Введение к работе
Актуальность темы
Специфичная пост-транскрипционная деградация мРНК, происходящая при РНКи, представляет собой новый многообещающий подход для направленного ингибирования экспрессии генов в клеточных культурах и т vivo. Эффекторами этого процесса являются дуплексы миРНК длиной около 21-26 п н , которые непосредственно отвечают за специфичный распад целевой мРНК. Метод РНКи считается весьма перспективным в качестве новой технологии функциональной геномики, а миРНК - потенциальными терапевтическими агентами при лечении болезней генетической этиологии [Sioud М., 2004; Sontheimer Е. J., 2005; Gil-more I.R, 2006]. Однако из-за большого молекулярного веса (~ 13 кДа) и полианионной структуры (~ 40 отрицательно заряженных фосфатных групп) свободные миРНК не проникают через клеточную мембрану, что является главным препятствием широкого применения РНКи т vivo. В связи с этим разработка систем направленного транспорта и доставки внутрь клеток-мишеней миРНК приобретает особую актуальность в современной медицине [Akhtar S , 2007; Pirollo К. Z, 2008]
В настоящей работе при выборе объекта исследования (культуры клеток-мишеней) основным доводом была возможность решить одну из первостепенных проблем нейрофар-макологии - создание систем, способных осуществлять специфический направленный транспорт лекарственных средств из системного кровотока к клеткам центральной и периферической нервных систем [Pardndge W. М., 2004].
Поскольку ОБМ является главным структурным компонентом мембраны миелинобра-зующих клеток, этот белок рассматривают в качестве ведущего маркера состояний, сопровождающихся нарушением целостности миелиновой оболочки [Чехонин В П., 2000, Laraers К. J., 1998], таких как острый демиелинизирующий процесс, рассеянный склероз, травматические повреждения головного мозга, опухолевые процессы в ЦНС, затрагивающие ее гли-альный компонент [Чехонин В. П., 2007].
Для диагностики и регуляции демиелинизации или детектирования патологического процесса можно использовать транспортные системы, специфически направленные к миели-нобразующим клеткам, в частности, к шванновским клеткам.
В настоящее время одним из наиболее популярных и эффективных методов контролируемого направленного транспорта миРНК и других биологически активных веществ к местам их специфического действия является использование липосом, или липидных везикулярных систем. Важным достоинством таких транспортных средств является возможность продления их срока жизни в кровотоке посредством введения в состав липосомных мембран конъюгатов липидов с полизтиленгликолем, т е. ПЭГилирование липосом, в результате чего происходит значительное замедление системной элиминации таких стерически стабилизированных липосом ("stealth" - липосом) [Lasic D. D., 1995].
Специфичность липосомальных транспортных систем обусловливается наличием в их структуре векторных молекул (МАТ к антигенам клеток-мишеней или белка-лиганда). Вектор является своего рода «троянским конем» [Pardndge W М., 2006] - он взаимодействует с клеточными мишенями (белковыми и иными антигенами, рецепторами, липопротеидными комплексами и т.п), что может приводить к поглощению содержимого липосомы клеткой В частности, для селективного векторного транспорта к миелинобразующим клеткам оптимальной мишенью представляется ОБМ.
Все это дает иммунолипосомальному транспорту миРНК неоценимые преимущества по сравнению с другими системами доставки нуклеиновых кислот в шванновские клетки-мишени В свете вышеизложенного актуальность выбранной темы исследования определяется крайней необходимостью в создании иммунолипосомальных систем селективной доставки миРНК, способных подавлять синтез целевого белка в шванновских клетках
Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии МИТХТ в рамках госбюджетной темы № 1Б-5-356 "Исследования липидов, нуклеозидов,
пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные патологии)", а также по проекту № 3243 аналитической ведомственной программы Рособразо-вания "Развитие научного потенциала высшей школы, 2006-2008".
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось создание ПЭГилированных иммунолипосомальных систем, способных специфически связываться со шванновскими клетками и осуществлять доставку внутрь клеток миРНК, блокирующих синтез целевого белка.
В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие основные задачи:
Разработка способа получения ПЭГилированных липосом;
Разработка способа загрузки миРНК в синтезированные липосомы;
Подбор и тестирование иммунохимического вектора для конструирования транспортной системы;
Конъюгация полученных липосом с моноклональными антителами;
Исследование специфичности полученных иммунолипосомальных транспортных систем на фиксированной и нативной культурах клеток in vitro,
Оценка эффективности доставки миРНК внутрь клеток-мишеней
Научная новизна
В ходе данной работы впервые была разработана иммунолипосомальная транспортная система, способная специфически связываться со шванновскими клетками. Важно отметить, что специфическое взаимодействие ПЭГилированных иммунолипосом, векторно ориентированных анти-ОБМ-антителами, с ОБМ клеток-мишеней происходило как в условиях фиксации культуры, так и с нативными шванновскими клетками. Впервые была разработана и охарактеризована иммунолипосомальная система доставки миРНК, подавляющих синтез ОБМ в шванновских клетках. Для определения эффективности доставки миРНК в клетки-мишени впервые был разработан сэндвич-вариант твердофазного иммуноферментного анализа ОБМ в лизатах шванновских клеток.
Практическая значимость
Результаты настоящей исследовательской работы демонстрируют высокую специфичность сконструированных иммунолипосомальных контейнеров к ОБМ, презентирован-ному на шванновских клетках Это говорит о том, что разработанные ПЭГилированные им-мунолипосомы в перспективе могут найти применение в качестве препарата для диагностики заболеваний, сопровождающихся нарушением миелинизации.
В ходе работы показано, что полученные иммунолипосомальные контейнеры способны селективно доставлять миРНК в нефиксированную культуру клеток, что в будущем может быть использовано при разработке терапевтических препаратов для лечения заболеваний различной генетической этиологии.
С помощью разработанного нами сэндвич-варианта иммуноферментного анализа ОБМ в биологических жидкостях (лизаты шванновских клеток) был подтвержден факт внутриклеточной доставки миРНК посредством ПЭГилированных иммунолипосом, что вносит определенный вклад в понимание до сих пор до конца неизученных основных механизмов проникновения содержимого компартмента иммунолипосом в клетки-мишени.
Апробация работы и публикации
Основные результаты исследований были представлены на I Международной конференции «Физико-химические методы исследования нанообъектов в химии, биологии и медицине» (Россия, Туапсе, 3-9 октября 2007), 6-ой Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Россия, Астрахань, 8-11 сентября 2008), а также на заседании кафедры биотехнологии факультета биоорганического синтеза и биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова и на заседании Проблемного совета ФГУ «ГНЦССП им. В.П. Сербского». По материалам диссертации опубликовано семь научных работ, отражающих основное содержание проведенных исследований.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 150 страницах печатного текста, содержит 28 рисунков и 3 таблицы; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 266 наименований
