Содержание к диссертации
Введение
1. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЙ 15
2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 24
2.1. Гормональная стимуляция суперовуляции у коров-доноров 24
2.1.1. Индукция полиовуляции у коров-доноров различными гонадотропинами, усовершенствование схемы гормональной обработки препаратом ФСГ-супер 29
2.1.2. Сополимеры поливинилового спирта как пролонгаторы действия препаратов ФСГ при индукции полиовуляции у коров-доноров 3 5
2.1.3. Использование в качестве доноров эмбрионов коров различного направления продуктивности 40
2.1.4. Эффективность многократного использования коров-доноров различных пород и индивидуальная изменчивость суперовуляции 47
2.2. Нехирургическое извлечение и оценка качества эмбрионов 72
2.2.1. Разработка технологических аспектов повышения эффективности извлечения эмбрионов в зависимости от некоторых факторов 76
2.2.2. Оценка качества эмбрионов по морфологическим признакам и резистентность ранних эмбрионов в условиях "in vitro" 89
2.3. Нехирургическая пересадка эмбрионов 98
2.3.1. Влияние различных факторов на приживляемость эмбрионов 99
2.3.2. Устройство для глубокой аппликации эмбрионов трансцервикальным путем 101
2.3.3. Эффективность межпородной пересадки эмбрионов при
получении мясных телят в молочном стаде 105
2.3.4. Получение разнояйцевых двоен путем внутрипородной и межпородной пересадки эмбрионов 108
2.3.5. Пересадка эмбрионов крупного рогатого скота как биотехнический метод борьбы с бесплодием 128
2.4. Криоконсервирование эмбрионов 132
2.4.1. Эффективность использования нового криопротектора и
жизнеспособность эмбрионов в зависимости от способов крио- и
деконсервации 140
2.5. Использование в условиях производства новых направлений биотехнологии 142
2.5.1. Методы регуляции соотношения полов и определения пола ранних эмбрионов крупного рогатого скота 142
2.5.2. Соотношение пола телят при трансплантации эмбрионов ранних стадий развития 144
2.5.3. Достоверность идентификации пола 7-суточных эмбрионов на основе анализа ДНК Y-хромосом и жизнеспособность эмбрионов с определенным полом при криоконсервации 148
2.5.4. Спонтанное и индуцированное возникновение монозиготных двоен 151
2.5.5. Способ и устройство для микрохирургического разделения ранних эмбрионов при получении монозиготных близнецов 156
2.5.6. Микрохирургическая дисекция деконсервированных эмбрионов 168
2.5.7. Эффективность получения и трансплантации свежих и деконсервированных эмбрионов крупного рогатого скота на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов 171
3. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 180
ОБСУЖДЕНИЕ 190
ВЫВОДЫ 196
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 199
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 200
ПРИЛОЖЕНИЯ 234
- ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЙ
- Гормональная стимуляция суперовуляции у коров-доноров
- Индукция полиовуляции у коров-доноров различными гонадотропинами, усовершенствование схемы гормональной обработки препаратом ФСГ-супер
Введение к работе
На современном этапе научно-технический прогресс в животноводстве в огромной степени зависит от разработки, освоения и реализации эффективных биотехнологических методов интенсификации воспроизводства, создания на этой основе новых высокопродуктивных пород, линий и гибридов животных. Низкие темпы воспроизводства и селекции у крупного рогатого скота, как у одноплодного вида млекопитающих, при наличии огромного генетического потенциала (число первичных фолликулов в яичниках коров составляет несколько сот тысяч), натолкнуло исследователей на поиск нетрадиционных методов повышения многоплодия. Эти методы основаны на исследованиях регуляции репродуктивной функции, совершенствовании приемов манипуляций с зародышами ранних стадий развития, половыми и соматическими клетками.
Возникновению биотехнологических направлений в разведении и селекции крупного рогатого скота предшествовал целый ряд открытий в сфере репродукции млекопитающих. Еще в конце 17-го века голландцем R.Groaf была впервые описана яйцеклетка, но лишь в 1890 г. англичанину В.Хипу из Кембриджского университета впервые в истории биологии удалось получить беременность путем пересадки 2 эмбрионов на стадии развития 2-х и 4-х бла-стомеров от крольчихи ангорской породы покрытой крольчихе бельгийской породы. В результате крольчиха-реципиент принесла 6 крольчат, из которых 4 бельгийской, а 2 ангорской пород. Успех этого эксперимента показал принципиальную возможность трансплантации эмбрионов ранних стадий развития, в том числе межпородной пересадки.
Если первые опыты носили чисто научный характер, то в 30-х годах, после обнаружения американскими исследователями Cole Н. и Hart G. [253] в крови жеребых кобыл гонадотропинов, способных вызывать полиовуляцию у самок, и разработки в 1936 г. гормонального метода повышения многоплодия животных группой исследователей ВИЖа под руководством академика Зава-довского М.М. [65, 67], трансплантации эмбрионов приобрела реальное прикладное значение.
После многочисленных опытов на лабораторных животных в 50-х годах были проведены успешные эксперименты на козах, овцах и свиньях [80, 113]. В 1940 г. группе американских исследователей [251] впервые удалось стимулировать суперовуляцию у крупного рогатого скота.
К началу 70-х годов группой кембриджских исследователей под руководством L.Rowson [410, 412, 413] в основном была разработана технология хирургической трансплантации зародышей, а первую успешную пересадку та ким путем осуществили в 1951 г. [488]. Там же в 1964 г. был получен первый теленок после бескровной трансплантации.
Начиная с 50-х годов в разных странах проводились многочисленные исследования по извлечению и пересадке зародышей нехирургическим методом. Однако существенное прикладное значение он приобрел лишь в середине 80-х годов. Этому способствовало создание практически новой технологии, позволяющей значительно упростить существовавшую процедуру. С этого времени трансплантация эмбрионов стала использоваться во многих странах мира в качестве одного из наиболее эффективных рычагов ускоренного воспроизводства элитного высокопродуктивного поголовья по материнской линии.
В настоящее время в США, Канаде и странах Западной Европы с развитым животноводством до 70% и более племенных быков поступают на станции искусственного осеменения с клеймом "Т" - трансплантат.
В СССР исследования в области трансплантации эмбрионов были начаты в конце 70-х годов. Первые телята после хирургической пересадки родились в 1977 г. во Всесоюзном НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных, а в 1980 г. во Всесоюзном НИИ животноводства были получены телята-близнецы после пересадки эмбрионов, хранившихся в течение двух месяцев в жидком азоте.
Широкое практическое внедрение метода началось с 1983 г., когда в стране, практически во всех союзных республиках создавались центры трансплантации эмбрионов. Если в 1979 г. было проведено лишь около 200 эмбриопересадок, то в 1989 г. уже родилось более 3000 телят-трансплантатов.
Упадок в экономике в связи с распадом Союза самым негативным образом отразился на развитии нового перспективного направления. Начиная с 1992-93 годов подавляющее большинство центров и производственных лабораторий, теперь уже в странах СНГ, было расформировано, сотни высококвалифицированных специалистов остались невостребованными. Такое положение сложилось повсеместно и практически не изменилось до настоящего времени. Тем не менее, в отдельных регионах потенциал в целом удалось сохранить, хотя и в значительно сокращенном объеме.
В Белоруссии Брестская область с 1987 г. занимает лидирующее место в области практического применения трансплантации эмбрионов. В областном центре трансплантации эмбрионов до настоящего времени проводится до 500 эмбриопересадок в год. В то же время в других 5 областях вместе взятых эта цифра не превышает 100.
Заслуживает внимания опыт селекционеров Украины, которые в период перехода к рыночной экономике, когда сельскохозяйственные предприятия из-за отсутствия валютных средств не в состоянии приобретать племенной скот за рубежом, пошли по пути преобразования стада с использованием ка-надско-американской селекции путем завоза эмбрионов и спермы голштинов и абердин-ангусов. Возглавил эту работу Головной селекционный центр Украины (г. Переяслав-Хмельницкий), где коллектив лаборатории по трансплантации эмбрионов (под руководством биотехнологов Мадисон В.В. и Мадисон Л.В.) за год с небольшим (1993-94 гг.) произвел более 2000 эм-бриопересадок в различных регионах страны со средним уровнем стельности 54,3%. В настоящее время созданы чистопородные мясные стада во многих хозяйствах Украины.
В России на сегодня работа в области трансплантации эмбрионов практически остановлена. В то же время здесь сосредоточен огромный научный и практический потенциал. Для восстановления эффективного использования в производстве передовых биотехнологий необходима лишь реставрация уже существующего опыта. Это, в свою очередь, в значительной степени зависит от разработки наиболее оптимальных и экономически выгодных решений как в технологической цепи трансплантации эмбрионов, так и при освоении и внедрении новых биотехнологических методов определения пола, микрохирургического разделения и получения эмбрионов вне организма. Эти направления биотехнологии в последние годы приобретают все большее значение для практики и привлекают пристальное внимание ученых во всем мире.
Актуальность темы. В результате углубленных исследований в области эмбриологии млекопитающих стало возможным внедрение в практику воспроизводства сельскохозяйственных животных метода трансплантации эмбрионов, как важнейшего средства ускорения качественного улучшения и более полного использования генетических ресурсов маточного поголовья в молочном и мясном скотоводстве.
В биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота является наиболее апробированным и широко используемым на практике методом. Подтверждением этому служат успехи в создании высокопродуктивного молочного скота в странах Северной Америки и Европы, где до 70% быков-производителей, используемых для качественного улучшения стада, получены путем пересадки зародышей. Несмотря на большое прикладное значение, потенциальные возможности трансплантации эмбрионов в практике воспроизводства используются далеко не полностью.
Среди основных причин недостаточной реализации метода - факторы экономического характера: высокая стоимость работ, низкие цены на племенной скот, ограниченные ресурсы высокопродуктивных животных. Немаловажное значение имеют и многие биологические и технологические факторы, связанные с эффективностью использования метода в условиях производства.
В технологии трансплантации эмбрионов индукция полиовуляции является звеном, от эффективности которого в большой степени зависит конечный результат. В этой области накоплен обширный материал. Но до настоящего времени вызывание суперовуляции остается нестабильным и малоизученным вопросом. Большое практическое значение имеют разработки упрощенных схем гормональной обработки, поиск надежных и эффективных веществ пролонгирующего действия.
Эффективность практического применения метода трансплантации эмбрионов существенно возрастает при использовании высокопродуктивных коров в качестве доноров эмбрионов несколько раз в год. Однако данные о влиянии на реакцию яичников и состояние матки коров многократных гормональных обработок и повторных процедур извлечения эмбрионов носят разноречивый характер.
Основным недостатком инструментов, наиболее часто используемых для пересадки эмбрионов, является определенный предел доступной глубины рога матки вследствие его кривизны. По мнению многих исследователей, при нехирургической пересадке верхушка рога матки, недоступная для катетера Кассу, является наиболее оптимальным местом [8, 12, 146, 258, 375, 405].
Усовершенствование инструментов для пересадки и сопутствующих технологических фрагментов могут в определенной степени повысить эффективность нехирургической пересадки.
Одним из резервов увеличения производства молока и мяса является повышение выхода телят за счет получения двоен биотехнологическими методами. Несмотря на потенциальные экономические возможности, объем исследований по получению двоен и межпородной пересадке у крупного рогатого скота недостаточен.
Существенный прогресс достигнут в области криоконсервирования эмбрионов. Несмотря на это, выживаемость эмбрионов, подвергнутых криокон-сервации, существенно снижается. Ряд вопросов, связанных с обеспечением стабильности получаемых результатов, поиск новых, менее токсичных и эффективных криофилактиков, упрощение технологии крио- и деконсервации остаются актуальными.
Внедрение и прикладное значение трансплантации эмбрионов вызвало необходимость более глубокого изучения ряда проблем, связанных с такими важными разделами молекулярной биологии и генетики, как клеточная и генетическая инженерия, которые являются основой новых направлений в биотехнологии. Одними из направлений, которые в наибольшей степени приблизились к стадии практического использования в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота, являются определение пола эмбрионов на предим-плантационной стадии развития, микрохирургическое разделение бластоме-ров с целью получения монозиготных близнецов и получение ранних эмбрионов на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров.
В решении проблемы определения пола достигнуты лишь незначительные успехи, что ограничивает их практическое применение. В последние годы в литературе появились сообщения об усовершенствовании метода определения пола на основе гибридизации ДНК Y-хромосом в степени, достаточной для использования в производстве, но имеющиеся данные крайне ограничены и не подтверждены исследованиями в странах СНГ.
Одним из перспективных биотехнологических приемов является проведение микрохирургических манипуляций с доимплантационными эмбрионами млекопитающих. Однако методы, используемые при микрохирургии зародышей, остаются сложными, трудоемкими, требующими специального дорогостоящего оборудования, поэтому их применение на практике ограничено. Необходимы дополнительные исследования, направленные на упрощение существующей процедуры разделения.
В последние годы огромное внимание исследователей во всем мире уделяется разработке принципиально новой биотехіюлогии, сочетающей использование трансплантации эмбрионов, культивирование и оплодотворение ооцитов in vitro. Решение этой проблемы позволит более интенсивно исполь зовать в воспроизводстве высокоценных племенных коров, резко увеличить генетический прогресс в популяции на основе повышения потенциала гамет в расчете на одну племенную корову и достоверной оценке генотипа [68]. Несмотря на существенные результаты, достигнутые в работах по получению эмбрионов in vitro, многие проблемы, в частности культивирование ооцитов и зигот, значительное снижение приживляемости развившихся эмбрионов в сравнении с эмбрионами, полученными in vivo, остаются нерешенными.
Цель и задачи исследований. С целью разработки и апробации в условиях сельскохозяйственного производства новых биотехнологических методов интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота были поставлены следующие задачи:
- изучить эффективность различных гонадотропинов и разработать способ стимуляции суперовуляции путем пролонгирования действия гипофизар-ных гонадотропинов;
- усовершенствовать способы и разработать устройства для нехирургического извлечения и сбора эмбрионов;
- разработать устройство и усовершенствовать технику нехирургической пересадки эмбрионов;
- определить эффективность межпородной пересадки эмбрионов для ускорения воспроизводства менее распространенных пород и различных способов получения двоен;
- изучить возможность использования пересадки эмбрионов в качестве биотехнического метода борьбы с бесплодием у коров с нарушениями воспроизводительных функций;
- усовершенствовать способы замораживания-оттаивания эмбрионов на основе использования новых криофилактиков и определить влияние породных отличий на результаты криоконсервации;
- установить достоверность определения пола на основе анализа ДНК Y-хромосом и определить влияние биопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания на выживаемость эмбрионов с определенным полом;
- разработать способ и устройство для микрохирургического разделения эмбрионов при получении монозиготных двоен в производственных условиях, изучить возможность разделения деконсервированных эмбрионов;
- усовершенствовать метод и определить жизнеспособность свежих и деконсервированных эмбрионов, полученных в условиях in vitro.
Научная новизна. В результате многолетних исследований на большом фактическом материале теоретически обоснованы, разработаны и апробированы в условиях производства новые биотехнологические методы интенсификации воспроизводства крупного рогатого скота различного направления продуктивности.
Разработан способ гормональной стимуляции суперовуляции путем пролонгирования действия препаратов ФСГ (приоритетная справка на выдачу патента на изобретение по заявке № а20020647 от 23.07.2002 г., опубл. 30.03.2003 г., бюл. № 1), устройства для нерургического извлечения (патент № 1792327) и сбора эмбрионов (а.с. № 1704775). В целях повышения приживляемое™ эмбрионов и упрощения техники пересадки сконструирован телескопический катетер для глубокой аппликации эмбрионов (а.с.№ 1796171).
Доказано отсутствие отрицательного влияния породных отличий эмбрионов при межпородных пересадках на 5 породах крупного рогатого скота и высокая эффективность различных способов получения двоен. Показана возможность сокращения бесплодия высокопродуктивных коров с нарушениями воспроизводительных функций путем пересадки эмбрионов.
Повышена эффективность криоконсервации эмбрионов на основе применения нового криопротектора дисахарида трегалозы. Установлено влияние породных отличий эмбрионов на результаты криоконсервации.
Установлена высокая степень достоверности определения пола ранних эмбрионов методом, основанным на анализе ДНК Y-хромосом. Доказано незначительное влияние микробиопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом. Отмечено увеличение частоты рождения монозиготных двоен после пересадки деконсервированных эмбрионов с определенным полом (9,4%), связанное с фактором самопроизвольного разделения эмбрионов в процессе эмбриогенеза, что представляет большой практический интерес.
Разработан упрощенный способ микрохирургического разделения эмбрионов в условиях производства и специальное устройство для его реализации (а.с. № 1727819). Доказана возможность эффективного разделения деконсервированных эмбрионов.
Разработано устройство для культивирования ооцитов и эмбрионов крупного рогатого скота (патент № 1822341).
Усовершенствован метод и определена эффективность трансплантации свежих и деконсервированных эмбрионов коров, полученных на основе экстракорпорального оплодотворения ооцитов.
Практическая значимость работы. Теоретически и практически обоснованные разработки новых биотехнологических методов позволяют оптимизировать их широкое и эффективное использование в интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота.
Разработанный способ гормональной стимуляции полиовуляции путем однократного введения ФСГ с пролонгатором позволяет отказаться от трудоемкой 8-10-кратной обработки животных при повышении выхода качественных эмбрионов на 7,5-15,2%. Способ нехирургического извлечения эмбрионов обеспечивает эффективность извлечения до 79,5%, что превышает аналогич ные показатели при извлечении известными методами на 6,7 и 7,7% соответственно. Устройство для извлечения повышает выход эмбрионов на 13% по сравнению с использованием катетера "Нойштадт". Устройство для фильтрации эмбрионов исключает их потери, в 2-3 раза сокращает трудоемкость процесса поиска и время нахождения эмбрионов вне организма.
При нехирургической аппликации эмбрионов в верхушку рога матки с помощью разработанного устройства приживляемость свежих и деконсерви-рованных эмбрионов повышается на 19,3 и 13,8% соответственно.
Межпородная пересадка эмбрионов, изученная на 5 породах, обеспечивает средний уровень стельности 55,6%, в том числе при пересадке свежих эмбрионов 62,1%, деконсервированных - 50,4%, что не уступает внутрипо-родной пересадке и дает реальную возможность ускоренного размножения редких и ценных пород скота, а также повышения мясной продуктивности молочного стада без увеличения поголовья коров.
Пересадка ранних эмбрионов может быть предложена как биотехнический метод борьбы с бесплодием высокопродуктивных коров - стельность от пересадки деконсервированных эмбрионов составляет 33,3%.
При использовании нового криопротектора дисахарида трегалозы приживляемость деконсервированных эмбрионов повышается до 54,3%, что сравнимо с пересадкой свежеполученных эмбрионов (56%).
При пересадке эмбрионов на стадии морулы бычков рождается на 9,2% больше, чем при пересадке бластоцист, что установлено и теоретически обосновано в результате аналитического исследования.
Установлен высокий уровень достоверности определения пола ранних эмбрионов на основе анализа ДНК Y-хромосом (93,8%); доказано, что отрицательное влияние микробиопсии зародышевых клеток и процессов замораживания-оттаивания на жизнеспособность эмбрионов с определенным полом минимально (9,3%) и метод с высокой эффективностью может быть использован в производстве в условиях специально оснащенной лаборатории.
Предлагаемый способ и разработанное устройство для микрохирургического разделения эмбрионов позволяют проводить дисекцию в условиях производства без применения специального оборудования при 50%-й приживляемое™ демиэмбрионов, что позволяет получать одного теленка на каждый использованный эмбрион (100% эффективности использования эмбрио-материала).
При получении эмбрионов in vitro использование разработанного устройства для культивирования позволило повысить уровень дробления зигот и выход эмбрионов до 54,8 и 33% соответственно, по сравнению с применением эксикатора (23,1 и 10,5%). В технологии получения эмбрионов крупного рогатого скота путем оплодотворения in vitro достигнут уровень созревания ооци-тов до стадии оплодотворения 43,4% и выход биологически полноценных эм брионов на стадии развития морула-бластоциста до 33% с приживляемостью 34,0-50,0% при пересадке свежих и 33,3-39,1% после замораживания-оттаивания.
Впервые сравнительные научные исследования проведены на 6 породах крупного рогатого скота различного направления продуктивности, в ходе экспериментов получено более 1300 телят-трансплантатов 6 пород, в том числе 277 двоен, 56 телят после пересадки половин разделенных эмбрионов, из них 11 пар монозиготных близнецов, 35 телят с определенным полом и 46 телят после пересадки эмбрионов, полученных in vitro. Созданы стада и группы высокопродуктивного черно-пестрого, абердин-ангусского, симментальского, герефордского и лимузинского скота. На республиканский элевер поставлено более 200 генетически ценных бычков-трансплантатов 6 пород, полученных биотехнологическим путем, для использования в широкомасштабной селекции.
В 1987 г. по разработанному нами проекту был создан Брестский областной центр трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота (приказ Брестского областного агропромышленного Комитета № 358 от 7.12.1987 г.).
Научная новизна и практическая значимость исследований подтверждены 3 авторскими свидетельствами, 2 патентами на изобретения и 3 рационализаторскими предложениями. Получена приоритетная справка на получение патента на изобретение пролонгирования действия ФСГ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
- заседаниях Ученого совета Брестской областной государственной с.-х. опытной станции. Пружаны (1988-1992 гг.);
- республиканской научной конференции "Интенсификация производства в отраслях агропромышленного комплекса на основе использования методов биотехнологии". Минск, 1989 г.;
- республиканском научно-методическом совещании "Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота". Жодино, 1989 г.;
- республиканской научно-практической конференции "Биотехнология и воспроизводство в животноводстве". Горки, 1991;
- расширенном заседании Ученого совета Брестской ГОСХОС. Пружаны, 1993 г.;
- расширенном заседании отдела биотехнологии БелНИИЖ. Жодино, 1993 г.;
- межгосударственной научно-практической конференции "Генетико-селекционные и технологические проблемы разведения сельскохозяйственных животных". Киев, 1994 г.;
- 2 межгосударственной научно-практической конференции "Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота". Брест, 1995 г.;
- международной конференции "Научные основы интенсивного развития животноводства". Горки, 1995 г.;
- международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства". Горки, 1996 г.;
- межгосударственной научно-практической конференции "Новые методы селекции и разведения высокопродуктивных пород и типов животных". Киев, 1996 г.
- международной научно-практической конференции "Использование трансплантации эмбрионов в селекции и разведении сельскохозяйственных животных". Аскания-Нова, 1997 г.;
- международной научно-производственной конференции "Конкурент-носпособное производство продукции животноводства в республике Беларусь". Жодино, 1998 г.;
- международной научно-практической конференции "Сельскохозяйственная биотехнология". Горки, 1998 г.;
- 2 международная научно-практическая конференция "Сельскохозяйственная биотехнология". Горки, 2001 г.;
- международной научно-производственной конференции "Интенсификация производства продуктов животноводства". Жодино, 2002 г.;
- заседании научной конференции международного общественного объединения "Восток-Запад". Минск, 2003 г.
Реализация результатов исследований. Исследования проведены в 1986-2003 гг. в рамках республиканских научных программ: "Межотраслевая комплексная республиканская программа по приоритетным направлениям развития агропромышленного комплекса" (ВКГОКП № госрегистрации 01.8601311552), "Трансплантация эмбрионов в животноводстве Республики Беларусь на 1993-2000 гг." (ВКГОКП № 1997482); областных программ по развитию животноводства в период с 1990 по 2003 гг.
Основные положения и практические предложения использованы при подготовке 4 методических рекомендаций.
Результаты научных исследований внедрены и используются в лаборатории по трансплантации эмбрионов РСУП "Брестплемпредприятие", гос-племзаводах и племхозяйствах "Луч", "Дружба", "Мухавец", "Видомля", "За-козельский", колхозах "Советская Белоруссия", "Молодово", "Октябрь", "Красная звезда" Брестской области, СПК "Агрокомбинат "Снов" и УП "Аг-рокомбинат "Ждановичи" Минской области.
За работу "Внедрение и практическое использование биотехнологии трансплантации эмбрионов в племенном скотоводстве" в 1987 г. присуждена премия МК ВЛКСМ, МОС НТО и МОС ВОИР в области науки, техники, производства и педагогической деятельности.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- суперовуляция и эмбриопродуктивность у коров-доноров различных пород;
- стимуляция суперовуляции у коров-доноров одной инъекцией препаратов ФСГ с пролонгатором;
- эффективность длительного использования в качестве доноров эмбрионов коров различного направления продуктивности;
- разработка технологических аспектов повышения эффективности нехирургического извлечения эмбрионов;
- зависимость приживляемое™ от места аппликации эмбриона в роге матки и специальное устройство для трансцервикальной пересадки;
- межпородная пересадка и получение двоен;
- использование пересадки эмбрионов, как биотехнического метода борьбы с бесплодием высокопродуктивных коров;
- влияние криопротектора и породных отличий эмбрионов на их жизнеспособность после деконсервировации;
- достоверность определение пола на основе анализа ДНК Y-хромосом;
- разработка метода разделения эмбрионов при получении монозиготных близнецов в применении к условиям производства;
- жизнеспособность свежих и деконсервированных эмбрионов, полученных путем экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров.
Опубликованное ть результатов. По материалам диссертации опубликовано 48 научных работ, из них 3 авторских свидетельства, 2 патента на изобретения и 1 рекомендация. Материалы научных исследований были использованы при разработке 4 методических рекомендаций: "Технология трансплантации эмбрионов в молочном и мясном скотоводстве" (Жодино, 1996, 34 с); "Криоконсервирование эмбрионов крупного рогатого скота" (Жодино, 1997, 19 с); "Биотехнология воспроизводства крупного рогатого скота на основе оплодотворения ооцитов коров вне организма (in vitro)" (Жодино, 1999, 15 с); "Технология получения эмбрионов крупного рогатого скота вне организма (in vitro) и долговременного их хранения" (Жодино, 2001, 17 с).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 234 страницах, состоит из введения, общей характеристики работы, основных методов и результатов собственных исследований с обзором литературы, заключения, предложений производству, списка использованной литературы и приложений. Содержит 55 таблиц и 49 рисунков. Список литературы включает 494 источника, из которых 282 иностранных.
Основные методы и материал исследований
Научные исследования проведены в 1986-2003 годах во Всероссийском НИИ животноводства, Брестском областном центре трансплантации эмбрионов "Майск", областной лаборатории трансплантации эмбрионов РСУП "Бре-стплемпредприятие", госплемзаводах "Луч", "Нача", племсовхозах "Закозель-ский", "Мухавец", "Видомля", колхозах "Советская Белоруссия", "Октябрь", "Молодово" и "Красная звезда" Брестской, госплемзаводе "Россь" Гродненской и агрокомбинатах "Снов" и "Ждановичи" Минской областей, а также в ряде хозяйств 6 областей Украины. Лабораторная часть исследований по новым направлениям биотехнологии проводилась совместно с лабораторией племпредприятия RPN (г. Ферден, Германия) (рис. 1).
В качестве доноров многократно использовали 580 клинически здоровых нелактирующих коров 6 пород различного направления продуктивности в возрасте 4-10 лет: черно-пестрый молочный скот (голштины) с удоем по наивысшей лактации 6189-11407 кг молока жирностью 3,63-4,82%, молочно-мясные симменталы с продуктивностью 5246-7429 кг молока жирностью 4,02-4,79 %, мясные породы - абердин-ангусская, герефордская, шаролезская и лимузинская. В качестве реципиентов - черно-пестрые телки случного возраста с живой массой 340-400 кг и высокопродуктивные коровы с отклонениями воспроизводительных функций неясной этиологии по данным гинекологического обследования.
Кормление доноров и реципиентов соответствовало нормам ВИЖ согласно "Инструкции по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных" [77]. При отборе коров для использования в качестве доноров учитывали общее состояние здоровья и состояние репродуктивных органов по результатам ректогенитального обследования.
Для стимуляции суперовуляции использовали различные гипофизарные гонадотропины: фоллитропин (Литва), ФСГ-супер (Россия), ФСГ-п (США), Фолликотропин (Чехия). Дозы препаратов подбирали индивидуально с учетом породных отличий, живой массы и упитанности коров-доноров и составляли соответственно 1000-1200 ед., 40-50 ед. по Арморовскому стандарту, 40-50 мг, 440-480 ед. (табл. 1-4).
При обработке животных использовались классические 4-дневные схемы: 8-кратное введение препаратов с интервалом 12 часов. Обработку начинали в лютеальную фазу с 9-12 дня эстрального цикла.Через 48 часов после 1-й инъекции препарата вводили аналоги простагландина F2a (эстрофан, супер-фан, анипрост, эстуфалан и др.) двухкратно с интервалом 12 ч в дозах 500 и 250 мкг по клопростенолу.
Независимо от признаков охоты животных осеменяли трехкратно через 48, 60 и 72 часа после первой инъекции простагландина замороженно-оттаянной спермой индивидуально закрепленных быков-производителей. При втором осеменении вводили рилизинг-гормон (сурфагон) в дозе 3-5 мл для ускорения овуляции созревших фолликулов.
Был проведен эксперимент по увеличению содержания ЛГ-компонента в рабочей схеме гормональной обработки препаратом ФСГ-супер путем добавления 500 ед. ГСЖК.
Нами были проведены исследования по пролонгированию действия ФСГ-супер и ФСГ-п с помощью поливинилового спирта (ПВС) на 2 группах коров-доноров (136 обработок). Схема обработки пролонгированной формой ФСГ приведена в таблице 5. Полученные результаты сравнивали с обработкой препаратами ФСГ без ПВС по классической 4-дневной схеме на 2 группах коров-доноров (179 обработок).
Во всех случаях извлечение эмбрионов проводили нехирургическим путем на 7-8 день индуцированного полового цикла. Предварительно проводился подсчет количества желтых тел и неовулировавших фолликулов в яичниках путем ректального обследования. Низким уровнем суперовуляции считали от 3 до 5 желтых тел на обоих яичниках, средним от 6 до 10, высоким от 11 до 20 и более 20 наивысшим. При извлечении эмбрионов использовали гибкие катетеры производства фирмы "Нойштадт " (Германия) и разработанное нами устройство. При этом применяли 3 способа промывания рогов матки: 1 - порционно с помощью шприцов Фоллея объемом 60 мл; 2 - самотеком через замкнутую систему латексных трубок; 3 - разработанной нами системой.
В качестве промывной среды применяли сбалансированный солевой раствор Дюльбекко с добавлением сыворотки крови теленка или бычьего альбумина и антибиотиков в общем объеме от 150 до 400 мл на один рог матки в зависимости от суперовуляторной реакции яичников.
Перед извлечением эмбрионов с целью расслабления мускулатуры матки и снятия напряжения прямой кишки проводилась низкая сакральная анестезия 2%-м раствором новокаина в объеме 5-8 мл в зависимости от породных различий и массы коров-доноров (мясные породы, как правило, реагировали слабее молочных) (рис.2). По окончании извлечения эмбрионов в полость матки вводили раствор антибиотиков (по 500 тыс.ME пенициллина и стрептомицина в 20 мл 0,5% раствора новокаина). На 7-9 день индуцированного полового цикла инъецировали 500 мкг простагландина.
Извлеченная среда пропускалась через эмбриоконцентратор (Германия) с размером ячеек менее диаметра эмбриона и разработанный нами эмбрио-фильтр. Среда из фильтров в поисках эмбрионов просматривалась под бинокулярными микроскопами OPTON (Германия) и NICON (Япония) при 60-кратном увеличении. Эффективность извлечения оценивалась по числу полученных эмбрионов и яйцеклеток в соответствии с реакцией яичников. В общем объеме исследований проведено 978 нехирургических извлечений, получено 7568 зародышей, из числа которых 4685 пригодных для трансплантации. Визуальная морфологическая оценка проводилась при 80-кратном увеличении в соответствии с Инструкцией ВИЖ [126] и Руководством для работы по пересадке эмбрионов П.Кауффольда, И.Тамма и др.[148].
Пригодные для трансплантации эмбрионы, в зависимости от наличия подходящих реципиентов, пересаживали свежими или подвергали глубокому замораживанию.
При невозможности обеспечения необходимым количеством реципиентов в спонтанной охоте у телок охоту синхронизировали с помощью аналогов простагландина F2a (эстрофан, анипрост, и другие). Простагландины вводили в дозе 500 мкг по клопростенолу при наличии в одном из яичников функционирующего желтого тела, что устанавливали ректально.
Гормональная стимуляция суперовуляции у коров-доноров
Гормональное стимулирование суперовуляции является первоочередным и одним из основных звеньев, от эффективности которого в большой степени зависит успех в выполнении всех последующих этапов технологии трансплантации эмбрионов.
Литературные данные показывают, что вопросы, связанные с гормональным индуцированием полиовуляции изучались многими исследователями и в этой области накоплен довольно обширный материал. Однако вызывание суперовуляции остается нестабильным и малоизученным звеном в трансплантации эмбрионов. Это связано, в первую очередь, с непредсказуемостью реакции яичников коров на экзогенные гонадотропины: отсутствием реакции примерно у 30% обработанных животных и значительной вариабельностью в уровне полиовуляции. При этом даже получение высокого уровня полиовуляции не гарантирует высокого уровня пригодных эмбрионов.
Возможность стимуляции суперовуляции у крупного рогатого скота связана с высоким репродуктивным потенциалом. В яичниках самки крупного рогатого скота количество полостных фолликулов, в которых развиваются ооциты, измеряется десятками тысяч и остается неизменным с двухмесячного возраста до 8-10 лет, после чего медленно уменьшается [141, 279]. Однако в течение продуктивной жизни коровы используется лишь 5-7 фолликулов, а 99% подвергаются атрезии [56, 101].
Стимуляция суперовуляции у коров стала возможной после открытия в 1930 году американскими учеными Коулом X.. и Хартом Г. [253] в крови жеребых кобыл сильнейшего стимулятора гонад самки - гонадотропина сыворотки крови жеребых кобыл (ГСЖК). В 1934 году советскими учеными во главе с академиком ВАСХНИЛ Завадовским М.М. [66, 67] были разработаны теоретические и практические основы гормональной стимуляции многоплодия у сельскохозяйственных животных. Введение ГСЖК за 4-5 дней до ожидаемой охоты обеспечивало множественный рост и овуляцию фолликулов.
Гонадотропин СЖК выделяется специализированными клетками тро-фобласта между 36 и 40 днями жеребости и обладает свойствами как фолли-кулостимулирующего, так и лютеинизирующего гормонов [287].
При своей распространенности препараты СЖК имеют весьма существенный недостаток. Высокое содержание сиаловых кислот и карбогидратов, молекулы которых не могут быть захвачены рецепторами паренхиматозных клеток печени, препятствует инактивации и обусловливает длительное действие ГСЖК. Период полураспада экзогенной СЖК в крови составляет около 6 дней [234, 421], но даже через 10 дней после введения его обнаруживали в организме коров [421]. Продолжительное содержание в крови после суперовуляции отрицательно влияет на характер развития зародышей [416, 421].
В ранних исследованиях обработку коров ГСЖК начинали в период перехода от лютеиновой к фолликулярной фазе полового цикла на 16-17 день. Была отмечена высокая вариабельность в сроках прихода доноров в охоту [119].
В опытах Прокофьева М.И. [160] для имитации продления функции желтого тела одновременно с ГСЖК вводили прогестерон, что привело к проявлению охоты в оптимальные сроки у 89,5% обработанных животных. При этом снижалось количество неовулировавших фолликулов и вариабельность в числе овуляций. По данным Sreenan I.M. [444] введение прогестерона в течение 9-10 дней повышало уровень суперовуляции, но приживляемость полученных эмбрионов снижалась.
В исследованиях Sreenan I.M. [439] и позднее Никояна П.Е. [145] сочетание ГСЖК, эстрадиол бензоата и хориогонина позволило получить по 15 эмбрионов на донора, но качество эмбрионов было на низком уровне - до 70% дегенерации.
Некоторыми исследователями [90, 240, 244] также отмечается, что использование хориогонина снижает оплодотворяемость яйцеклеток и повышает уровень дегенерации зародышей, а также вызывает преждевременное рассасывание желтого тела и является причиной вариабельности в сроках охоты. Согласно другим данным [290] введение ГСЖК, эстрадиола и хориогонина позволило получить в среднем 7,4 эмбрионов против 3,3, если эстрадиол не вводили. Авторы предполагают, что оплодотворяемость повышается за счет того, что все животные приходят в охоту, а не увеличивается уровень суперовуляции или извлекаемость эмбрионов, как считает Hafez E.S.E. [298].
Стимуляция суперовуляции резко изменяет гормональный статус в сравнении с естественным половым циклом. Отклонения, вызванные введением экзогенных гонадотропинов, непосредственно влияют на процессы созревания и овуляции фолликулов, оплодотворение и транспорт яйцеклеток в половых путях, последующее развитие зародышей [56, 149, 160, 163, 324].
У суперовулированных коров уровень эстрогенов в крови перед охотой, во время охоты и некоторое время позднее значительно превышает их концентрацию в крови необработанных животных [31, 159, 240]. Высокий уровень эстрогенов усиливает подвижность яйцеводов, вызывая ускоренный транспорт яйцеклеток в матку, слизистая которой оказывается неподготовленной к имплантации зародыша, что ведет к его изгнанию, преждевременному сбрасыванию оболочки и дегенерации [31, 309, 324].
Гормональная стимуляция суперовуляции у коров-доноров
В настоящее время результаты многочисленных исследований позволяют заключить, что гипофизарные гонадотропины более стабильны по уровню полиовуляции и выходу качественных зародышей по сравнению с плацентарными [7, 83, 130, 138, 147, 182,290,300,303,396].
Различные гипофизарные гонадотропины обладают сходными способами применения и близки по результативности, однако препараты ФСГ, производимые в разных странах, отличаются степенью очистки, соотношением
ФСГ- и ЛГ- компонентов и некоторыми другими свойствами, что определяет эффективность их использования для стимуляции суперовуляции.
Нами были проведены сравнительные исследования эффективности индуцирования полиовуляции на 4 группах коров-доноров препаратами ФСГ 4 типов: 1 группа - фоллитропин (Литва), 2 - ФСГ-супер (Россия), 3 - ФСГ-п (США) и 4 - фолликотропин (Чехия).
Гормональные обработки проводили по классическим 4-дневным схемам с 8-кратным введением препаратов каждые 12 ч в убывающих дозах. При этом общая доза препаратов подбиралась индивидуально с учетом породы, живой массы и упитанности животных и составляла для фоллитропина 900-1200 ед, ФСГ-супер 40-50 мг, ФСГ-п 40-50 мг, фолликотропина 440-480 ед.
Использование различных препаратов ФСГ обеспечивало высокий процент коров-доноров с суперовуляцией: во 2-4 группах вариабельность этого показателя составляла от 85,2 до 95,1%, несколько ниже, но на достаточно высоком уровне в 1-й группе - 75,2% (табл. 6).
По остальным показателям в 1, 2 и 3-й группах заметных различий отмечено не было: соответственно - среднее число овуляций на донора составило 11,3; 11,6 и 11,8, выход эмбрионов и яйцеклеток 9,3; 8,9 и 8,8, в том числе морфологически пригодных 6,3; 6,0 и 5,9. В 4-й группе эти показатели были достоверно выше, чем во 2-й: 13,5; 10,9 и 8,1 против 11,6; 8,9 и 6,0 (Р 0,01; 0,01; 0,01) соответственно. Во всех четырех группах не выявлено достоверной разницы по числу дегенерированных эмбрионов: вариабельность соответственно по группам составляла от 1,0 до 1,6 в среднем на донора или от 11,8 до 18,1% от общего числа полученных зародышей. По числу неоплодотворенных яйцеклеток разница была также недостоверной, за исключением 1-й и 2-й групп: 1,7±0,26 и 1,8+-0,19 (Р 0,05).
Таким образом, использование различных гипофизарных гонадотропи-нов во всех случаях было высокоэффективным, однако достоверным преимуществом отличался фолликотропин чешского производства.
Существует прямая корреляция между числом зародышей и уровнем суперовуляции (коэффициент корреляции +0,79). В то же время коэффициент корреляции между числом овуляций и пригодных эмбрионов составляет 0,11, что свидетельствует об отсутствии этой зависимости [211].
По данным ряда авторов [235, 298], качество эмбрионов снижается при повышении овулирующей реакции яичников, по другим данным [309] высокий уровень суперовуляции не сказывался на выходе качественных эмбрионов.
По результатам экспериментов был сделан анализ эффективности получения эмбрионов при различных уровнях суперовуляции как в общем объеме исследований, так и в разрезе использования различных препаратов ФСГ.
В первом случае были получены следующие данные (табл. 7). Низкий уровень суперовуляции (3-5 желтых тел) отмечен у 16,6% от числа коров-доноров с суперовуляцией, средний (6-10) - у 34,2%, высокий (11-20) - у 40,5% и наивысший (более 20) - у 8,7%.
