - ингибиторов первой стадии ферментативной реакции у патогенных микроорганизмов.
Научная новизна. 1) впервые установлено, что самопроизвольное N-карбоксилирование АИР протекает более эффективно в водных растворах С02, чем в водных растворах бикарбоната калия; этот эффект позволяет объяснить явление роста при повышенной концентрации СОг в атмосфере культивирования «С02-стимулируемых» мутантов дрожжей, несущих мутации в гене, кодирующем АИР-карбоксилазу
2) показано, что АИР-карбоксилаза дрожжей S. cerevisiae использует в качестве субстрата (карбоксиамино)-имидазолриботид и осуществляет катализ реакции карбоксилирования 5-аминоимидазолриботида по первому типу; фермент из эритроцитов, напротив, не использует в качестве субстрата N-КАИР и относится ко второму классу карбоксилаз
3) замена 4USer -> Leu в домене Ei дрожжевой АИР-карбоксилазы приводит к инактивации декарбоксилазной активности фермента, что подтверждает участие этого домена в катализе обратимой реакции превращения N-КАИР—>
Т 5) в современных базах данных иденифицировано более 100 гомологов АИР-карбоксилазы, которые по доменной организации можно разделить на 5 классов
Практическая ценность. Наличие белка К или домена К у микроорганизмов создает предпосылки для целенаправленного поиска ингибиторов первой стадии ферментативной реакции, отсутствующей у высших организмов и человека. Такие ингибиторы представляют несомненный интерес для фармакологии и медицины в качестве препаратов, подавляющих размножение патогенных микроорганизмов, например, таких как патогенные грибы С. neoformans, поражающие центральную нервную систему людей, больных вирусом приобретенного иммунодефицита [8].
Изученная нами реакция карбоксилирования, катализируемая дрожжевым ферментом, чрезвычайно чувствительна к бикарбонат-аниону, поэтому АИР-карбоксилаза дрожжей может быть использована для создания селективных сенсоров, позволяющих тестировать следовые количества указанного аниона.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 работ (из них три статьи). Основные результаты были представлены и обсуждены на XIX международной конференции «Yeast Genetics and Molecular Biology» (Рим, Италия, 25-30 мая 1999 г), на Второй международной конференции «Актуальные тенденции в органическом синтезе на пороге новой эры» (Санкт-Петербург, 28-30 июня 1999 г), на международной конференции «Modern problems of radiobiology, radioecology and evolution» (6-9 сентября 2000 г).
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на
114 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 рисунками и 13 таблицами. Список литературы содержит 94 библиографических источника.
Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ.
Общая характеристика карбоксилаз
Фиксация диоксида углерода в процессе карбоксилирования является одной из важных реакций, протекающих на Земле. Живые организмы способны усваивать как газообразный атмосферный С02, так и его растворимые в воде формы. При нормальном атмосферном давлении и температуре 25 С в 1 мл воды растворено 0,028 мл С02 (11,2 мкмоль). «Общая концентрация» всех форм растворенного в воде углекислого газа с увеличением рН возрастает, в то же время концентрация С02 и Н2С03 не изменяется (табл. 1.1 на стр. 15). Существенно отметить, что при физиологических значениях (рН 7), преобладают две формы - С02 (11,2 мкМ) и НСОз" (50,1 мкМ), концентрация которых на не-сколько порядков выше концентрации Н2СОз и СОз ". Для ускорения обратимой реакции С02 + Н20 -» НС03" + Н+ живые организмы используют фермент кар-боангидразу [1]. В клетки, ткани и органы транспортируются как диоксид углерода в молекулярной форме, так и бикарбонат-анион, которые и являются субстратами для различных карбоксилаз.
Все реакции ферментативного карбоксилирования можно разделить на два типа (табл. 1.2 на стр. 16). К первому типу относят эндоэргические реакции, которые требуют энергии макроэргических соединений, и катализируются АТФ/ГТФ-, НАДН/НАДФН-, цитохром- и ферредоксин-зависимыми ферментами. К реакциям второго типа относят экзоэргические реакции, которые не требуют макроэргов [1].
Реактивы
В работе использовали: D, L-дитиотриэтол, трис, MgCl2-6H20, НАДН, L-лактатдегидрогеназу («Sigma», США), фосфоенолпируват («Fluka», Германия), пируваткиназу, АТФ («Rcanal», Венгрия). Все остальные реактивы отечественного производства.
КАИР и АИР, а также аминокарбоксиметилимидазол (МеКАИ) и амино-метилимидазол (МеАИ) синтезировали по описанным методикам [44, 82]. В работе использовали насыщенный водный раствор С02 (70 мМ при 4 С) [5] и свежеприготовленные растворы КНСОз.
Буферные растворы: 92 мМ КН2Р04/8 мМ К2НР04, рН 5,8 - 0,1 М фосфатный буфер (ФБ, рН 5,8); 95 мМ К2НРО4/5 мМ КН2Р04, рН 8,0 - 0,1 М фосфатный буфер (ФБ, рН 8,0); 92 мМ КН2Р04/8 мМ К2НР04, pD 6,2 - 0,1 М фосфатный буфер (ФБ, pD 6,2); 95 мМ К2НР04/5 мМ КН2Р04, pD 8,4 - ОД М фосфатный буфер (ФБ, pD 8,4). Два последних буферных раствора были приготовлены растворением соответствующих навесок солей в D20, содержащей 1 % Н20; 90 мМ AcONa/ЮмМ АсОН, рН 5,6 - ацетатный буфер.
В работе использовались 0,06 М (Б1), 0,27 М (Б2) и 0,5 М (БЗ) трис-фосфатные буферные растворы с рН 8,0, а так же 0,1 М трис-хлоридный буферный раствор с рН 8,0.
Препарат АИР-карбоксилазы получен из дрожжевого штамма-продуцента, любезно предоставленного К.В. Останиным. Штамм выращивали в условиях, согласно [83]. Получали грубые клеточные экстракты и осуществляли очистку фермента по описанной методике [84]. Удельная активность препарата АИР-карбоксилазы дрожжей составила 2 ед. на 1 мг белка (за одну единицу активности фермента принимали такое его количество, которое осуществляет де-карбоксилирование 1 мкм КАИР за 1 мин при 37 С). Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда [85]. Белок хранили в виде суспензии в 40 %-ном растворе сульфата аммония. Непосредственно перед употреблением фермент отделяли центрифугированием, растворяли в 0,06 М трис-фосфатном буферном растворе и использовали в кинетических экспериментах.
Химический синтез субстратов АИР-карбоксилазы
Анализ литературных данных показал, что наиболее удобно синтезировать АИР, N-КАИР и КАИР исходя из коммерчески доступного 5-амино-4-карбоксамидимидазолибозида. Схема синтеза субстратов АИР-карбоксилазы представлена на рис. 1.13 (см. раздел 1.5).
АИКАРз фосфорилировали хлороксидом фосфора в триэтилфосфате. Образовавшиеся дихлоридаты гидролизовали при рН 2,0 и 0 С. Полученный АИКАР очищали перекристаллизацией. Выход кристаллического препарата составил 75 %.
Щелочным гидролизом АИКАР превращали в КАИР, который был выделен в виде натриевой соли с выходом 85 %. Мягким кислотным гидролизом КАИР превращали в АИР с количественным выходом по спектрофотометри-ческим данным и данным спектроскопии ЯМР ]Н. Растворы аминоимидазола сразу же после синтеза замораживали и хранили при -70 С.
N-КАИР получали, инкубируя АИР в растворе бикарбоната при 37С в течение 15 мин. Из-за его нестабильности синтез проводили без выделения, непосредственно перед использованием.
АИР, N-КАИР и КАИР имеют характерные сигналы гетероциклических и 1 -протонов (а для модельных соединений сигналы СН3-групп), которые хорошо разрешаются (табл. 3.1). Это позволяет использовать спектроскопию ЯМР Н для изучения кинетики реакций.
