Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1. Биотехнология пластиков из отходов растительного сырья 13
1.1.1. Химический состав лигноцеллюлозных субстратов 13
1.1.2. Общая характеристика дереворазрушающих грибов 22
1.1.3. Биодеградация лигноцеллюлозных субстратов 27
1.1.3.1. Механизмы биодеградации лигнина 28
1.1.3.2 Лигнолитический ферментный комплекс 32
1.1.3.3. Физиологические условия, влияющие на биодеградацию и синтез лигнолитических ферментов 53
1.1.3.4. Продукты биодеградации лигнина 60
1.1.4. Использование лигноцеллюлозных субстратов 61
1.1.4.1. Технология пластиков из отходов растительного сырья » 61
1.1.4.2. Влияние физико-химических свойств и связующих на качество пластиков 65
1.1.4.3. Перспективные технологии пластиков и других композционных материалов 68
1.2. Использование отходов микробиологических производств 73
1.2.1. Физико-химические основы склеивания и компоненты клеев 73
1.2.2. Состав и свойства отходов микробиологических производств 76
1.2.3. Использование отходов микробиологических производств 80
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 85
2.1. Микроорганизм 85
2.2. Реактивы, субстраты и материалы 85
2.3. Культивирование P. tigrinus 86
2.4. Методы определения активности ферментов 88
2.5. Методы выделения ферментов и исследования их свойств 91
2.6. Методы выделения лигнина и исследование
продуктов его биодеградации 94
2.7. Аналитические методы 99
2.8. Прессование и испытание биопластиков 102
2.8.1. Определение физико-механических показателей 102
2.8.2. Определение экологических показателей 103
2..9. Изготовление и испытание клеевых композиций 106
2.9.1. Методы исследования химического состава отходов.... 107
2.9.2. Испытание клеевых композиций 108
3.0. Статистическая обработка результатов 111
ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБА PANUS TIGRINUS НА ЛИГНОЛИТИЧЕСКУЮ AKTИВНОСТЬ И БИОСИНТЕЗ ФЕРМЕНТОВ ЛИГНОЛИЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА 112
3.1. Погруженное культивирование 112
3.1.1 Влияние буферных систем ирН 112
3.1.2. Влияние температурного сдвига 117
3.1.3. Влияние Твина - 80 120
3.1.4. Влияние индукторов - лигноцеллюлозных субстратов... 124
3.1.5. Влияние соотношения азотного и углеродного питания.. 133
3.1.6. Влияние источников углеродного питания 146
3.1.7. Влияние источников азотного питания 149
4 3.1.8. Выделение, очистка и характеристика лигнолитических ферментов Panus tigrinus 151
(4f- 3.2. Твердофазное культивирование 175
3.2.1. Влияние природы и модификации лигноцеллюлозных субстратов 175
ГЛАВА 4. БИОДЕГРАДАЦИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ СУБСТРАТОВ ГРИБОМ PANUS TIGRINUS 187
4.1. Особенности биодеградации лигнина различных лигно-целлюлозных субстратов 187
4.2. Изменение химического состава древесных опилок при различных условиях культивирования 202
4.3. Изменение химического состава отходов хлопчатника при различных условиях культивирования 222
ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕССОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ ИЗ ОТХОДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ОБРАБОТАННЫХ PANUS TIGRINUS 233
5.1. Влияние условий обработки грибом на физико-механические свойства биопластиков 233
5.2. Влияние условий обработки грибом на физико-механические свойства прессованных материалов из отходов хлопчатника 240
5.3. Влияние условий прессования на физкоко-механические свойства биопластиков 244
5.4. Механизмы участия лигнина в формировании свойств бипластиков 250
v 5.5. Экологические характеристики биопластиков 261
ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕЕВЫХ КОМПОЗИЦИЙ ИЗ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА АНТИБИОТИКОВ И КРОВЕЗАМЕНИТЕЛЕЙ 266
6.1. Химический состав отходов производства антибиотиков и кровезаменителей 267
6.2. Влияние обработки мицелия щелочью и кислотой на выход белков 269
6.3. Влияние условий модификации мицелия и соотношения компонентов композиций на физико-химические свойства клеев 271
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 282
ВЫВОДЫ 284
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 287
Введение к работе
Актуальность проблемы. Комплексное использование сырья и
создание безотходных технологий является одной из основных задач
современного производства и биотехнологии здесь отводится особая роль.
Значительная часть растительной биомассы - отходы лесного и сельского
хозяйства, перерабатывающей промышленности — используются
нерационально. Промышленные лигнины скапливаются в отвалах, что приводит к загрязнению природной среды. Изготовление из отходов древесины древесностружечных плит (ДСП) дает возможность сохранить большие запасы леса. Формальдегидные и карбамидные смолы, используемые в качестве связующих в производстве композиционных материалов токсичны и поэтому не безопасны для здоровья человека. Предложен ряд технологий древесных пластиков с использованием природных клеящих материалов, однако они не нашли широкого применения из-за низкой эффективности.
Компоненты лигноцеллюлозного сырья, в особенности лигнин, имеют сложную структуру. Лигнин - трехмерный, нестереорегулярный полимер ароматической природы. Он является обязательным структурным компонентом всех наземных растений и составляет 20 - 35% их сухой массы. Лигнин высокоустойчив к химическому и микробиологическому разложению, что создает ряд проблем при переработке лигноцеллюлозного сырья. Между тем, реакционно-способные группы лигнина, возникающие при соответствующей химической или биологической обработке и способные вступать во взаимодействия, придают лигноцеллюлозе пластифицирующие свойства, что позволяет изготавливать на ее основе древесные (лигноуглеводные) пластики (Болобова, 1999; Huttermann, 2001). Наиболее перспективной представляется предобработка лигниновой компоненты для увеличения ее адгезивных свойств.
8 Биомодификация лигнина - многоступенчатый ферментативный
процесс, зависящий от многих факторов, в котором участвуют
окислительные и гидролитические ферменты. Гриб «белой гнили» Partus
tigrinus обладает высокой скоростью роста на лигноцеллюлозных субстратах,
эффективно разрушает компоненты сырья. Его можно использовать для
модификации древесных отходов целлюлозно-бумажной,
деревообрабатывающей промышленности и отходов сельского хозяйства растительного происхождения в производстве композиционных материалов - лигноуглеводных пластиков. Однако механизмы деградации лигноцеллюлозы этим грибом в полной мере не выяснены, не определена роль отдельных ферментов в разложении сырья, не исследованы продукты, образующиеся при биодеградации и роль этих продуктов во взаимодействии компонентов лигноцеллюлозных субстратов. Без таких исследований невозможно контролировать биомодификацию и биоконверсию лигноцеллюлозных материалов.
Для покрытия древесных пластиков шпоном часто используют синтетические, дорогие клеящие материалы. Между тем, отходы микробиологической промышленности (производство антибиотиков, кровезаменителей, витаминов) содержат значительное количество белков и других полимеров, которые обладают вяжущими свойствами и могут быть использованы для получения биоклеев.
Полимеры в отходах микробиологических производств находятся в связанном состоянии и не доступны для взаимодействия с поверхностью склеиваемых твердых субстратов. Для вовлечения реакционно-способных групп этих макромолекул во взаимодействие с субстратом необходимо исследовать физико-химические свойства отходов, подобрать условия повышения их адгезивных свойств.
Цель исследования - разработка биотехнологии нетоксичных композиционных материалов из отходов растительного сырья и микробиологической промышленности.
Задачи исследования:
Подобрать условия культивирования P. tigrinus, обеспечивающие максимальный выход ферментов лигнолитического комплекса и высокую скорость разложения лигнина.
Изучить состав внеклеточного лигнолитического ферментного комплекса (ВЛФК) P. tigrinus, определить ключевой и вспомогательные ферменты.
Выделить и охарактеризовать физико-химические и лигнолитические свойства лакказы и пероксидазы гриба.
Исследовать динамику и характер изменения химического состава различных лигноцеллюлозных субстратов при твердофазном культивировании P. tigrinus, выращенного на различных питательных средах.
Исследовать влияние условий культивирования гриба на физико-механические свойства и экологические характеристики прессованных материалов из отходов растительного сырья, а также роль функциональных групп, продуктов и свободных радикалов, образующихся при биодеградации лигнина, в адгезии.
Разработать технологические приемы с использованием P. tigrinus для производства нетоксичных прессованных материалов из отходов растительного сырья.
Изучить физико-химические свойства отходов производства пенициллина и кровезаменителей, влияние условий модификации на их адгезивные свойства.
Разработать технические условия производства клеевых композиций из отходов производства пенициллина и кровезаменителей. Научная новизна. Впервые исследован состав лигнолитического
комплекса гриба Panus (Lentinus) tigrinus штамм ВКМ F- 3616 D. Гриб синтезирует Mn-пероксидазу, пероксидазу , лакказу, а также Н202-
10 генерирующий фермент глюкозооксидазу в условиях погруженного
культивирования, но не продуцирует лигнинпероксидазу . Для получения
пероксидазы и лакказы разработан новый способ погруженного
культивирования гриба, повышающий выход ферментов в несколько раз.
При твердофазном культивировании на лигноцеллюлозных субстратах гриб
синтезирует преимущественно пероксидазу и лакказу. Последовательность и
максимумы проявления активностей зависят от вида лигноцеллюлозного
сырья и способов их предварительной модификации.
Гриб продуцирует, по меньшей мере, две изоформы оксидаз различающихся по субстратной специфичности. Одна из них относится к желтым лакказам.
Впервые из P. tigrinus выделена и охарактеризована секреторная пероксидаза растительного типа. Изучение физико-химических свойств показало, что этот фермент имеет рН- и температурные оптимумы не характерные для грибных пероксидаз. Фермент проявляет оксидазные и пероксидазные свойства в зависимости от условий функционирования. Характер воздействия фермента на лигнин зависит от величины рН и наличия Н2О2.
Изучены условия культивирования P. tigrinus, изменения
происходящие в химическом составе отходов растительного сырья и в распределении функциональных групп лигниновой компоненты при бидеградации, влияние этих изменений на адгезивные свойства лигнина. Подобраны условия биомодификации и режимов прессования отходов растительного сырья для получения нетоксичных пластиков. Физико-механические свойства пластиков зависят от условий обработки грибом, режимов прессования, глубины и характера изменений, происходящих в лигнине растительного сырья.
Пластики, изготовленные из отходов растительного сырья,
обработанных грибом, по прочности не уступают пластикам,
изготовленным с применением синтетических смол.
Исследованы физико-химические свойства отходов производства пенициллина и кровезаменителей. Подобраны условия химической
'4И, модификации мицелиальных отходов продуцента пенициллина для
увеличения адгезивных свойств. Разработаны условия получения экологически чистых клеевых композиций на основе отходов микробиологических производств, которые можно использовать для покрытия древесных пластиков шпоном для повышения их влагостойкости и улучшения внешнего вида. Это позволяет осуществлять безотходную технологию производства пенициллина и других продуктов микробиологического синтеза.
Научно-практическая значимость работы. Предложены приемы повышения биосинтеза ферментов лигнолитического комплекса грибом Р. tigrinus и его применения для биомодификации отходов растительного сырья
fo с целью получения нетоксичных композиционных прессованных материалов,
без использования токсичных синтетических связующих.
Биотехнологическое производство пластиков, обладающих высокой прочностью на изгиб позволяет уменьшить эмиссию формальдегида в атмосферу более, чем в 30 раз, улучшить санитарно-гигиенические характеристики изготавливаемых изделий, решить проблему эффективной утилизации отходов различных отраслей промышленности (отходы древесины, хлопчатника, лигносульфонаты, целлолигнин). Получены два патента №213481 от 27.11.02, №2002103196/13 от 10.02.03 на производство прессованных материалов.
Подобраны условия получения клеевых композиций из отходов производства антибиотиков и кровезаменителей. Это дает возможность
v перевода производства антибиотиков в безотходный режим, позволяет
снизить значительные объемы энергетических затрат на утилизацию
мицелиальных отходов. Разработаны технические условия производства
клеев («Клеевая композиция» ТУ 9218-001-02069964-01), которое можно
осуществлять непосредственно на предприятиях, выпускающих
12 антибиотики и кровезаменители, что позволит, наряду с решением проблем
социального и экологического (дополнительные рабочие места, утилизация отходов) характера, получить дополнительную прибыль от производства и реализации клея.
Получены два патента РФ №2132348 от 09.04.97 и №2155790 от 02.11.98. Технология получения биоклея включена в каталог «Научно-техническая продукция малых фирм университетских технопарков» Минобразования РФ.
Связь работы с научными программами. Представленные результаты были получены в ходе исследований, проведенных в рамках хоздоговорных научно-исследовательских работ с ОАО «Биохимик» -«Разработка технологии производства клеев из отходов производства пенициллина», «Исследование адгезивных свойств отходов производства кровезаменителей». Грантов Правительства Республики Мордовия «Разработка новых технологий производства биоклеев из отходов предприятий Мордовии», «Получение экологически чистых строительных материалов при помощи базидиальных грибов», грантов Министерства образования РФ «Исследование свойств и роли ферментов лигнолитических грибов в биодеградации растительных субстратов и использование их для получения прессованных материалов РД 02-1.4-406», «Исследование физиолого-морфологических характеристик и свойств ферментов лигнолитического комплекса гриба P. tigrinus Е.02-6.0-112»
Биотехнология пластиков из отходов растительного сырья
Древесина - высоко структурированный материал (Fengel, Wegener, 1989). Главными компонентами древесины всех видов являются три основ ных структурных полимера - целлюлоза, гемицеллюлозы и лигнин. Механи чески прочные волокна целлюлозы образуют основу клеточных стенок, а ге (ti мицеллюлозы, лигнин и пектин заполняют промежутки между микрофиб риллами целлюлозы (табл. 1.1) (Заводов, Иванова, 1982; Оболенская, Леоно-вич, 1988; Hutterman et al, 2001).
Все компоненты древесины прочно связаны между собой. Древесина состоит, в основном, из органических веществ (около 99%), и лишь небольшую часть (около 1 %) составляют минеральные вещества, которые при сжигании древесины образуют золу. В состав золы входят соли щелочных металлов, главным образом, соли кальция (Михайличенко, Садовничий, 1991).
Органические вещества древесины разделяют на 3 части: углеводную, ароматическую и экстрактивные вещества. Экстрактивные вещества лишь пропитывают, клеточную стенку. К ним относятся низкомолекулярные органические соединения: смолы и жирные кислоты и их эфиры, летучие углеводороды-терпены, дубильные вещества. Углеводная часть древесины, представляющая комплекс полисахаридов, называется холоцеллюлозой. Массовая доля холоцеллюлозы составляет в древесине около 70-80%. В состав холо-целлюлозы входят основной компонент древесины - целлюлоза (40-50%) и нецеллюлозные полисахариды - гемицеллюлозы (полиозы). Древесина хвойных пород содержит меньше холоцеллюлозы (70%), чем древесина лиственных (80%), тогда как содержание целлюлозы колеблется в одних и тех же пределах (Леонович, Оболенская, 1989).
Целлюлоза - полисахарид, макромолекулы которого построены из остатков D-глюкозы, соединенных 1,4-/?-гликозидными связями. Это стерео-регулярный полимер, в цепи которого стереоповторяющимся звеном служит остаток целлобиозы. В каждом мономерном звене содержатся 3 спиртовые гидроксильные группы, из которых одна первичная - СН2ОН, а две (у Cj и Сз) вторичные - СНОН. Выделенная из растений целлюлоза всегда полидисперсна, т.е. содержит макромолекулы различной длины.
Целлюлоза является аморфно-кристаллическим трудногидролизуемым полисахаридом. Она способна гидролизоваться концентрированными кислотами при нормальной температуре. В разбавленных кислотах гидролиз целлюлозы идет гетерогенно. При температуре около 100С наблюдается быстрая начальная реакция гидролиза с резким падением степени полимеризации. Эта реакция соответствует гидролизу аморфных участков целлюлозы, в которые кислота проникает легче. В результате разрушения этой части целлюлоза распадается на отдельные кристаллиты (Щеголев, Оболенская, 1980).
Гемицеллюлозы относятся, как и целлюлоза, к полиацеталям. Однако в отличие от целлюлозы они большей частью не имеют линейного строения, а представляют собой нерегулярные гетерополимеры (смешанные полисахариды), макромолекулы которых обладают разветвленной структурой. Цепи их значительно короче цепей целлюлозы. Поскольку гемицеллюлозы имеют смешанное строение, они только условно подразделяются на пентозаны и гексозаны. Древесина лиственных пород содержит больше пентозанов, чем хвойных. Основными представителями пентозанов являются ксиланы. В лиственной древесине содержится глюкуроноксилан, а в хвойной - арабиног-люкуроноксилан. Содержание гексозанов выше в древесине хвойных пород по сравнению с лиственными. Основными представителями гексозанов являются маннаны и галактаны. В древесине лиственных пород содержится смешанный полисахарид глюкоманнан. В древесине хвойных преимущественно содержится галактоманнан. Галактаны так же, как и маннаны, встречаются в составе многих растений, но в древесине их немного (0,5-1,5%) (Фенгел, Вегенер, 1988).
Лигнин - один из наиболее распространенных полимеров в природе. Он является обязательным компонентом всех высших сосудистых растений, начиная с папоротникообразных. У древесных форм содержание лигнина достигает 20-35% сухой массы ткани. Недавно считалось, что состав этих фе-нольных полимеров более или менее одинаков. Однако позднее стало ясно, что, несмотря на общее сходство в принципах строения, друг от друга могут отличаться не только лигнины разных растений, но и лигнины разных тканей одного и того же растения. Так, кора и древесина одного и того же растения содержат различные лигнины. Отличаются друг от друга и лигнины основания и верхней части стеблей, а лигнин взрослой древесины дуба имеет более высокое содержание метоксильных групп (т.е. сирингильных и синапоиль-ных компонентов), чем лигнин молодой древесины. Исследования показали, что в лигнине папоротникообразных доминируют гваяцильные (кониферильные) составляющие (50-98%) при очень малом содержании н-гидроксифенильных компонентов (2-9%). У двудольных растений в составе лигнина доминируют сирингильные составляющие (57-65%), а п-оксифенильные практически отсутствуют. В лигнинах однодольных на долю н-гидроксифенильных компонентов приходится 10-14%, а доля гваяцильных (50-56%) лишь немногим превышает долю сирингильных составляющих (35-45%) (Запрометов, 1993; Yoshizava et al., 2000).
Микроорганизм
В работе использованы следующие реактивы: о-дианозидин, п фенилендиамин, пирокатехин, 2,2/-азино-бис(3-этил-бензтиазолин-6 ф сульфонат) аммония, ремазол бриллиантовый голубой R (RBBR), сирингал дазин производства "ICN" (США); Сефадекс G-25, G-75, ДЭАЭ-целлюлоза, ТЭАЭ-целлюлоза, КМ-целлюлоза -"Pharmacia" (Швеция); антрон, L-триптофан — "Reanal" (Венгрия); ионол - "Serva" (США); кумасси бриллиантовый голубой G-250 - "Loba Feinchemie" (Чехия); бычий сывороточный альбумин - "BDH Biochemicals" (Англия). Остальные реактивы - отечественного производства, марки хч, чда и ч.
В качестве субстратов при твердофазном культивировании гриба использовали березовые, сосновые и буковые опилки, пшеничную солому необработанные и модифицированные: 5%-ным водным раствором аммиака при 165 С в течение 5 мин и 2,5%-ным раствором H2SO4 при тех же условиях, а также ультразвуком с частотой 24 кГц в течение 10 мин; стебли хлоп чатника - гузапаю, полученную из Сирии; целлолигнин, полученный на Шу мерлинском биохимическом заводе. Размер опилок - 15x1-2 мм, гузапаи и целлолигнина - 15x1-5 мм.
Для приготовления клеевых композиций использовали костный клей, мицелий гриба Penicilium.chrisogenum - отход производства пенициллина на ОАО «Бихимик» г.Саранск, низкомолекулярную фракцию декстрана (НФД) отход производства кровезаменителей на ОАО «Биохимик» г. Саранск.
Измерения проводили на спектрофотометре СФ-46 "ЛОМО" (Россия), радиоспектрометре ЭПР РЭ 1301 (Россия) и на спектрофотометрах "Specord М-40" (Германия), "Specord 75-IR" (Германия), газовый хроматограф "Хром 5А" (Чехословакия). В работе использовали роторный испаритель Rotadest (Венгрия), гидравлический пресс ВП-930М (Россия), машины разрывные Р-10иРТ-250М(Россия).
2.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ P. TIGRINUS
Гриб P. tigrinus поддерживали на косяках с сусло-агаром. Для приготов (f, ления инокулята P. tigrinus культивировали в течение 4 суток на жидкой сре де Чапека-Докса, содержащей 20 г/л сахарозы, 20 г/л кукурузного экстракта и 15 г/л лигносульфоната (по а.с.в.), в конических колбах Эрленмейера объемом 250 мл со 100 мл среды, на круговых качалках со скоростью перемешивания 235 об/мин при 26С. Инокулят вносили в количестве 10 мл на 100 мл среды.
Погруженное культивирование проводили: 1) на питательной среде Чапека Докса следующего состава (г/л): NaN03 - 3; КН2Р04 -1; MgS04-7H20 - 0,5; КС1 - 0,5; FeS04-7H20 - 0,01; CuS04-5H20 - 0,22; рН - 6,0.
Выращивание гриба в экспериментах по оптимизации условий культи , вирования проводили, варьируя: - концентрацию лигносульфоната от 0,5 до 4% (по а.с.в.) при концентрации сахарозы 10 г/л; на питательной среде Кирка (Eggert С. et al, 1996) следующего соста ва (на 1 л): глюкоза - 3 г; КН2Р04 -1 г; NaH2P04 - 0,26 г; MgS04- 7Н20 - 0,5 г; (NH4)2S04- 0,317 г; CuS04-5H20 - 0,5 мг; СаС12 -2Н20 - 74 мг; ZnS04 -7Н20 мг; FeS04 -7Н20 - 5 мг; MnS04 5Н20 - 5мг; СоС12 -6Н20 - 1 мг; витамин V- ный раствор (Kirk Т.К. et al, 1978) - 0,5 мл, рН 4,5. -концентрацию азота от 1,2 до 24 мМ (источник азота - сульфат аммо ния) при фиксированной концентрации глюкозы 1, 3, 5, 10 г/л; -источники азота - сульфат аммония, нитрат аммония, нитрат натрия, нитрат калия, дрожжевой экстракт, пептон, соевая мука, D,L-acnapaniH, L - триптофан, в оптимальной концентрации (2,4 мМ); -источники углерода - пяти - (арабиноза) и шестиуглеродные сахара (глю коза, манноза), дисахариды (сахароза, мальтоза, целлобиоза), по лисахариды (КМЦ, крахмал) и трехатомный спирт (глицерин); -концентрацию полимерных субстратов - березовые опилки, целлолиг нин, от 0,5 до 5%, лигносульфоната - от 0,5 до 4%; ytf, -концентрацию Твина-80 от 0,025 до 0,2%; -буферы для сред - ацетатный, тартратный, лактатный, оксалатный, 15мМ,рН4,5. Гриб культивировали при 26С в конических колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл питательной среды в течение 12 суток, на круговых качалках со скоростью вращения 235 об/мин.
При твердофазном культивировании навески субстратов (1 г) помещали в пробирки, увлажняли водопроводной водой до 85% влажности, стерилизовали 1 ч при 1 атм и засевали 2 мл инокулята. Для проведения твердофазного культивирования гриба с целью получения прессованных материалов посевной материал выращивали в 2 стадии. Первую стадию осуществляли, как для проведения погруженного культивирования. На второй стадии культивиро-вание проводили в двух вариантах среды: 1) на питательной среде (Eggert et al., 1996) следующего состава (на 1 л): глюкоза - 3 г; соевая мука - 5 г; КН2Р04 - 1 г; NaH2P04 - 0,26 г; MgS04-7H20 - 0,5 г; (NH4)2S04 - 0,317 г; CuS04 5Н20 - 0,5 мг; СаС12 -2Н20 - 74 мг; ZnS04 -7Н20 - 6 мг; FeS04 7Н20 5 мг; MnS04 5 Н20 - 5 мг; СоС12 -6 Н20 - 1 мг; рН 4,5. В среду вносили цел 4р/ лолигнин (4 г/л) в качестве полимерного субстрата;2) на среде Чапека -Докса с лигносульфонатом (20 г/л). Колбы засевали инокулятом из маточных колб по 10 мл на 100 мл жидкой питательной среды. Засеянные колбы инкубировали на качалке при 25С и 235 об/мин шесть суток.
Далее осуществляли твердофазное культивирование на опилках. Для этого навески субстратов (25 г) стерилизовали 2 ч при 160С, помещали их в растильни, засевали из расчета 100 мл инокулята на 25 г опилок. По окончании культивирования растильни с проросшими субстратами высушивали в термостате при 55С.
Погруженное культивирование
Биосинтез ферментов ВЛФК и деградация лигнина в сильной степени зависят как от рН, так и от буферной системы в питательной среде (Kirk et al, 1976; Kirk , 1978; Дудченко , 1988). В классической среде, предложенной Кирком, обычно используют дорогие рН-буферы - диметилсукцинатный (Tien , 1987), фталатный (Kirk, 1978) и др. буферы. Была показана возможность их замены на более дешевые - ацетатный (Dass, Reddy, 1990), тартрат-ный (Мясоедова и др., 1993). Однако буферы, эффективные для какого-либо одного штамма, могут оказаться неэффективными в этих же целях, при работе с другими штаммами. Поэтому для отдельного штамма гриба необходимо экспериментально подбирать соответствующие буферы и другие параметры. Исходя из данных, полученных в вышеприведенных работах, в своей работе мы исследовали влияние 15 мМ ацетатного, тартратного, оксалатного и лак-татного буферов (при рН 4,5) на биосинтез ферментов ВЛФК и общую лиг-нолитическую активность гриба. В качестве контроля использовали среду без буфера с рН 4,5.
Было выявлено, что из рассмотренных буферных систем, оптимальными для биосинтеза пероксидаз были ацетатная и тартратная, а также контрольная среда без буфера (рис. З.1.). На данных средах наблюдался максимальный синтез пероксидазы (0,633 ед/мл), а суммарная пероксидазная активность была приблизительно одинакова еще и на контрольной среде. Однако в варианте с ацетатным буфером защелачивание среды с рН 4,5 до 6,85 (вероятно, за счет потребления ацетата грибом) на 6 и 10 сутки роста приводило к снижению уровня биосинтеза пероксидазы. Данная буферная система, несмотря на то, что стимулирует биосинтез пероксидазы, неприемлема для культивирования гриба с целью стабильного синтеза необходимого фермента. При культивировании на контрольной среде, напротив, происходило некоторое закисление среды (до рН 3,08), что, вероятно, связано с синтезом метаболитов грибом (например, оксалатов) (Решетникова, 1997), которые могут стабилизировать фермент, и в частности Мп-пероксидазы.
При культивировании на средах с использованием лактатного и оксалатного буферов биосинтез пероксидазы был почти на 30% ниже уровня контроля. Кроме того, пероксидазная активность регистрировалась лишь с 8 суток роста. Следует отметить, что на данных средах наблюдался довольно хороший рост гриба, т.е., вероятно, гриб использовал оксалат и лактат в качестве дополнительных источников питания и позднее переходил к вторичному метаболизму.
Исследования характера биосинтеза лакказы грибом при росте на средах с различными буферами показало, что оптимальным является вариант с тартратным буфером, а наименее благоприятными - с ацетатным и оксалат-ным. Довольно высокий уровень лакказной активности наблюдался и на контрольной среде без использования буфера.
Лигнолитическая активность гриба также менялась в зависимости от использованной буферной системы. Так, на контрольной среде лигнолитическая активность выше в первые 6 суток культивирования, с 8 суток она снижается и к 10 и 12 суткам не обнаруживается. На среде с тартратным буфером она начинает возрастать с 8 суток и продолжает расти до 12. На средах с оксалатным и ацетатным буферами отмечено неравномерное проявление лигнолитической активности в процессе роста гриба. И наименьшая лигнолитическая активность была отмечена на среде с лактатным буфером (рис. 3.2.). Максимальная суммарная лигнолитическая активность наблюдалась на контрольной среде, не содержащей буфера.
