Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Общая характеристика жиросодержащих отходов мясоперерабатывающей промышленности 9
1.2. Обзор технологий переработки жиросодержащих отходов мясоперерабатывающей промышленности 11
1.2.1. Физико-химическая переработка жировых отходов 11
1.2.2. Биологическая переработка жировых отходов 14
1.3. Общая характеристика микробных белковых кормовых добавок 17
1.4. Использование жировых отходов мясопереработки в качестве сырья для получения биомассы кормового назначения 22
1.4.1. Общая характеристика микробных липаз 24
1.4.2. Интенсификация потребления субстрата при гетерофазном культивировании предобработкой питательной среды 30
1.5. Влияние факторов химического и фотохимического стресса для клеток микроорганизмов на ростовые характеристики культуры 41
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 50
2.1. Определение химических показателей жировых отходов мясопереработки 50
2.2. Определение микробиологических показателей жировых отходов и исследование свойств автохтонных культур микроорганизмов 53
2.3. Культуры микроорганизмов и условия их культивирования 54
2.4. Определение липолитической активности микроорганизмов 57
2.5. Определение основных показателей микробной биомассы 58
Глава 3. ХИМИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЖИРОВЫХ ОТХОДОВ МЯСОПЕРЕРАБОТКИ 62
3.1. Исследование свойств бактериального изолята 64
3.2. Исследование свойств грибного изолята 65
3.3. Биоконверсия жировых отходов мясопереработки с использованием выделенного штамма гриба Geotrichum sp 73
Глава 4. Биоконверсия жировых отходов мясопереработки с использованием
дрожжей Y.lipolytica 75
4.1. Сравнительная характеристика микроорганизмов - продуцентов липаз .75
4.2. Направленная селекция дрожжей Y.lipolytica в отношении жирового субстрата 76
4.3. Оптимизация условий культивирования и состава питательной среды...83
4.3.1. Оптимизация условий культивирования дрожжей Y.lipolytica 83
4.3.2. Оптимизация минерального состава питательной среды 86
4.4. Предобработка жиросодержащей питательной среды 91
4.4.1. Щелочной гидролиз жиросодержащей питательной среды 91
4.4.2. Ферментативный гидролиз жиросодержащей питательной среды 94
4.4.3. Ультразвуковая предобработка жиросодержащей питательной среды.98
4.4.4. Сравнительная характеристика вариантов предобработки питательных сред 106
4.5. Физиологические приемы повышения эффективности биодеструкции жировых отходов 107
4.5.1. Стимулирование роста дрожжей воздействием стрессорными агентами 107
4.5.2. Направленная селекция дрожжей Y.lipolytica по устойчивости к окислительному стрессу 110
4.6. Исследование влияния режимов культивирования на эффективность процесса биодеструкции жиров и качество биомассы 113
4.7. Концентрирование биомассы 114
4.8. Технологическая схема биоконверсии жировых отходов мясопереработки в дрожжевую биомассу кормового назначения 119
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 123
Приложение 1. Аппаратурная схема производства и контрольно- измерительные приборы 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 142
- Физико-химическая переработка жировых отходов
- Определение химических показателей жировых отходов мясопереработки
- Исследование свойств грибного изолята
Введение к работе
В настоящее время российская пищевая промышленность по объему производства является одним из лидирующих направлений народного хозяйства. Высокие темпы развития наблюдаются в выработке мяса (птица, свинина, говядина) и продуктов его переработки, в результате чего происходит постепенное вытеснение импортной продукции с российского рынка.
Основной проблемой современных производств является их выведение на экологический чистый уровень путем внедрения малоотходных технологий. Существенное увеличение масштабов производств мясоперерабатывающего комплекса остро ставит вопрос переработки отходов, которые образуются при обработке мясокостного сырья, осветлении сточных вод в жироловке и флотаторе, очистке колодцев бойни.
Для мясокомбинатов это проблема уничтожения ряда органических отходов, таких как кровь, содержимое желудков и кишок, обрезь мяса и другие. Среди них можно выделить жировую составляющую, так как на нее приходится основная доля от общего количества отходов. Так твердая животная масса, собираемая в отстойниках, содержит не менее 40 - 45 % жира-сырца. Выход жиромассы при убое 1000 голов крупного рогатого скота или 1000 свиней разной упитанности, в среднем, составляет 9,3 тонны на каждую партию животных. Таким образом, в ходе работы мясокомбината неизбежно образуются большие количества жировых отходов, а их зараженность микрофлорой приводит к быстрому загниванию с образованием неприятных запахов. Кроме того, высокое содержание животных жиров в сточных водах создает трудности для эффективного функционирования очистных сооружений мясокомбинатов, поскольку способствует образованию плотных отложений на стенках труб и резервуаров.
Необходимо отметить, что жиросодержащие отходы отличаются многокомпонентностью состава, который варьирует в зависимости от
режима работы мясокомбината, в связи с чем большинство существующих технологий применимы только с рядом ограничений [1].
Существующие технологии переработки жировых отходов можно разделить на два типа: физико-химические и микробиологические. Первые, включающие щелочной гидролиз и окисление, вытопку жира, озонирование стоков и др., обладают рядом существенных недостатков. Они требуют жестких условий, существенных капитальных затрат, малоэффективны, а спрос на предлагаемые ими продукты переработки отходов недостаточно высок. Микробиологические технологии переработки жиросодержащих отходов предполагают использование биопрепаратов, содержащих живые клетки микроорганизмов, или комплексы ферментов, последующее доокисление жиров перманганатом калия и перекисью водорода. Также предлагается использовать биофильтры и проводить биодеструкцию анаэробным сбраживанием. Биологические методы отличаются высокой эффективностью, однако их существенным недостатком является то, что они не предполагают получение продукта, а предусматривают лишь утилизацию отходов. Это существенно снижает их ценность с позиций повышения рентабельности основного производства.
В настоящее время накоплен огромный опыт в области микробиологической переработки отходов различного происхождения [2]. К отличительным особенностям таких технологий можно отнести способность применяемых микроорганизмов ассимилировать широкий спектр органических соединений, а также их высокую приспособляемость к изменению состава используемого сырья. Микробиологические процессы в сравнении с традиционными химическими технологиями протекают в более мягких условиях, а образующаяся микробная биомасса может быть использована в качестве ценной кормовой добавки для сельскохозяйственной птицы и скота. Последнее особенно актуально для современного российского кормопроизводства, так как позволяет более эффективно использовать сырьевые ресурсы и с наименьшими затратами достигать максимальной
продуктивности животноводства и птицеводства. В настоящее время российский рынок комбикормов представлен различными отходами от переработки масличных и зерновых культур, существенным недостатком которых является низкое содержание белковых веществ и их обедненность по незаменимым аминокислотам.
Таким образом, современные народнохозяйственные потребности включают необходимость производства белковых кормовых добавок, и решение экологических вопросов при переработке отходов мясокомбинатов. Это позволяет рассматривать исследования, направленные на решение обозначенных проблем, как имеющие большое практическое и социальное значение [3].
Цель исследований. Разработать научные технологические основы аэробной биоконверсии жировой составляющей отходов мясопереработки в белковую микробную добавку кормового назначения. Для достижения цели поставлены следующие задачи:
Определить химические и микробиологические показатели, биологическую ценность жиросодержащих отходов мясопереработки.
Выделить и охарактеризовать автохтонные микроорганизмы; выбрать микроорганизмы с высокой липолитической активностью, способные ассимилировать жиры в качестве единственного источника углерода.
Изучить процессы культивирования микроорганизмов-деструкторов на жировых субстратах в зависимости от предобработки субстрата; влияния стрессорных факторов.
Исследовать влияние различных режимов культивирования микроорганизмов на характеристики технологического процесса и качество микробной биомассы; провести сравнительный анализ способов концентрирования получаемой биомассы.
Разработать технологическую схему переработки отходов мясокомбинатов и оценить ожидаемый экономический эффект от внедрения разработанной технологии.
Научная новизна работы.
Проведена сравнительная оценка 7 микроорганизмов: бактерий (Bacillus mesentericus, B.subtilis, Acinetobacter sp.), грибов (Aspergillus orysae, Penicillium orysae), дрожжей (Candida scottii, Yarrowia lipolytica), no показателям липолитической активности, содержанию клеточного белка и характеристикам роста на жиросодержащих питательных средах. Установлено, что дрожжи Y.lipolytica, обладающие лучшими ростовыми характеристиками, способны ассимилировать до 95 % жировых отходов от их общего содержания в среде, а образующаяся биомасса содержит не менее 42 % истинного белка.
Установлено существенное повышение эффективности культивирования дрожжей на жировых отходах при использовании ультразвуковой предобработки среды, что обеспечивает диспергирование и частичное окисление субстрата, тем самым повышая его биодоступность.
Показано, что воздействие перекисью водорода на дрожжевые клетки культур Y.lipolytica, используемые в качестве посевного материала, существенно повышает эффективность ассимиляции жиросодержащих субстратов и качество получаемой микробной биомассы в основном процессе.
Практическая значимость. Разработана технология биоконверсии жиросодержащих отходов мясопереработки в дрожжевую биомассу кормового назначения с эффективностью усвоения субстрата не менее 95 %. Технологическая схема включает ультразвуковую предобработку питательной среды, воздействие факторами окислительного стресса на посевной материал, культивирование дрожжей Y.lipolytica в непрерывном режиме со скоростью протока 0,24 ч"1, концентрирование биомассы отстаиванием до 158 г/л по АСБ (абсолютно сухая биомасса) и последующую сушку. Конечный продукт содержит не менее 42 % белковых веществ и не более 7,9 % общего жира. Согласно предварительной технико-экономической оценке реализация предложенной технологии позволит
получать продукт с себестоимостью 3575 руб/т, при годовом выпуске продукции 10000 т. Кроме того, реализация технологии позволит повысить рентабельности мясокомбинатов за счет снижения расходов на транспортировку и захоронение жиросодержащих отходов мясопереработки.
Физико-химическая переработка жировых отходов
Анализ литературы показывает, что на сегодняшний день существует широкий спектр технологий, основанных на физико-химическом воздействии на жировые отходы. При этом в некоторых из них удаётся получить продукт,
который может быть использован в дальнейшей хозяйственной деятельности человека [18]. Способы переработки отходов без образования ценных продуктов представлены различными методами очистки.
С целью повышения биологической ценности и расширения областей применения твердых животных жиров для производства продуктов питания применяют фракционирование жиров. В результате чего происходит разделение на высокоплавкую и низкоплавкую фракции триацилглицеридов, отличающихся по молекулярной массе, степени насыщенности и температуре плавления.
Фракционирование расплавленного жира при медленном охлаждении основано на кристаллизации жира в условиях контролируемой температуры, обеспечивающей выделение высокоплавкой фракции в виде кристаллического осадка, отделяемого от жидкой фракции прессованием, центрифугированием, вакуум-фильтрацией или декантацией. Однако применение данного способа весьма ограничено, он требует больших производственных площадей и длительного времени [19, 20].
Более быстрым является способ кристаллизации высокоплавких компонентов смеси жиров или жирных кислот из летучих растворителей с последующей фильтрацией массы и дистилляцией применяемых растворителей. Глицериды и жирные кислоты разделяются на фракции различной степени насыщенности и с различной длиной цепи углеродных атомов. Таким образом, возможно получение фракций, обладающих высокой биологической ценностью вследствие повышенного содержания ненасыщенных компонентов и свободных жирных кислот. Однако, необходимость значительных капитальных затрат для внедрения, а так же использование больших объемов органических растворителей ограничивает возможность практической реализации рассмотренного способа [21].
Отмеченных недостатков лишён способ фракционирования жиров путём диспергирования их в воде или водном растворе эмульгирующего агента. При диспергировании жиров в воде жидкая фаза удаляется с поверхности
кристаллов или затвердевших компонентов и заменяется водой. Образующаяся при этом дисперсная фаза состоит из сольватированных твёрдых компонентов, а продукты, оставшиеся жидкими, составляют дисперсионную фазу. Эту смесь можно разделить рядом способов, например, осаждением, фильтрацией или центрифугированием. Более лёгкую фракцию, содержащую компоненты с низкой температурой плавления, освобождают от воды и подвергают обычной обработке. Водную эмульсию разрушают, нагревая до температуры плавления твёрдых компонентов, таким образом получают фракцию с самой высокой температурой плавления [13, 22].
Фракционирование жиров возможно также методом молекулярной дистилляции при температуре от 150 до 250 С и пониженном давлении. Однако молекулярная дистилляция не дает большого эффекта при разделении глицеридов. Значительный эффект можно получить, удалив из жира свободные жирные кислоты и отделив неомыляемые вещества (стерины и витамины).
Наиболее перспективным является комбинирование методов переэтерификации и фракционирования. В результате переэтерификации триглицеридов со средней и большой длиной углеродной цепи образуются структурированные жиры, содержащие остатки ненасыщенных кислот, которые улучшают иммунные функции организма, снижают опасность возникновения опухолей и тромбов, снижают содержание холестерина в крови, улучшают баланс азота [19-21].
Определение химических показателей жировых отходов мясопереработки
Основным объектом исследования являлись жиросодержащие отходы мясоперерабатывающего предприятия «Митекс», которые отбирали из шламосборника. Химические показатели отходов (общий жир, свободно-извлекаемые жиры, кислотное и перекисное число жира) определяли в соответствии с ГОСТ 23042-85 [154]. Определение общего содержания жира
Метод основан на экстрагировании жира из смеси органическим растворителем с последующим гравиметрическим определением его содержания по отношению к исходному образцу.
Из обезжиренной фильтровальной бумаги сворачивают цилиндрик, в который помещают 2 небольших кусочка обезжиренной ваты и взвешивают. Затем цилиндрик плотно закручивают с одной стороны и помещают на дно один из кусочков ваты. В цилиндр вносят навеску анализируемого образца массой 3 г, сверху помещают второй кусочек ваты и заворачивают второй конец цилиндра. После чего производят повторное взвешивание и образец помещают в аппарат Сокслета. Определяют массу пустой колбы - gK. Собранный аппарат накрывают асбестовым полотном, заполняют растворителем (этанол : хлороформ = 1:2) в количестве 150 мл и нагревают в течении 2 - 3 ч с использованием электрической плитки, обеспечивая равномерное кипение растворителя, залитого в колбу. Конец кипячения определяют визуально, отбирая каплю экстракта из охлажденной камеры аппарата и помещая ее на чистое предметное стекло. Экстракцию считают законченной, если после испарения органического растворителя на стекле не остается жировых пятен.
По окончании аппарат разбирают, из колбы отгоняют летучие компоненты (органический растворитель и воду), присоединяя колбу к перегоночной установке. Завершают отгонку летучих компонентов при температуре 100-103 С. После охлаждения колбу взвешивают. Так же взвешивают высушенный бумажный цилиндрик.
Массовую долю жира во влажном образце X (в %) вычисляют по формуле: Х=100 (Ожир-ёк)/ё. Оценку массовой доли воды в образце Y (в %) проводят по формуле: Y=lM (go6-[G,Hp-gJ-gu)/g. Массовую долю жира в сухом образце XI (в %) вычисляют по формуле: Х1=Х 100/(100-У),где G KHp - масса колбы с высушенным жиром, г; gK - масса пустой колбы, г; g - навеска анализируемого образца, г; go6 - навеска анализируемого образца в бумажном цилиндрике, г; gu - масса сухого цилиндрика с остатком. Определение массовой доли свободно-извлекаемого жира
Метод основан на растворении липидов в бинарной смеси органических растворителей, их отделении и гравиметрическом определении массовой доли извлекаемого жира.
Навеску образца массой около 2 г помещают в бумажный цилиндрик, затем его переносят в делительную воронку в которую добавляют 20 мл экстрагирующей смеси (этанол : хлороформ = 1:2). Проводят экстракцию в течении двух минут путем переворачивания делительной воронки.
Экстракцию повторяют еще два раза с уменьшением объема растворителя до 10 мл. Смесь экстрактов переносят в круглодонную предварительно взвешенную колбу. Затем делительную воронку ополаскивают 5 мл экстракционной смеси и экстракт выливают в колбу. Для удаления растворителей осуществляют перегонку. Затем взвешивают колбу с жиром и добавляют 10 мл хлороформа. Через 5 минут хлороформ сливают.
Такое отделение липидов растворением повторяют еще два раза. После чего колбу оставляют в тяге на 30 минут. Затем колбу с нелипидными примесями взвешивают. Массовую долю жира во влажном образце X (в %) вычисляют по формуле: X = (gi-g2)/g. Массовую долю жира в сухом образце XI (в %) вычисляют по формуле: X = (gi-g2)/g (l-Y),rfle gi - масса колбы с жиром, г; g2 - масса колбы с нелипидными примесями, г; g - масса навески образца, г, Y - массовая доля воды в образце в долях (см. 3.3). Определение кислотного числа жиров и масел Кислотное число (КЧ) - это количество миллиграммов гидроксида калия КОН, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира или масла.
Исследование свойств грибного изолята
В ходе изучения клеток грибного изолята, предварительно выращенного на жидких и твердых средах различного состава, установлено, что исследуемая культура гетерогенна по морфологии. Клетки относительно крупные, сильно варьируют их размер и форма: есть продолговатые, вытянутые палочки с закругленными краями и почти круглые клетки. В молодых культурах преобладают клетки ровные, палочковидные, средний размер 13,8x5,5 мкм (рис. 3.1). В более старых культурах клетки проявляют большее разнообразие по форме и размерам (встречаются клетки типа «сапожок»), особенно при неблагоприятных условиях роста (рис.3.2.)
В ходе исследований микроморфологии установлено, что для данной культуры характерен как артрический (распад мицелия на клетки), так и бластический (почкование) тип вегетативного размножения. Причем почкуются клетки по голобластическому механизму, иногда между клетками образуется широкий перешеек, то есть для исследуемой культуры характерно и почкующееся деление, что и обуславливает прямоугольную форму клеток.
Также при изучении автохтонных грибов разных возрастов было обнаружено, что на определенной стадии жизненного цикла после почкования материнские и дочерние клетки не разъединяются, а продолжают почковаться. В результате возникают мицелиальные структуры. Таким образом, для автохтонной культуры характерно явление диморфизма: вид может расти в двух формах - одноклеточной и мицелиальной
Для изучения мицелиальных структур в данной работе использовали пластинки с картофельным агаром, накрытые покровным стеклом. При этом наблюдалось бурное образование мицелия. Установлено, что исследуемая культура способна образовывать как истинный, так и примитивный (состоящий из клеток одного типа) псевдомицелий. В аэробных условиях клетки образовывали типичный псевдомицелий - граница между клетками ложного мицелия представлена их изогнутыми концами, концевые клетки более короткие, чем предшествующие, хорошо заметны перетяжки в зоне перегородок (рис. 3.4). Это типично дрожжевое сцепление. В микроаэрофильных условиях (под покровным стеклом) клетки более крупные, сильно варьирующиеся по размеру, и при этом преобладает истинный мицелий (разделенный простыми септами): граница между клетками - резко преломляющая свет прямая перегородка, концевые клетки более длинные, чем предшествующие, нет перетяжек в зоне перегородок (рис. 3.3).
Наряду с двумя видами мицелия наблюдалось образование в гифах истинного мицелия из участков цитоплазмы бесполых эндогенных клеток, эндоспор: от большого истинного гифа отходят пучки более мелкого псевдомицелия. Таким образом, было установлено, что наряду с основными типами вегетативного размножения для исследуемой автохтонной культуры характерно бесполое размножение с помощью эндоспор, что говорит о плеоморфизме исследуемой культуры.
Для изучения особенностей роста автохтонной культуры на плотных средах проводилось культивирование культуры в чашках Петри на сусло агаре. Посев производился как штрихом, так и уколом. В результате исследований колоний, образующихся при выращивании на плотных средах, установлено, что исследуемая культура характеризуется быстрым ростом, образуя сухие белые колонии с ворсинчатым краем, который хорошо просматривается при просвечивании (табл. 3.6).
