Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Систематическое положение и экологическая характеристика шлемника байкальского 14
1.2. Ареал шлемника байкальского 15
1.3. Морфология и жизненная форма шлемника байкальского 18
1.4. Вторичные метаболиты шлемника байкальского 22
1.5. Биологическая активность флавоноидов из корней шлемника байкальского 28
1.6. История интродукции шлемника байкальского 34
1.7. Характеристика района культивирования 37
Глава 2.Материалы и методы 40
2.1. Объект исследования 40
2.2. Методы полевого исследования 40
2.3. Получение экстракта шлемника байкальского 42
2.4. Анализ флавоноидов 43
2.5. Физиолого-биохимические исследования на экспериментальных животных 46
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Условия интродукции 51
3.2. Биологические и морфологические особенности развития интродуцента 55
3.3. Семенная продуктивность и урожайность шлемника байкальского в культуре и природной популяции в зависимости от экологических условий 61
3.4. Накопление флавоноидов шлемника байкальского в условиях интродукции и природной популяции 66
3.5. Изучение процесса экстракции корня шлемника байкальского и получение сухого экстракта 71
3.5.1. Характеристика сырья 71
3.5.2. Определение оптимальных размеров частиц сырья шлемника байкальского 73
3.5.3. Тип экстрагента, соотношение массы сырья и объема экстрагента. 75
3.5.4. Время и температура экстрагирования 78
3.5.5. Получение сухого экстракта шлемника байкальского 81
3.5.6. Экстракция сырья корня шлемника байкальского УЗ методом 82
3.6. Технологическая схема получения сухого концентрата флавонои-дов сырья шлемника байкальского, интродуцированного на юге Приморского края 86
3.7. Биологическая активность сухого экстракта шлемника байкальского из интродуцированного сырья 90
3.7.1. Влияние сухого экстракта шлемника байкальского на поведенческие реакции мышей при действии ксенобиотиков 90
3.7.2. Антиоксидантная активность сухого экстракта шлемника байкальского при этаноловом гепатите 97
Выводы 100
Список литературы 101
Приложения 127
- Биологическая активность флавоноидов из корней шлемника байкальского
- Физиолого-биохимические исследования на экспериментальных животных
- Накопление флавоноидов шлемника байкальского в условиях интродукции и природной популяции
- Технологическая схема получения сухого концентрата флавонои-дов сырья шлемника байкальского, интродуцированного на юге Приморского края
Введение к работе
Лечение целебными травами всегда привлекало к себе внимание человека. Еще первобытные люди запоминали полезные свойства растений и использовали их при том или ином заболевании. Так были открыты первые лекарственные растения, а затем «аптека» наших предков постоянно пополнялась новыми растительными средствами. Сотни лекарственных растений, ранее применявшихся в народной медицине, как свидетельствуют результаты многочисленных исследований, обладают определенными лечебными качествами и вошли в арсенал медикаментозных средств, используемых в современной врачебной практике. Несмотря на появление многих синтетических препаратов, интерес к лекарственным растениям не снизился.
Рациональное использование ресурсов растительного мира является косвенной формой его охраны. Широкое использование в последние годы растительных лекарственных средств повлекло за собой увеличение объёмов заготовок, что наряду с негативным антропогенным воздействием, создает угрозу истощения запасов ряда лекарственных видов. При этом следует отметить, что из всего богатства растительного мира, включающего около 300 тысяч видов высших растений, человек использует только одну сотую часть, которые могут быть применены в виде лекарственных средств, пищевых добавок, окультурены и коммерциолизированы. Флора Дальнего Востока, используемая в качестве лекарственного сырья, представлена 1710 видами растений, из них 1500 видов высших растений, что составляет 48% от числа видов дальневосточной флоры (3100 видов). Из суммарной продукционной флоры выделяется флора лекарственных продуцентов, включающая 1100 видов [Измоденов, 2001]. Применение лекарственной флоры Дальнего Востока в официальной медицине не превышает 1% от всего видового состава; плановой заготовке подлежит всего 35 наименований сырья [Степанова, 1998]. Исследование уникальной и своеобразной флоры Дальнего Востока России и использование ее представителей в медицине, животноводстве, пищевой промышленности является в настоящее время весьма актуальным. В поиске растений, обладающих лечебным действием, используются два принципа -накопленный опыт лечебной этноботаники и ботаническое родство, заключающееся в изучении тех семейств и родов, среди которых есть представители растений с выявленным наукой биологическим или медицинским эффектом.
На современном этапе развития медицины, касающейся лекарственной терапии и профилактики заболеваний, наблюдается нарастающий на протяжении последних нескольких десятилетий кризис. Причина такой ситуации заключается в недостаточно высокой эффективности средств медикаментозной терапии и их токсическими, побочными эффектами, порой сводящими на нет все усилия врачей в деле помощи своим пациентам. Одна из основных причин кризиса кроется в том, что большинство современных лекарственных средств представляют из себя индивидуальные в химическом отношении соединения, которые по сути своей являются ксенобиотиками и чужды организму.
Не удивительно, что отношение населения к лекарственным средствам и научной медицине в целом в последнее время претерпевает существенные изменения. Опросы населения в США и странах Западной Европы свидетельствуют о том, что около 40 % респондентов в последнее время прибегают к услугам фитотерапевтов, гомеопатов и т.п. [Минина, Каухова, 2004].
БАД стремительно ворвались в жизнь современного человека, быстро нашли своего потребителя и стали уверенно конкурировать с лекарственными препаратами..В настоящее время БАД употребляют 90 % населения Японии, 80 % - США, 65 % - Западной Европы и около 20 % (по экспертным оценкам) - Российской Федерации [Нужный, и др., 2006].
БАД, получаемые из растительного сырья, довольно широко представлены в нашей стране, однако возросший интерес неминуемо ведет к истощению природных запасов растительного сырья. Так, согласно С.А. Мининой и И.Е. Кауховой [2004] процент культивируемого растительного сырья по со- стоянию на 1999 год составляет лишь 16,8 %, оставшиеся 83,2 % изымаются из дикорастущих популяций.
В медицине издавна используются представители сем. Губоцветные. Они применяются как в западной, так и восточной традиционных лечебных практиках. В семействе свыше 200 родов (около 3500 видов), распространенных повсеместно, особенно в Средиземноморье, Западной и Центральной Азии. На территории бывшего СССР - около 70 родов (почти 1000 видов). Наиболее известным и используемым с древнейших времен и по настоящее время являются роды Lavandula, Mentha, Leonums, Salvia и другие. Менее известен род Шлемник — Scutellaria L., активно применяемый в тибетской и китайской медицине. Из корней его получают настойку, обладающую гипотензивным и седативным свойствами, в народной медицине шлемник применяют при заболеваниях сердца [Базарон, Асеева, 1984; Минаева, 1991; Корр, et. al., 2003]. Отечественные фармакологи впервые обратили внимание на сведения народной медицины,о седативных и гипотензивных свойствах S. baica-lensis во время Великой Отечественной войны в связи с частыми стрессами, приводящими к возникновению неврозов и повышению артериального давления [Варлаков, 1963].
Комплексный анализ дикорастущих видов растений, в первую очередь на популяционном уровне, является принципиальным для экологически ориентированного устойчивого использования и охраны растительных ресурсов.
Ареал S. baicalensis сокращается, а в Приморье, Читинской области и Республике Саха (Якутия), растение включено в региональные Красные книги. В связи с тем, что лекарственным сырьем S. baicalensis являются корни, происходит уменьшение численности данного вида. Надземная часть шлемника изучена недостаточноі несмотря на то, что именно в ней происходят первичные этапы синтеза биологически активных веществ (БАВ) и их предшественников.
Существует несколько путей получения ценного и дефицитного лекарственного сырья: интродукция, создание искусственных плантаций, метод культуры тканей и клеток лекарственных растений.
В настоящее время у многих видов растений происходит сокращение численности и плотности популяций, изменяются границы распространения видов, обедняется флористический состав сообществ. К таким видам, в силу эколого-биологических и ценотических особенностей, относится и S. baica-lensis который реагирует на антропогенные воздействия и включен в Красную книгу России.
В связи с интенсивным освоением природных ресурсов и нарастанием антропогенного пресса (добыча полезных ископаемых, лесозаготовки, распашка земель), а также уничтожением пожарами местообитаний, актуально проведение интродукционных работ для создания устойчивой сырьевой базы и генетического резерва популяций, а также восстановления природных популяций вида. Полное и комплексное использование сырья является одной из косвенных форм охраны биологических ресурсов, отсюда следует актуальность разработки эффективных методов извлечения БАВ. Необходимым является подтверждение наличия биологической активности в интродуциро-ванном сырье.
В связи с интенсивным освоением природных ресурсов и нарастанием антропогенного пресса (добыча полезных ископаемых, лесозаготовки, распашка земель), а также уничтожением пожарами местообитаний, актуально проведение интродукционных работ для создания устойчивой сырьевой базы и генетического резерва популяций, а также восстановления природных популяций вида. Полное и комплексное использование сырья является одной из косвенных форм охраны биологических ресурсов, отсюда следует актуальность разработки эффективных методов извлечения БАВ. Необходимым является подтверждение наличия биологической активности в интродуциро-ванном сырье.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение биологических особенностей S. baicalensis в условиях культивирования и природной популяции с оценкой перспективы его выращивания в условиях юга Приморского края как источника растительных полифенолов, а также разработка методов определения качественного и количественного содержания биологически активных веществ и максимального извлечения суммы флавоноидов из сырья.
Для достижения поставленной цели исследования были определены следующие задачи: изучить биоморфологические особенности и ритм сезонного развития S. baicalensis в условиях культивирования на юге Приморского края; сравнить биоморфологические показатели, семенную продуктивность и биопродуктивность растений из природных популяций и выращенных в условиях интродукции; изучить особенности накопления байкалина и других полифенольных. соединений в подземных и надземных органах растения при выращивании в условиях юга Приморского края и природных популяциях; определить оптимальные условия экстракции флавоноидов из корней (способ экстракции, тип растворителя, соотношение сырье - экстрагент, температура и продолжительность экстракции); определить качественный и количественный состав флавоноидов в экстрактах; исследовать биологическую активность флавоноидов культивируемого & baicalensis на экспериментальных животных.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Интродуцированный S. baicalensis в условиях юга Приморского края проходит полный цикл развития с образованием полноценных семян с первого года вегетации. Природная популяция формирует семена среднего качества, что не отрицает его семенного воспроизведения.
Максимальное количество флавоноидов содержится в корнях в фазах начала и завершения вегетации у растений 3-го года интродукции. Содержание байкалина в корнях природных популяций S. baicalensis меньше, чем в интродуцентах.
Наибольшее количество флавоноидов в корнях культивируемого растения наблюдается в фазах начала и завершения вегетации. В условиях культуры накопление мажорного флавоноида — байкалина, возрастает более чем в два раза.
Корень шлемника, интродуцированного на юге Приморского края содержит сумму флавоноидов не менее 30%, из них целевого вещества — байкалина не менее 12%.
Препарат из корней интродуцированного S. baicalensis обладает выраженной биологической активностью. Выявлено антиоксидантное действие флавоноидов S. baicalensis.
Научная новизна.
Впервые проведено изучение состояния агропопуляции & baicalensis на юге Приморского края (Хасанский район, окрестности пос. Краскино) и показано, что растение характеризуется высоким содержанием байкалина и других полифенольных соединений. Изучены биологические и морфологические особенности развития интродуцента (семенная продуктивность и урожайность). Изучена динамика накопления и распределения по органам растения полифенолов в условиях юга Приморского края и научно обоснованы оптимальные сроки заготовки сырья. Впервые исследована возрастная структура природной популяции (Октябрьский район, окрестности с. Чернятино). Исследована биологическая активность полифенолов культивируемого сырья.
Практическая ценность
Разработаны методы интродукции S. baicalensis на юге Приморского края. Даны рекомендации по выращиванию и использованию интродуцента. Разработана схема экстракции без использования токсичных растворителей.
Материалы диссертации используются в технологической схеме культивирования S. baicalensis, образовательном процессе при решении вопросов экологического воспитания и образования школьников и студентов края, а также для организации просветительной работы с населением. На основании проведенных исследований, решением Государственной комиссии РФ по испытанию и охране селекционных достижений, S. baicalensis включен в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию как «Шлемник байкальский Муссон», № 51898/9155064.
Апробация работы
Результаты исследований были представлены на Всероссийской научной конференции «Состояние лесов Дальнего Востока и актуальные проблемы лесоуправления» [Хабаровск, 2009]; 10-я международной очно-заочной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых исследователей «Интеллектуальный потенциал вузов - на развитие Дальневосточного региона и стран АТР» [Владивосток, 2008], 2-я международной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений» [Казахстан, 2007]; Конференции молодых ученых [Улан-Удэ, 2007], 11-ой всероссийской конференции «Экосистемы, организмы, инновации» [Москва, 2009].
Публикации
Зорикова, СП., Маняхин, А.Ю. Сравнительный анализ надземной и корневой частей Patrinia scabiosifolia Fisch. ex Link II Экология в современном мире: взгляд научной молодежи : мат. Всеросс. конф. молодых ученых, Улан-Удэ, 24-27 апр. 2007 г. Улан-Удэ : ГУЗРЦМП МЗ РБ, 2007. С. 259-260.
Зорикова, СП., Маняхин, А.Ю., Зорикова, О.Г. Семенная продуктивность Scutellaria baicalensis Georgi II Естественные и технические науки. 2009. №3(41). С 156-158.
Зорикова, СП., Маняхин, А.Ю., Зорикова, О.Г. Коррекция нарушений, индуцируемых техногенным загрязнением, препаратами Scutellaria baicalensis, Lespedeza bicolor и Patrinia scabiosifolia II Состояние лесов Даль- него востока и актуальные проблемы лесоуправления: тез. Всерос. конф. с междунар. участием, Хабаровск, 6-8 окт. 2009 г. Хабаровск : Б.И., 2009. С. 198-200.
Зорикова, СП., Маняхин, А.Ю., Черняк, Д.М. Антиоксидантная активность экстрактов из дальневосточных растений // Естественные и технические науки, 2009. №5 (43). С.121-124.
Маняхин, А.Ю. Динамика накопления флавоноидов шлемника байкальского, интродуцированного на юге Приморского края // Экосистемы, организмы, инновации: тез. 11-ой Междунар. конф., Москва, 24 июн. 2009 г. М. : МГУ, 2009. С. 43.
Маняхин, А.Ю. Разработка технологий выделения биологически активных веществ // X Междунар. очно-заочная науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых исследователей Интеллектуальный потенциал вузов - на развитие Дальневосточного региона и стран АТР — Владивосток, 24 апр. 2008 г. Владивосток : ВГУЭС, 2008. кн. 2. С. 46-47.
Маняхин, А.Ю., Зорикова, СП., Зорикова, О.Г. Динамика накопления флавоноидов в корнях шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georgi II Естественные и технические науки, 2009. №3 (41). С 159-163.
Маняхин, А.Ю., Зорикова, СП., Зорикова, О.Г. Динамика накопления и распределение флавоноидов в органах шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georgi II Вест. КрасГАУ., 2009. № 11. С 79-83.
Маняхин, А.Ю., Зорикова, СП., Зорикова, О.Г. Растительные препараты как корректоры влияния электромагнитных излучений // Состояние лесов Дальнего востока и актуальные проблемы лесоуправления : тез. Всерос. конф. с междунар. участием, Хабаровск, 6-8 окт. 2009 г. Хабаровск : Б.И., 2009. С217-219.
Благодарности
Автор выражает глубокую признательность и искреннюю благодарность за оказанную помощь в постановке экспериментов и оказании консультаций М.Н. Чипизубовой (Тихоокеанский институт географии ДВО РАН), сотруд- никам компании Юбиком за любезно предоставленную возможность проведения экспериментов на интродукционных участках, Гороховой СВ., Хаси-ной Э.И. за помощь в написании работы, и всем сотрудникам лаборатории лекарственных растений Горнотаежной станции ДВО РАН.
Структура диссертации и ее объем
Работа изложена на 134 страницах, содержит 22 рисунка, 18 таблиц и 6 приложений. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, списка используемой литературы (259 источников, в том числе 162 на русском языке и 97 на иностранных).
Биологическая активность флавоноидов из корней шлемника байкальского
Флавоноиды не являются эндогенными веществами для животных организмов, но при этом они являются жизненно необходимым нутриентом [Murray, 1994]. Флавоноиды нетоксичны, и являются постоянными элементами диеты человека [Harborne, 1986; Pierpoint, 1986].
В настоящее время известны данные о метаболизме флавоноидов в организме человека, традиционном использовании этого растения при некоторых заболеваниях печени, а так же в качестве мочегонного препарата [Lai, et al, 2003; Tajiri, et al, 1991; Tsumura, 1991].
Гликозиды флавоноида гидролизируются в организме кишечной микрофлорой [Hackett, 1986; Kim, et al., 2007]. Множественные исследования показали, что байкалин и байкалеин в нативной форме не всасываются в кровь. Однако, уровень агликона байкалеина в плазме, достигал максимума дважды: первый через 2-4 часа и второй через 12 часов после приема. Более ранний пик, полагают, был инициирован поглощением байкалеина, второй пик представляет байкалеин, извлеченный из байкалина кишечной микрофлорой. В течение следующих 24 часов байкалеин все еще обнаруживался в плазме приблизительно в количестве 3 мкг/мл, это ниже раннего пикового уровня составляющего 6 мкг/мл [Nishioka, et al., 1992].
Флавоноиды S. baicalensis были выделены из желчи и мочи. Выводимые с желчью флавоноиды могут пройти вторичное всасывание в тонком кишечнике. Это необходимо учитывать при терапевтическом использовании флавоноидов для определения дозировки. Негидролизируемый байкалин был обнаружен в моче человека спустя 0,4 часа после инъекции [Ross, Kasum, 2002; Tang, et al., 1992], это показывает, что, по крайней мере, некоторая часть байкалина выделилась почками неповрежденной. Многие ткани организма в состоянии усваивать флавоноиды, особенно в этом активна ткань печени [Li, et al., 1993; Walle, 2004]. В эксперименте на животных моделях показано, что кишечная стенка и почки также являются местами активного метаболизма флавоноидов [Hackett, 1986; Walle, 2004], при этом флавоноиды не накапливаются в организме [Li, et al., 1993; Peterson, Dwyer, 1998].
Исследования, проведенные в середине 20 века, показали, что эффективность применения корней S. baicalensis в качестве седативного средства была выше, чем при использовании препаратов пустырника и валерианы лекарственной [Думенова, 1946, 1959]. При этом большинство авторов связывает гипотензивное и седативное действие препаратов S. baicalensis, главным образом, с воздействием на блуждающий нерв при сохранении функции парасимпатических ганглиев [Желнович, Марина, 1959; Саратиков, 1946; Вершинин, Яблоков, 1946; Яблоков, Воронова, 1949; Havsteen, 2002].
Однако потребности Министерства здравоохранения СССР в препарате не удовлетворялась вследствие необеспеченности дикорастущим сырьем, отсутствии объективных методов контроля качества сырья, устаревшей технологии производства настойки [Гольдберг, и др., 1994], что повлекло исключение настойки S. baicalensis из номенклатуры лекарственных средств решением Фармакологического комитета МЗ СССР [Государственный..., 1982]. Согласно перечню лекарственных средств, зарегистрированных и внесенных в Государственный реестр лекарственных средств и разрешенных к медицинскому применению в Российской Федерации (по состоянию на 28 октября 2008 г.) препараты из корня шлемника байкальского по прежнему отсутствуют [Перечень..., 2008].
На современном этапе фармакологических исследований изучены некоторые механизмы действия препаратов S. baicalensis. Флавоноиды шлемника обладают антиоксидантными свойствами [Gabrielska, et al., 1997; Heim, et al., 2002; Mo-rimoto, 1997], способствуют элиминации свободных радикалов и снижению уровня активных форм кислорода [Gao, 2001; Jiang, 1997; Zhang, et al., 2003].
S. baicalensis модулирует воспалительный процесс, действуя на липок-сигеназу в арахидоновом кислотном метаболизме [Cotran, et al., 1989; Kim, et al., 2009]. Исследования на животных подтверждают, что традиционное использование сырья шлемника уменьшает местное воспаление. Пероральные дозы 70-процентного извлечения корня и чистых элементов байкалеина, бай-калина и вогонина показали, дозозависимое действие на мышечные судороги, вызванные воздействием уксусной кислоты, также байкалин и байкалеин уменьшали отёк, вызванный каррагенановой инъекцией, в то время как, во-гонин не проявлял эффекта [Chi, et al., 2003; Kubo, et al., 1984]. Позднейшие исследования, подтвердили установленный эффект байкалеина в дозе 200 мг/кг [Butenko, et al., 1993]. Байкалеин, байкалин и вогонин в дозе 100 мг/кг каждый, а также экстракт корня в дозе 500 мг/кг при пероральном применении не предупреждали воспалительный грануломатоз, вызванный подкожной имплантацией хлопковых шариков у мышей [Kubo, et al., 1984]. Таким образом, S. baicalensis не эффективен против этого типа воспаления.
Разрушение кости при хроническом артрите, вызванном инъекцией Mi-cobacterium butyricum, уменьшалось у крыс, принимающих ежедневно орально извлечения корня, так же как и чистые флавоноиды байкалеин, байкалин, и вогонин, по сравнению с контролем [Kubo, et al., 1984]. Байкалеин проявлял эффект в сокращении хронического воспаления на этой модели, что подтвердилось позже, помимо того, крысы получавшие байкалеин, прибавляли в массе, другие подобные байкалеину вещества вызывали токсикозы.
Широкое антибактериальное действие препарата S. baicalensis может замедлить развитие инфекционного процесса прямым разрушением метаболитов и инфекционных агентов, включая множество вирусов, ретровирусов, бактерий, грибов [Chu, et al., 2007; Konoshima, et al., 1992; Nagai et al.,1992; Speeding, et al., 1989; Tsao et al., 1982].
Повышенный интерес вызывают исследования адаптогенных свойств шлемника. У крыс подвергшихся стрессу измерили гормональные параметры, включающие адренокортикотропный гормон, инсулин, а также мочевину и глюкозу, они были нормализованы путем применения целого растения или байкалина [Юдинцев, и др., 1991].
Физиолого-биохимические исследования на экспериментальных животных
В работе использовали 80 белых беспородных половозрелых мышей-самцов массой 20-25 г, 63 беспородных крыс-самцов, с исходной массой тела 140-160 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария на стандартном пищевом рационе (ООО «Лабараторкорм», Россия) при свободном доступе к воде и естественном световом режиме с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах [European..., 1986] и разрешения комиссии по биомедицинской этике при ГТС ДВО РАН. При разделении животных на группы проводили ранжирование по массе тела и возрасту.
Техногенное загрязнение моделировали на животных, для этого добавляли в пищу в течение 20 дней по 1 г на особь измельченных листьев липы (ТШа amurensis Rupr.) из двух разных районов г. Владивостока с различным уровнем техногенного загрязнения (ТЗ). Листья липы в данном случае выступали как носитель ТЗ, связанных с тем районом, где собраны листья. По данным «Ежегодного доклада о состоянии окружающей среды на территории Приморского края: отчет УГМС ПК» [2008], уровень загрязнения в районе с минимальной техногенной нагрузкой (Ботанический сад) составлял по значению индекса загрязнения атмосферы (ИЗА) величину 2,58, тогда как в районе с максимальной техногенной нагрузкой (Луговая) значение ИЗА составлял [Ежегодный...,2008]. Животные были разделены на 4 группы по 10 особей в каждой. В 1-ой (контрольной) группе животным в пищу добавляли листья липы из района с минимальным техногенным загрязнением; во 2-й контрольной группе - в пищу добавляли листья липы из района с максимальным техногенным загрязнением; в 3-й опытной группе — в пищу добавляли листья липы из района с максимальным техногенным загрязнением + сухой экстракт S. baicalensis (10мг/кг); 4-й опытной группе в пищу добавляли листья липы из района с максимальным техногенным загрязнением + препарат сравнения 1 мл/кг. Препаратом сравнения выступал ранее изученный в нашей лаборатории экстракт патринии скабиозолистной (Patrinia scabiosifolia Fisch. Ex Link.) [Зорикова, Хасина, 2005].
Алкогольный гепатит вызывали у животных введением в желудок 40% этилового спирта по 0,7 мл на 100 г массы животных 1 раз в сутки в течение 21 дня [Мансурова, Олимова, 1985]. Животным опытной группы вводили в желудок СЭШБ в дозе 10 мг/кг в водном растворе объема 1мл, 1 раз в день на протяжении 21 дня. Интервал между введениями СЭШБ и этанола соответствовал 5-6 часам. Животные интактной группы получали в соответствующем объеме дистиллированную воду. Декапитацию животных под эфирным наркозом проводили на 7, 14 и 21-е сутки эксперимента.
О степени антиоксидантной эффективности средств судили по следующим показателям: активность ПОЛ контролировали посредством определения содержания малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови и гомогенате печени по методу И. Д. Стальной и Г. Г. Гаришвили[1977]. Ката-лазную активность сыворотки крови определяли методом Г.А. Бабенко, М. Н. Гайнацкого [1976]. Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием критерия Стьюдента.
Для исследования ориентировочно-двигательной активности (ОДА) применяли тест «открытое поле» (ОП) [Островский, и др., 1991; Anderson, 1991; Саркисова, и др., 1996]. Открытое поле представляет собой круглую площадку диаметром 63 см, расчерченную тремя концентрическими окружностями, находящимися на равных расстояниях друг от друга, и восемью диаметрами, по окружности ограниченна непрозрачными стенками серого цвета высотой 32 см (ООО «НІЖ Открытая наука», Россия) (рис. 7).
В поведении животного выделяли следующие визуально идентифицируемые поведенческие акты: пересечение диаметров (пробеги), пересечение окружностей (переходы), число актов груминга и замирания, число стоек с опорой на стенки и без опоры. После 5 минут исследования животное возвращали в клетку и тщательно протирали арену после каждого тестирования мыши [Буреш, 1991].
Способность животных справляться со стресс факторами оценивали на приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ) (рис. 8). Тест позволяет изучить поведение грызунов в условиях переменной стрессогенности (при свободном выборе комфортных условий), оценить уровень тревожности лабораторных животных, вызванный новизной обстановки, открытым пространством и высотой, а так же их способность справляться со стресс-факторами. Метод исследования поведения в ПКЛ основан на безусловнорефлекторном страхе падения с высоты и открытых пространств у грызунов [Dawson, Trick-lebank, 1995]. Время, проведенное в открытых рукавах ПКЛ, обратно пропорционально уровню тревожности. Таким образом, чем выше показатель предпочтения открытых рукавов лабиринта закрытым, тем ниже уровень тревоги у животных и наоборот [Воронина, Островская, 1998].
Накопление флавоноидов шлемника байкальского в условиях интродукции и природной популяции
Природная популяция находилась в окрестностях с. Чернятино (43 57,610 с.ш. 131 32,09 Г в.д., высота над уровнем моря 125 м), Октябрьского района. Злаково-полынное дубовое редколесье. Проективное покрытие травостоя 100%, высота травостоя 30 — 100 см. Доминируют виды: дуб монгольский {Quercus mongolica Fisch. Ex Ledeb.), полынь Гмелина (Artemisia gmeli-nii Web. Ex Stechm.), злаки, кровохлебка аптечная (Sanguisorba officinalis L.), володушка козелецелистная {Bupleuriim scorzonerifolium Willd.), ш. байкальский {Scutellaria baicalensis Georgi.), василистник малый (Thalictrum minus L.). Почва: мелко-щебенистая.
Семенная продуктивность - один из показателей адаптации вида к конкретным условиям обитания, определяющий возможность внедрения новых видов и сортов, ранее не произраставших в данном регионе [Некрасов, 1980]. Известно, что семенная продуктивность зависит от комплекса внутренних и внешних факторов. К внутренним факторам, в первую очередь, относится генотип особи, обуславливающий число семяпочек в завязи, гормональный баланс, транспорт некоторых элементов, к внешним факторам - погодные условия конкретного сезона и агрофон [Левина, 1980]. Потенциальная и реальная семенная продуктивность, а также коэффициент продуктивности отражают соответствие биологических свойств популяции и условий обитания.
За элементарную единицу анализа семенной продуктивности выбрали генеративный побег. Для S. baicalensis выделяли следующие элементы семенной продуктивности: число генеративных побегов на особь, число цветков первого, второго и третьего порядков на генеративный побег, число семян, собранных с соответствующих особей.
Для семенной продуктивности шлемника значимы погодные условия в течение вегетационного периода. В условиях культуры, при благоприятных погодных условиях семенная продуктивность увеличивается, в случае неблагоприятных — уменьшается [Бухашеева, 2000]. Для вегетационного сезона 2008 г зафиксированы следующие показатели: среднее число семян в коробочке 2,7 ± 0,005, среднее число генеративных побегов на 1 растение 6,73 ± 0,03. Потенциальная семенная продуктивность интродуцированного S. baica-lensis на 1 генеративный побег составляет 251,25 ± 14,6 шт., реальная — 168,99 ± 11,9. Наличие полноценных семян — один из основных показателей соответствия условий произрастания биологическим потребностям вида. Это положение подтверждается высоким коэффициентом семенной продуктивности интродуцента, который равен 67%, что свидетельствует о хорошей адаптации вида к условиям интродукции.
В природной популяции в вегетационный период 2008 г среднее число семян в коробочке равно 2,2 ± 0,005, число генеративных побегов на 1 растение 4,32 ±0,03. Потенциальная семенная продуктивность природной популяции S. baicalensis составляет 123,76 ± 10,3 шт., реальная - 64,8 ± 15,7 шт. Коэффициент семенной продуктивности в природной популяции несколько ниже чем в культуре и составляет 52,4%, что согласуется с данными приводимыми Ю.А. Бухашеевой [2000] для Бурятии.
При интродукционных исследованиях большое значение имеет исследование морфологии и биологии прорастания семян. Семенная продуктивность - количественная характеристика семян, в то время как качественной характеристикой семян является всхожесть. Прорастание семян - переход семени от состояния покоя к вегетативному росту зародыша и формирующегося из него проростка. Качество семян определяется размерами семян, массой 1000 штук семян и проверкой на всхожесть.
Известно, что генеративные растения природных популяций имеют более мелкие семена, чем интродуцированные семена того же возрастного состояния [Банаева, 1998]. Исследования проведенные Ю. А. Банаевой [1998] для природных приморских популяций S. baicalensis показали, что размер семян составлял 2,00 - 2,10 мм; масса 1000 шт. семян 1,25 - 1,39 г. Наши исследования природной популяции обнаружили: величина семян составляет 1,8±0,01 мм; масса 1000 шт. семян 1,27±0,05 г, что достаточно близко к вьь шеприведенным литературным данным. Для исследуемой агропопуляции аналогичные показатели равны, соответственно: 2,35 ± 0,01 мм и 1,83 ± 0,03г, что согласуется с указанным наблюдением. Установлено в результате интродукции линейные размеры семян возросли на 30,6%, вес - 44,1%.
Для установления ценности семян как посевного материала проведены опыты по определению лабораторной всхожести семян.
Семена, собранные в 2007 г, проверяли в год сбора и спустя год. Чистота семян равна соответственно 97,4% и 98%, достаточно высока, что возможно определялось грамотным проведением агротехнических работ в необходимые фенологические фазы.
При температуре 25 С прорастание семян начинается на 3-й сутки после закладки. Энергия прорастания семян на 5-й день в группе без периода покоя составила 37%, у семян годовой выдержки - 32%, лабораторная всхожесть на 10-е сутки равнялась, соответственно 52 и 41%. Для природных приморских популяций Ю.А. Банаева [1998] указывает максимальную лабораторную всхожесть 45% для свежих семян. Анализ значений энергии прорастания и всхожести семян S. baicalensis показал, что при хранении указанные показатели несколько снижаются, приближаясь к показателям природных популяций.
Урожайность - один из показателей адаптации вида к конкретным условиям обитания, определяющий возможность внедрения новых видов и сортов, ранее не произраставших в данном регионе [Некрасов, 1980].
Нами была определена урожайность надземных и подземных частей S. baicalensis на трех интродукционных площадках. Наибольшая плотность ге-неративных особей шлемника отмечена на п. 3 — 21,6 экз/м , но при этом эксплуатационный запас корней на данном участке является самым низким 712,8 кг/га, надземной части 1468,8 кг/га. Максимальная урожайность корней приходится на п. 2 — 7475,3 кг/га (плотность посадки 13,4 экз/м"), на п. 1 — 3200,0 кг/га (плотность посадки 18,6 экз/м"), надземной части 3280 кг/га и 1143,2 кг/га соответственно.
Технологическая схема получения сухого концентрата флавонои-дов сырья шлемника байкальского, интродуцированного на юге Приморского края
В настоящее время, для введения в биологически активные добавки к пище, рекомендуют использовать обогащенные экстракты, содержание бай-калина в которых может составлять до 80-90%. Это позволяет снизить прием БАД до одной капсулы или таблетки в день, использовать точно рассчитанную дозировку биологически активных веществ и тем самым гарантировать их применение для потребителя [Комарова, и др., 2006].
С любезного предложения технологической лаборатории Unigen Korea, дочерней фирмы корпорации Econet, была предоставлена для апробации на сырье интродуцента технологическая схема получения концентрата флаво-ноидов (рис. 21).
Все ранее подобранные оптимальные параметры процесса экстракции были введены в основу балансовой загрузки, на основании которой проводилась апробация предложенной схемы.
В качестве сырья для приготовления сухого концентрата флавоноидов служили корни S. baicalensis 3-го года вегетации, собранные в фазу окончания вегетации (3-я декада октября) на интродукционной площадке ОАО «Юбиком» п. Краскино. Заготовка и хранение сырья осуществлялись на базе ОАО «Юбиком» следующими методами: механическое вскапывание при помощи трактора, ручной сбор, воздушно-теневая сушка, хранение в хлопчатобумажных мешках в проветриваемом помещении [Положий, и др., 1988]. Растительное сырье измельчали на мельнице для размола сухих проб (ЛЗМ) до размера частиц не более 1 мм. Размер частиц контролировали с помощью набора сит. После измельчения 1050 г сырья, расчетно содержащего 234,96 г суммы флавоноидов в пересчете на байкалин, получено 1000 г измельченных корней, расчетно содержащих 233,75 г суммы флавоноидов в пересчете на байкалин. Потери сырья при измельчении составляют 50 г, или 4,76 %. Выход на стадии 95,24 %. На всех стадиях технологического процесса велось количественное определение суммы флавоноидов в пересчете на байкалин - стандарт. Экстрагирование и выделение суммы флавоноидов из водного экстракта корня S. baicalensis проводилось по следующей схеме: Измельчение растительного сырья Получение суммы экстрактивных веществ Получение целевого концентрата Нарушение процесса технологии может быть вызвано применением сита с отверстием иного диаметра, чем 1 мм. В случае использования сит боль- шего диаметра, в процесс включается сырье с частицами крупного размера, что приводит к снижению выхода экстрактивных веществ. При применении сит с,меньшим диаметром отверстий, мелкие частицы сырья затрудняют вакуум-фильтрацию экстракта. Экстракцию суммы экстрактивных веществ из измельченного сырья проводили в экстракторе. Загружали 1000 г измельченных корней S. baicalen-sis, заливали 20 л очищенной воды 2-го типа (соотношение сырье : экстрагент — 1:20). Экстракцию проводили при температуре 65 С в течение 3 часов, периодически перемешивая содержимое экстрактора с помощью магнитных мешалок.
По окончании экстракции получали первый экстракт в количестве 16 литров. Затем проводили вторичную (следовую) экстракцию, заливая в экстрактор экстрагент в объеме, равном объему изъятого экстракта. Следовую экстракцию проводили УЗ методом с соблюдением вышеприведенных разработанных параметров в течение 30 минут.
При нарушении технологических параметров возможны следующие явления; проведение экстракции при температуре ниже 65 С приводит к снижению степени извлечения экстрактивных веществ из растительного сырья и, соответственно, снижению выхода целевых веществ. Аналогичный результат возникает при сокращении времени экстракции и уменьшении количества экстрагента. В случаях возникновения подобных нарушений необходимо повторное проведение экстрагирования целевых веществ из сырья ин-тродуцента.
Первый и второй экстракты последовательно, по мере их получения, проводили через вакуум-фильтрационную систему в колбу Бунзена из толстостенного стекла.
Суммарный экстракт (32 литра) перемещали в реактор, где при постоянном перемешивании и контроле рН-метром, с помощью гидроксида натрия доводили кислотность среды до рН 8. Одним из критериев достаточности защелачивания среды является быстрое потемнение окраски экстракта.
Далее при нагреве экстракта до температуры 65 С, постоянном перемешивании и контроле рН-метром, действием серной кислоты изменяли кислотность среды до рН 2. Критерием достаточности является изменение цвета экстракта на желтый. Дальнейшее нагревание смеси в течение 1 часа при водит к выпадению флавоноидов в виде осадка желтого цвета. В течение 12 часов проводили отстаивание осадка, затем осадок отфильтровывали, энергично промывали 2-3 раза и сушили на сублимационной сушке Martin Christ ALPHA 1-2 (t= -55 С, P= 0,007 мбар).
В результате переработки 1050 г измельченного сырья корня интроду-цента, было получено 220 г сухого концентрата флавоноидов, что достаточно близко к расчетным показателям — 234,96 грамм.
Сухой концентрат флавоноидов & baicalensis представляет собой зеленовато-желтый гомогенный порошок без запаха, с горьким вкусом. Порошок гигроскопичен, комкуется. Исследование качественного и количественного состава концентрата (табл.15, прилож. 5), показало наличие всего спектра идентифицируемых флавоноидов, как гликозилированных, так и агликонов. Количество суммарных флавоноидов составляет 94,7% для образца 1, и 94,8% для образца 2, что говорит о высокой чистоте полученного продукта. При этом, содержание байкалина в обоих случаях несколько превосходит корпоративные требования «Unigen Korea» — не менее 70%.
