Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. ОРГАНОФОСФОНАТЫ КАК КЛАСС ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ 9
Органофосфонаты - соединения с прямой С-Р связью 9
Природные и синтетические органофосфонаты 9
Глифосат (N-фосфонометилглицин) 12
1.2. БИОДЕСТРУКЦИЯ ОРГАНОФОСФОНАТОВ 16
Микроорганизмы - деструкторы фосфонатов 16
Получение накопительных культур 18
Энзимология разложения С-Р связи 18
Физиологические особенности разложения С-Р связи 21
Деструкция глифосата 22
Физиологические особенности разложения глифосата 26
1.3. ПОВЕДЕНИЕ ГФ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ 29
Устойчивость ГФ 29
Инактивация ГФ в окружающей среде 30
Механизм сорбции глифосата 31
Сорбция глинистыми минералами и органическим веществом 33
Влияние фосфата на сорбцию ГФ 34
Биодеструкция ГФ в почве 35
1.3.3. Подвижность ГФ в почве 36
1.4. БИОРЕМЕДИАЦИЯ - КАК СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ ПОЛЛЮТАНТОВ 38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 42
2.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 42
Среды для культивирования бактерий 42
Выделение и отбор бактерий-деструкторов 42
Условия культивирования бактерий 43
Таксономическое определение штаммов-деструкторов 44
Изучение выживаемости клеток при длительном хранении 45
2.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 47
Аналитическое определение фосфатов и фосфонатов 47
Количественное определение ГФ 48
Определение метаболитов деструкции в культуральнои жидкости 49
2.2.4. Другие аналитические методы 49
2.3. ЭКСПЕРИМЕНТЫ В МОДЕЛЬНЫХ ПОЧВЕННЫХ СИСТЕМАХ 49
Характеристика используемых почв 49
Изучение сорбции ГФ в почвенной суспензии 50
Построение изотерм сорбции ГФ 51
2.4. БИОДЕГРАДАЦИЯ ГФ В ПОЧВЕ 51
Микробная деградация ГФ в почвенной суспензии 51
Лабораторные эксперименты по отбору штаммов для биоремедиации 52
Изучение миграции ГФ по вертикальному профилю и его биодеструкции в почвенной колонке 52
Биоремедиация почвы от загрязнения ГФ в полевых условиях 54
2.5. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 54
Биотестирование на дафниях 54
Изучение токсичности штаммов для теплокровных животных 55
Определение дегидрогеназной активности в почве 55
Определение биомассы аборигенной почвенной микрофлоры 56
Определение фитотоксичности 56
2.6. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 57
Глава 3. Результаты исследования 58
3.1. СОЗДАНИЕ МУЗЕЯ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ ОФ 58
Выделение, селекция и оценка деструктивной активности бактериальных штаммов 58
Условия длительного хранения штаммов 61
3.2. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА О. anthropi GPK 3 С
ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ДЕСТРУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ 63
Поиск оптимального источника углерода 63
Влияние источника азота на деструктивную активность штамма О. anthropi GPK 3 63
Влияние источника фосфора при подготовке инокулята 64
Голодание клеток штамма бактерий О. anthropi GPK 3 по фосфору 64
Исходная концентрация клеток в инокуляте 64
Продолжительность голодания инокулята 65
Эффективность деструкции ГФ в зависимости от продолжительности голодания инокулята 66
Содержание общего фосфора в клетках О. anthropi GPK 3 в динамике роста культуры 61
Определение удельной нагрузки субстрата 67
Влияние на биодеструкцию начальной концентрации ГФ 68
3.2.7. Влияние значения рН и уровня аэрации на разложение ГФ 69
3.3. СОРБЦИЯ И БИОДЕСТРУКЦИЯ ГФ В ПОЧВЕННЫХ СУСПЕНЗИЯХ 71
Построение изотерм сорбции ГФ 71
Динамика сорбция ГФ в почвенной суспензии 72
Деградация ГФ штаммом О. anthropi GPK 3 в почвенной суспензии 74
3.4. ИЗУЧЕНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ ГФ В ПОЧВЕ С ПОМОЩЬЮ ШТАММОВ-
ДЕСТРУКТОРОВ 75
Отбор штаммов для биоремедиации в условиях лабораторных почвенных экспериментов 75
Изучение деструкции глифосата в почве штаммами О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp.Kgl6 77
Биодеструкция ГФ и его распределение по вертикальному профилю в лизиметрической колонке 78
БИОРЕМЕДИАЦИЯ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ ГФ, В УСЛОВИЯХ ПОЛЕВОГО ЭКСПЕРИМЕНТА 81
ПОДБОР СТАБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ АКТИВНОЙ БИОМАССЫ ШТАММОВ-ДЕСТРУКТОРОВ 84
ДЕПОНИРОВАНИЕ И ПАТЕНТОВАНИЕ 87
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 88
ВЫВОДЫ 101
БЛАГОДАРНОСТИ 103
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 104
ПРИЛОЖЕНИЕ 121
Приложение 1 121
Приложение 2 122
Приложение 3 123
Приложение 4 124
Приложение 5 126
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АМФК - аминометилфосфоновая кислота в.с.п. - воздушно-сухая почва
ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография ГФ - глифосат, iV-фосфонометилглицин ГМ растения - генно-модифицированные растения ДГ активность — дегидрогеназная активность ДП почва - дерново-подзолистая почва КОЕ - колониеобразующие единицы МФК — метилфосфоновая кислота
НИЦ ТБП — Научно—исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов Федерального медико-биологического Агентства России ОП560 - оптическая плотность культуры, измеряемая при длине волны 560нм ОФ - органофосфонаты ПАВ - поверхностно-активные вещества ПЖА - полужидкий агар СЛ почва - серая лесная почва ТСХ - тонкослойная хроматография ТФФ - трифенилформазан
ФОВ - фосфорорганические отравляющие вещества 2-АЕР - 2-аминоэтилфосфонат, цилиатин Сж - содержание в жидкой фазе, мг/л Ст - содержание в твердой фазе, мг/кг Сорг - содержание органического углерода С-Р связь - углерод-фосфорная связь EPSPS — 5-енолпирувилшикимат-З-фосфатсинтаза GOX - глифосатоксидоредуктаза Kd - коэффициент распределения, л/кг Kf- коэффициент Фрейндлиха LB - среда Лурия-Бертани MS1 - минеральная среда
Rf- хроматографическая подвижность: длина пробега вещества/длина пробега растворителя Rt - время удерживания Т50 — период полуразложения jj. - удельная скорость роста
Введение к работе
Одним из последствий развития современной цивилизации является загрязнение окружающей среды ксенобиотиками. Среди наиболее опасных загрязнителей -органофосфонаты (ОФ), фосфорорганические соединения, характеризующиеся наличием прямой углерод-фосфорной (С-Р) связи. ОФ необычайно устойчивы к химическому и физическому воздействию из-за особых свойств С-Р связи в их структуре. ОФ входят в состав гербицидов, антибиотиков, пламегасителей, ингибиторов коррозии, часто используются как хелатирующие добавки к детергентам и являются продуктами химической нейтрализации фосфорорганических отравляющих веществ, таких как зарин, зоман, VX.
Самый известный представитель этого класса соединений, глифосат (ГФ), является основой множества гербицидов, зарегистрированных более чем в 120 странах под различными торговыми марками (Раундап, Граунд Био, Ураган, Глисол и др.). Хотя производители приводят доказательства безопасности гербицидов на основе ГФ, независимыми исследователями было показано, что ГФ изменяет почвенную экосистему, влияя на состав и активность микрофлоры, увеличивает восприимчивость культурных растений к болезням, способствует аккумулированию тяжелых металлов в водных экосистемах и оказывает вредное воздействие на гидробионтов. При попадании в организм млекопитающих он приводит к нарушениям функций ряда органов. Остаточные количества ГФ способны сохраняться долгое время в растениях, плодах, рыбе и других продуктах питания. Он может накапливаться и сохраняться в почве вследствие сорбции и миграции и сохраняться в ней в течение нескольких лет.
В такой ситуации особую актуальность приобретают способы очистки и восстановления природной среды, загрязненной ОФ. Из-за устойчивости этих соединений к физико-химическим воздействиям, внимание исследователей привлекают микроорганизмы, способные к их биодеструкции путем разрыва С-Р связи.
Как правило, при разрушении ГФ природными микробными сообществами почвы и воды происходит его трансформация до аминометилфосфоната (АМФК), по-прежнему содержащего С-Р связь. Известны лишь отдельные штаммы-деструкторы, способные минерализовать АМФК. Деструктивный потенциал и общая эффективность таких штаммов не всегда высоки, поэтому поиск и выделение новых штаммов-деструкторов, а также повышение их активности весьма актуальны, причем, в первую очередь, для создания современных биотехнологий ремедиации почвы и воды, загрязненных ГФ.
Сведения о физиологических особенностях штаммов-деструкторов ОФ ограничены. Дефицит таких знаний также сдерживает разработку технологических приемов очистки окружающей среды от ГФ, основанных на использовании потенциала природных микроорганизмов-деструкторов. Поэтому приоритетными задачами являются изучение физиологических условий проявления максимальной деструктивной активности микроорганизмов в отношении ОФ, особенно ГФ, разработка приемов повышения их потенциала и способов применения на практике.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования является разработка способа биоремедиации почв, загрязненных глифосатом.
В соответствии с этим решались следующие задачи:
Выделение и отбор штаммов-деструкторов глифосата из загрязненных почв.
Оптимизация условий культивирования штаммов-деструкторов глифосата.
Изучение взаимодействия глифосата с почвой.
Оценка деструктивной активности отобранных штаммов в почве в условиях микрокосма.
Изучение биодеструкции глифосата и изменение токсикологических показателей почвы в полевых условиях.
Изучение условий хранения биомассы штаммов-деструкторов.
Научная новизна
Из почв с многолетним загрязнением органофосфонатами выделены новые эффективные штаммы-деструкторы ГФ и метилфосфоновой кислоты (МФК). Наиболее активный из них, Ochrobactram anthropi GPK 3, был способен к росту в среде с концентрацией ГФ до 10 г/л. В отличие от многих известных штаммов отобранные нами бактерии обладали способностью минерализовать токсикант без накопления АМФК, как продукта трансформации, содержащего устойчивую С-Р связь. Показана способность штаммов-деструкторов выживать и сохранять деструктивную активность в почве при высоком уровне загрязнения ГФ, в десять раз превышающем рекомендуемые нормы применения гербицида.
Путем оптимизации условий культивирования (голодание посевного материала по фосфору, исходная концентрация ГФ, значение рН и рОг и др.) эффективность деструкции ГФ была повышена в 2,5 раза.
Впервые была проведена комплексная оценка процесса ремедиации загрязненной ГФ почвы, включающая как убыль ГФ при интродукции бактерий-деструкторов О. anthropi
GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16 с учетом сорбции и миграции токсиканта, так и изменение экотоксикологических характеристик загрязненной почвы. Показано восстановление биологической активности почвы в результате биоремедиации. Изучение биодеструкции ГФ интродуцированными штаммами, как в лабораторных, так и в полевых условиях проводилось впервые.
Практическая значимость
Создана коллекция бактерий-деструкторов, способных разрушать разные типы С-Р связи, которые могут использоваться для создания технологий очистки объектов окружающей среды от ОФ различной структуры. Микроорганизмы, отобранные для внесения в почву, непатогенны для теплокровных животных, не обладают фито- и интегральной токсичностью и могут использоваться в процессе биоремедиации без ограничений. Разработаны способы улучшения деструктивных свойств штаммов, выделенных из окружающей среды.
Подобраны стабилизаторы, внесение которых в биомассу штаммов-деструкторов позволяет сохранять их высокую деструктивную активность при комнатной температуре в течение 50 суток.
В лабораторных и полевых экспериментах доказана эффективность применения выделенных микроорганизмов, Achromobacter sp. Kg 16 и О. anthropi GPK 3, для биоремедиации почвы, загрязненной ГФ. В условиях периодического культивирования наибольшую эффективность как деструктор ГФ показал штамм О. anthropi GPK 3, тогда как в экспериментах с интродукцией штаммов в почву, особенно в полевых условиях, лучшим деструктором оказался Achromobacter sp. Kg 16. Получен акт полевых испытаний по биоремедиации почвы, проведенных на специально выделенных участках Серпуховского района Московской области в летний период 2006, 2007 гг.
Полученные сведения о процессах сорбции ГФ и его вертикальной миграции в почве, а также степени участия природного микробного сообщества в деструкции токсиканта позволяют более точно оценивать эффективность интродукции штаммов-деструкторов и риски при обработке почвы гербицидами на основе ГФ.
На основе проведенных исследований впервые разработан способ очистки почв, загрязненных ГФ (заявка на получение патента РФ № 2009105432 «Штамм бактерий Achromobacter sp. - деструктор органофосфонатов и способ его применения для биоремедиации почвы»).
Похожие диссертации на Биодеструкция глифосата почвенными бактериями
