Содержание к диссертации
Введение
1 Шлемник байкальский как источник биологически активных веществ 10
1.1 Ареал и экология Scutellaria baicalensis Georgi 10
1.2 Биологически активные вещества Scutellaria baicalensis Georgi 14
1.3 Фармакологические и клинические исследования препаратов Scutellaria baicalensis Georgi 20
1.4 Исследование способов культивирования Scutellaria baicalensis Georgi 26
2 Объект и методы исследования 32
2.1 Ботаническая характеристика шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) 32
2.2 Физико-географическая характеристика района интродукционных исследований 37
2.3 Методы исследования 40
2.3.1 Методы интродукционных исследований и in vitro 40
2.3.2 Аналитические методы 47
2.3.3 Методы обработки данных 57
3 Морфобиологические особенности Scutellaria baicalensis Georgi При интродукции 58
3.1 Ритм роста и сезонного развития разновозрастных особей Scutellaria baicalensis Georgi 58
3.2 Морфологические особенности Scutellaria baicalensis Georgi 70
3.3 Особенности семенного размножения Scutellaria, baicalensis Georgi 77
4 Культура ткани шлемника байкальского 91
4.1 Введение Scutellaria baicalensis Georgi в культуру in vitro 91
4.2 Особенности каллусной культуры Scutellaria baicalensis Georgi 96
5 Биологически активные вещества Scutellaria baicalensis Georgi При интродукции и в культуре in vitro 104
5.1 Исследование содержания аскорбиновой кислоты в интактных растениях Scutellaria baicalensis Georgi и в каллусной культуре 104
5.2 Динамика накопления Сахаров в интродуцированных растениях шлемника байкальского 112
5.3 Исследование динамики накопления дубильных веществ Scutellaria baicalensis Georgi при интродукции 117
5.4 Особенности накопления флавоноидов шлемника байкальского при интродукции и в каллусной культуре 120
Выводы 131
Список использованной литературы 133
Приложения 166
- Ареал и экология Scutellaria baicalensis Georgi
- Фармакологические и клинические исследования препаратов Scutellaria baicalensis Georgi
- Ритм роста и сезонного развития разновозрастных особей Scutellaria baicalensis Georgi
- Особенности каллусной культуры Scutellaria baicalensis Georgi
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время растительное сырьё служит источником более трети всех лекарственных средств (Завражнов, 1993). Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi) семейства яснотковых (Lamiaceae Lindl.) - одно из древнейших растений традиционной медицины Китая, Монголии, Японии, Кореи, Дальнего Востока (Базарон и Асеева, 1984; Минаева, 1991; Корр, а. о., 2003). Ареал данного вида сокращается, а в Приморье, Читинской области и Республике Саха (Якутия) шлемник байкальский включен в региональные Красные книги. В связи с тем, что лекарственным сырьем S. baicalensis являются корни, происходит уменьшение численности данного вида. Надземная часть шлемника байкальского изучена недостаточно, несмотря на то, что именно в ней происходят первичные этапы синтеза биологически активных веществ (БАВ) и их предшественников.
Существует несколько путей получения ценного и дефицитного лекарственного сырья: интродукция и создание искусственных плантаций; метод культуры тканей и клеток лекарственных растений. Промышленные культуры, по сравнению с ресурсными заготовками гарантируют компактность размещения площадей, получение лекарственного растительного сырья стандартного качества, значительное увеличение биомассы растений в сочетании с высокой концентрацией БАВ. Технология in vitro позволяет получать экологически чистое сырьё круглый год, независимо от климатических условий и трудностей сбора сырья, увеличивать выход БАВ, регулируя их накопление в культуре. Учитывая особенности данных путей получения БАВ, представляет интерес исследование фитохимических особенностей S. baicalensis при интродукции и в культуре in vitro.
Целью настоящей работы было исследование морфобиологических особенностей и динамики накопления биологически активных веществ
S. baicalensis при интродукции и в культуре in vitro. Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:
Исследовать ритм роста и развития разновозрастных растений S. baicalensis;
Определить степень изменчивости и взаимосвязи морфологических признаков при исследовании надземной части шлемника байкальского в условиях интродукции;
Изучить некоторые особенности репродуктивной биологии S. baicalensis при интродукции: длительность цветения соцветия и цветка, фертильность пыльцы; семенную продуктивность (СП) и качество эремов, как показателей степени адаптации семенного размножения данного вида к конкретным условиям;
Получить каллусную культуру шлемника байкальского, исследовать динамику роста каллусной культуры S. baicalensis на модифицированных питательных средах;
Выявить сезонную динамику накопления БАВ S. baicalensis (аскорбиновой кислоты, углеводов, флавоноидов и дубильных веществ) по морфологическим группам сырья;
Изучить динамику накопления аскорбиновой кислоты и флавоноидов в каллусной культуре S. baicalensis.
Защищаемые положения.
Обоснование возможности возделывания и перспективности S. baicalensis как ценного лекарственного растения в результате изучения ритмологических, морфологических, репродуктивных особенностей вида в условиях интродукции.
Накопление биологически активных веществ в надземной части шлемника байкальского является основой рационального использования лекарственного сырья данного вида.
3. Каллусная культура S. baicalensis - продуцент биологически активных веществ. Физиологически активные вещества (фитогормоны и гуминовые кислоты) значительно влияют на рост каллусной культуры шлемника байкальского и накопление в ней флавоноидов и аскорбиновой кислоты.
Научная новизна. Впервые изучены адаптационные возможности S. baicalensis при интродукции на юге Томской области и выявлены ритмологические, антэкологические и морфобиологические особенности данного вида в новых условиях произрастания. Проведено комплексное исследование динамики накопления аскорбиновой кислоты, Сахаров, флавоноидов и дубильных веществ, которое позволит расширить их физиологической роли. Впервые изучена динамика накопления аскорбиновой кислоты и влияние фитогормонов на её содержание в каллусной культуре шлемника байкальского.
Практическая значимость. Результаты настоящей работы могут быть использованы при разработке ресурсосберегающих методов сбора лекарственного сырья S. baicalensis в естественных местообитаниях и технологии возделывания его на юге Томской области. На основе анализа морфологических признаков и показателей семенной продуктивности были отобраны особи для создания высокопродуктивной агропопуляции. Результаты фитохимического исследования S. baicalensis свидетельствуют о возможности комплексного и рационального использования как надземной, так и подземной части растения для нужд фармацевтической промышленности. Каллусная культура шлемника байкальского является продуцентом аскорбиновой кислоты и флавоноидов, а также может быть основой для получения суспензионной культуры данного вида.
На экспериментальном участке Сибирского ботанического сада Томского госуниверситета создана плантация S. baicalensis, площадью 150 м. Результаты исследований используются при чтении курсов: «Биотехнология лекарственных растений», «Фитохимия», «Избранные главы биохимии».
Личный вклад соискателя. Автором проведена экспериментальная работа и интерпретация результатов. Постановка задач, решение методических проблем осуществлялось совместно с профессором, доктором биологических наук Р.А. Карначук, старшим научным сотрудником СибБС ТГУ кандидатом биологических наук Т.Г. Хариной.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на молодежной конференции «Исследования молодых ботаников Сибири» (Новосибирск, 2001); Международном совещании «Проблемы охраны растительного мира Сибири» (Новосибирск, 2001); XI Съезде русского ботанического общества «Ботанические исследования в Азиатской России» (Новосибирск, 2003); VI Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004); III Молодежном научном семинаре «Биоразнообразие природных и антропогенных экосистем» (Екатеринбург, 2004); VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино-на-Оке, 2005), XII Международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология» (Алушта, Украина, 2005); Международной конференции, посвященной 60-летию Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН «Ботанические сады как центры сохранения биоразнообразия и рационального использования растительных ресурсов» (Москва, 2005); III Международной конференции, посвященной 120-летию Гербария им. П.Н. Крылова Томского государственного университета (Томск, 2005) V Международной научно-практической конференции «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2006), VII Открытой окружной конференции молодых ученых «Наука и инновации XXI века» (Сургут, 2006), Заочной электронной конференции Российской Академии Естествознания (Москва, 2006 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, 1 статья в ведущем научном журнале из перечня ВАК.
Структура диссертации и её объем. Диссертационная работа изложена на 175 страницах, содержит 30 рисунков, 11 таблиц и 9 приложений. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 332 источников, из них 206 отечественных и 126 иностранных.
Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям профессору, д-ру биол. наук, Р.А. Карначук и старшему научному сотруднику СибБС, канд. биол. наук Т.Г. Хариной за внимательное и чуткое отношение, помощь в интерпретации полученных результатов исследования.
Искренне признательна доценту, канд. биол. наук Р.И. Лещук за консультации при освоении методик фитохимического анализа и за моральную поддержку на протяжении всего периода исследований.
Благодарю доцента канд. биол. наук, С.В Пулькину за помощь в освоении методик по определению фертильности пыльцы; канд. мед. наук Е.Н. Амосову за предоставленный метчик байкалеина, профессора д-ра хим. наук, В.И. Литвиненко за предоставленный ГСО байкалина; сотрудников и студентов кафедры физиологии растений и биотехнологии ТГУ, лаборатории лекарственных растений СибБС ТГУ.
Ареал и экология Scutellaria baicalensis Georgi
По данным «Атласа ареалов и ресурсов лекарственных растений СССР» (1976) шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi) имеет монгол о-даурско-маньчжурский тип ареала. Протяженность ареала с запада на восток превышает 1500 км, а с севера на юг - 1000 км. Материковый ареал S. baicalensis монолитный, сплошной, но имеет сложную конфигурацию. На территорию Российской Федерации проникает три его выступа: северозападный (восточно-забайкальский), северный (амурский) и восточный (приморский) (Рисунок 1). Возникающая при этом дизъюнктивность ареала -кажущаяся - за пределами нашей страны эти выступы ареала соединяются в один сплошной массив, который охватывает северо-восточный Китай и северную окраину Монголии (Юзепчук, 1954). Поэтому в дальнейшем термин «фрагмент» ареала мы принимаем условно (Атлас ареалов..., 1976).
Забайкальский выступ ареала шлемника байкальского самый обширный (Рисунок 1 а). Юго-западная граница ареала проходит по юго-восточным склонам хребтов Хантея и Становика. Северный рубеж его распространения ограничен 54 северной широты и лежит в бассейнах средней Ингоды и верхней Шилки. По левобережным притокам этих рек шлемник байкальский проникает в межгорные понижения Даурского хребта и хребта Черского. Обогнув северную и восточную окраины Нерчинского степного острова, граница ареала проходит по левобережью р. Куэнги и входит в долину р. Шилки. Южное распространение S. baicalensis приурочено к верхней половине долины р. Газимура, откуда граница ареала выходит к излучине р. Аргуни, между устьями pp. Будюмкан и Урюкман Южный и заканчивается у с. Урюпино (Атлас ареалов..., 1976).
Восточный и южный рубежи распространения S. baicalensis проходят по государственной границе с Китаем и Монголией (Пешкова, 1985; Атлас ареалов..., 1976). Есть данные о нахождении шлемника байкальского в Якутии (Макаров, 1979; Красная книга Республики Саха (Якутия), 2000), единичные экземпляры отмечены около Иркутска (Телятьєв, 1987; Зуев, 1997).
В Восточном Забайкалье S. baicalensis приурочен к формации нителист-никовой степи, кроме этого он встречается в мятликовых, типчаковых, ковыльных и холоднополынных степях (Сергиевская, 1959; Дулепова, 1986). Нителистниковая степь в Забайкалье служит основным компонентом горнолесной полосы и занимает значительные площади. Западная граница распространения этих степей проходит по Ангаре (Сергиевская, 1959). Filifolium sibiricum (L.) Kitam. вместе с другими маньчжурско-даурскими степными растениями в сочетании со степными широколиственными лесами образовывали лесостепные неморальные ландшафты миоценового и плиоценового времени. Плейстоценовое похолодание климата привело к исчезновению в первую очередь широколиственных лесов на территории большей части Восточной Сибири, вместе с ними вымерли и многие маньчжурско-даурские виды; уцелели только наиболее приспособленные, такие как, Filifolium sibiricum (L.) Kitam., Scabiosa comosa Fisch. ex Roem. et Schult., Menispermum dahuricum L., Scutellaria baicalensis Georgi и некоторые другие (Пешкова 1972, 1985). Таким образом, шлемник байкальский можно рассматривать как реликт третичного периода миоцен-плиоценовых лесостепных неморальньгх ландшафтов, связанный в своем происхождении с широколиственными лесами (Пешкова, 1985).
Северный фрагмент ареала - Амурско-Зейское междуречье (Рисунок 1 б), где S. baicalensis распространен на остепненных склонах высоких террас pp. Амура, Зеи и наиболее крупных притоках этих рек. Самое северное нахождение шлемника байкальского на Амуре - с. Черняево. Кроме этого S. baicalensis отмечен на водоразделах по окраине подзоны хвойно-широколиственных лесов, где граница его ареала пересекает долины pp. Малая и Большая Пера, проходит по левобережью р. Зеи. Здесь он встречается у д. Толстовка на Зейско-Буреинской равнине. Севернее Яблонового хребта шлемник байкальский встречается чрезвычайно редко (Куренцова, 1962; Пешкова, 1972; Атлас ареалов..., 1976). На Амуро-Зейском междуречье данный вид входит в состав остепененных дубрав, коренных в зоне широколиственных лесов (Куренцова, 1962; Биоморфология и продуктивность..., 1979).
Приморский фрагмент ареала расположен на Приханкайской низменности от южной оконечности оз. Ханка до долины р. Раздольная (Рисунок 1 в). Южная граница проходит от г. Уссурийска по правобережью р. Раздольная и по долинам pp. Гранитная, Борисовка до границы с Китаем на западе (Куренцова, 1968; Атлас ареалов ..., 1976). На Приханкайской низменности разнотравные и разнотравно-злаковые ценозы сохранились в основном в низкогорьях, где шлемник байкальский встречается в комплексе с порослево-кустарниковым остепененными ассоциациями (Куренцова, 1962).
В Монголии S. baicalensis встречается в Восточно-Монгольских степях и проникает в Прихинганье. Значительные заросли обнаружены в районе Хэнтэйского и Восточного аймаков, в долине р. Халхин-гол (Хайдав, Меньшикова, 1978; Грубов, 1982), отдельный фрагмент указан для Японии (Сергиевская и др., 1968). По данным японских исследователей (Niphonkoteisho Kiokay, 1986: цит. по Yamamoto, 1991), S. baicalensis интродуцирован в Японию и Корею из Китая. Другие виды шлемника S. scordiifolia Fisch. ex Schrank и S. galericulata L, произрастающие в этих районах отличаются от шлемника байкальского тонким ползучим корневищем и расположением цветов: они сидят по 2 или по одиночке в пазухах крупных стеблевых листьев (Чиков, 1982).
Фармакологические и клинические исследования препаратов Scutellaria baicalensis Georgi
Шлемник байкальский издавна применяется в китайской, тибетской и дальневосточной народной медицине. В трактате об индотибетской медицине «Джуд-ши», созданном ещё 25 веков назад, приводятся сведения о применении шлемника байкальского для лечения гипертонии (Старухин, 1978: цит. по Гольдберг и др., 1994).
В тибетской медицине S. baicalensis называли «хон-ленг», однако в прописях встречаются ещё семь названий (Асеева и др., 1985). Согласно трактату «Вайдурья-Онбо» это растение применяли для лечения органов пищеварения, при «жаре внутренних органов», болезнях крови и лихорадке, отмечали, что он «подсушивает кровь и врачует жар и жар плотных органов». В медицине Тибета известны 42 прописи, в состав которых входит трава и корни S. baicalensis (Поздиев, 1908: цит. по Соболева, 1946; Базарон и Асеева, 1984; Асеева и др., 1987).
В Китае корни этого растения или «хуан-цзын» (Huang-Qin) назначали как общеукрепляющее, противосудорожное, жаропонижающее, кровоостанавливающее средство (Ибрагимов и Ибрагимова, 1960). Две тысячи лет назад травой шлемника байкальского китайские лекари лечили дизентерию и другие заболевания желудочно-кишечного тракта, респираторные заболевания (Huang а. о., 2005).
В Японии его назвали «Wogon» и применяли для лечения кожных заболеваний, в качестве косметического средства для отбеливания кожи лица (Корр а. о., 2003), при кровотечениях (Kubo а. о., 1981). В Корее его использовали при респираторных заболеваниях, хронических бронхитах и скарлатине (Lee а. о., 2000). В Забайкалье и на Дальнем Востоке трава и подземная часть данного вида употреблялась в виде чая или отвара (Минаева, 1991). Шлемник байкальский применяли также при миокардите, остром ревматизме, бессоннице, гепатите, диарее, эпилепсии, хорее, при острых и хронических воспалениях кишечника, мочевого пузыря и мочевыводящих путей, при простудных заболеваниях и гриппе (Ибрагимов и Ибрагимова, 1960; Волынский и др., 1967; Фруентов, 1987; Минаева, 1991, Гольдберг и др., 1994).
Во время Великой Отечественной войны проблема лекарственного сырья в нашей стране приобрела огромное значение. Культурой лекарственных растений занимались преимущественно на европейской, территории СССР, сбор ряда растений дикорастущей флоры было затруднительным, а импортное сырье - очень дорогим. По этим причинам группой ученых Томского государственного университета (В.В Ревердатто, К.Т. Сухоруковым и Л.П. Сергиевской) и Томского мединститута (Н.В. Вершининым и Д.Д. Яблоковым) проводился поиск и изучение лекарственных растений Сибири (Ревердатто, 1946), одним из которых был шлемник байкальский. В России впервые & baicalensis экспериментально изучался в фармакологической лаборатории Томского мединститута под руководством проф. Н.В.Вершинина (1940-1943 гг.). Клинические испытания настойки из корней шлемника байкальского были проведены Д.Д. Яблоковым, Н.М. Вершининым, A.M. Вороновой, Е.А. Толокновой в 1943-1953 гг. (Ревердатто, 1953).
Экспериментальные исследования по выяснению действия препаратов (водных настоев и 20 % спиртовых настоек) S. baicalensis на гомойотермных и пойкилотермных животных, показали значительное гипотензивное, сосудорасширяющее действие и нормирование деятельности изолированного сердца (Думенова, 1946а; Саратиков, 1946; Воронова и Толокнова, 1946; Усов, 1958). Л.И. Желнович и Т.Ф. Марина (1959) отмечали действие препаратов травы шлемника на аппарат кровообращения, замедление кровотока и уменьшение массы циркулирующей крови. По силе гипотензивного действия препараты шлемника байкальского превосходили действие препаратов чистеца байкальского, вызывая замедление ритма сердца, уменьшение его амплитуды, особенно у животных с искусственной гипертонией (Думенова, 1946а; Вершинин и Яблоков, 1946).
Эффективность применения корней S. baicalensis как седативного средства была выше, чем при использовании препаратов пустырника и валерианы лекарственной (Думенова, 19466, 1959). Большинство авторов отмечает, что гипотензивное и седативное действие препаратов S. baicalensis связано, главным образом, с воздействием на блуждающий нерв при сохранении функции парасимпатических ганглиев (Саратиков, 1946; Вершинин и Яблоков, 1946; Яблоков и Воронова, 1949; Желнович и Марина, 1959).
Вышеприведенные экспериментальные работы дали полное основание испытать в клинике препараты S. baicalensis для лечения гипертонической болезни. Клинические испытания показали, что настойка из корней шлемника байкальского обладает выраженным терапевтическим эффектом (Воронова и Толокнова, 1946), устраняются субъективные симптомы болезни, неприятные ощущения в области сердца, головные боли (Усов, 1958).
14 мая 1955 г. Фармакологическим комитетом Министерства Здравоохранения (МЗ) СССР настойка шлемника байкальского была разрешена к применению в качестве гипотензивного средства при гипертонической болезни нервного происхождения I и II степени (Хныкина, 1963). Готовили настойку, из корней в соотношении 1:5 на 70 % спирте. Назначали по 20-30 капель 2-3 раза в день (Волынский и др., 1967; Соколов, Замотаев, 1985).
Ритм роста и сезонного развития разновозрастных особей Scutellaria baicalensis Georgi
Статистические процедуры проводили с помощью электронных таблиц «MS ЕхеІІ 2003» и пакета программ «STATISTICA 6.О.». Графические объекты обрабатывали при помощи пакета программ «Adobe Photoshop CS 8.0.»При статистическом анализе вычисляли среднее арифметическое анализируемых параметров, X, стандартную ошибку среднего, s . При исследовании объема клеток каллусной культуры вычисляли среднее кубическое (Лакин, 1980). Результаты экспериментов приведены в таблицах в виде X ±$г. На гистограммах высота столбцов характеризует среднее арифметическое, а планки погрешности - доверительный интервал при уровне доверительной вероятности Р = 0,05. Для определения уровня изменчивости признаков (Мамаев, 1969: цит по Магомедмирзаеву, 1990) при проведении морфометрического анализа вычисляли коэффициент вариации V%. При сравнивании выборок данных использовали непараметрический Манна-Уитни (U-тест) (Р 0,05), поскольку некоторые ряды данных не подчиняются законам нормального распределения (например, количество генеративных побегов, число побегов третьего порядка, объем клеток каллуса). Корреляционный анализ использовали для оценки линейной связи между количественными переменными с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмана rs.
Новая среда обитания, в которой оказываются растения при естественном расселении или при интродукции существенно влияет на все стороны онтогенеза, вызывая те или иные изменения приспособительного характера. Они приводят к изменению особенностей заложения генеративных органов, динамике их формирования, смещению сроков прохождения различных фаз морфогенеза, влияют на качество пыльцы и число семязачатков (Некрасов, 1980).
Ритм или темп сезонного роста растений - последовательное изменение таких ростовых показателей как линейные размеры генеративных и вегетативных побегов, листьев, корней, их массы, описываемые кривыми роста (Тюрина, 1978). При изучении сезонного ритма роста генеративного побега трехлетних растений в фазах вегетации и бутонизации было отмечено, что кривая роста имеет типичную S-форму (Рисунок 5 а). Среднесуточный прирост за исследуемый период в среднем был равен 0,58-0,60 см в зависимости от года наблюдений (Рисунок 5 б). Суточный прирост в период отрастания, в первой декаде июня был равен 0,15-0,32 см, во вторую декаду июня - 0,44-0,94 см. Наиболее интенсивный рост генеративных побегов наблюдали в фазе вегетации в третьей декаде июня и в первой декаде июля, суточный прирост в это время составлял 2,02-2,24 см. (Рисунок 5 а, 5 б). К началу бутонизации, во второй декаде июля происходит снижение этого показателя до 0,13-0,21 см. Начало сезонного развития растений в большей степени обусловлено влиянием факторов окружающей среды, а также наличием разных стартовых возможности, обусловленных генотипом отдельной особи.
Приостановка роста генеративного побега в конце фазы вегетации и начале фазы бутонизации начале июля связана как с развитием пазушных почек, ветвлением и формированием побегов обогащения (Серебряков, 1952), так и с образованием флоральной зоны в апикальной меристеме (Кузнецова, 1992). Развитие большого количества боковых побегов приводит к увеличению массы (Рисунок 6). В связи с этим представляло интерес изменение сырой массы надземной и подземной части растения у двух- и трехлетних растений S. baicalensis (2005 г.) в зависимости от фенологических фаз развития. Наибольшая масса подземной и надземной части растений отмечена в фазе плодоношения. Для растений шлемника байкальского, выращенных через рассаду, было характерно значительное накопление надземной биомассы, которое у двулетних достигало 59,5 ±3,8 г (Рисунок 6 а), а у трехлетних растений - 157,1 ± 8,7 г (Рисунок 6 б). По массе генеративного побега исследуемые возрастные группы растений достоверно не различались. Так у трехлетних растений масса генеративного побега составляет 13,9 ±1,3 г, а у двулетних - 15,5 ± 1,2 г. Масса подземной части растений была меньше, чем надземная: у двулетних растений она составляла 22,4 ± 1,4, а у трехлетних растений - 60,2 ± 8,2 г. Таким образом, в фазе плодоношения масса травы растений, выращенных через рассаду, превышает массу корней и корневищ в 2-2,5 раза. Масса корня двулетних растений, выращиваемых через рассаду, не уступают массе корня трехлетних растений в посевах.
При исследовании особенностей роста S. baicalensis отмечено явление снятия апикального доминирования, при котором 20 % в (2003 г.), 30 % (в 2004 г.) и 25 % (в 2005 г.) особей имеют укороченные центральные оси генеративных побегов (Рисунок 7). Снижение апикального доминирования, выражающееся в одновременном развитии главной оси и многочисленных боковых побегов, в результате чего значительно повышается кустистость растений, неоднократно отмечалось как у древесных, так и у травянистых интродуцентов в высокогорьях Альп и Памира (Кернер, 1903; Гурский и др., 1965: цит. по Головкину, 1973).
Особенности каллусной культуры Scutellaria baicalensis Georgi
Применение ГК для индукции каллусогенеза шлемника байкальского показало, что в случае стеблевых эксплантов происходит образование побегов, а каллусная ткань, образовавшаяся на местах среза, быстро темнеет (Таблица 10). С другой стороны ГК способствует каллусогенезу листового и, особенно, у корневого каллуса S. baicalensis. В связи с этим было обнаружено, что наиболее оптимальной концентрацией стимуляторов роста для индукции каллусогенеза является вариант ИУК (1 мг/л) + кинетин (0,1 мг/л) + ГК (0,1 мг/л) (Таблица 10).
Использование модифицированной питательной среды MS, содержащей 1 мг/л 2,4-Д, способствовало как потемнению, так и возникновению некрозов в каллусной культуры шлемника байкальского. Применение более низких концентраций 0,2 мг/л 2,4-Д отмечено, что они способствуют дедифференци-ровке листового каллуса, но не стеблевого и корневого. Наиболее эффективными для каллусогенеза сегментов корней шлемника байкальского были ауксины НУК и ИУК в концентрациях 0,5 и 1 мг/л, концентрация кинетина до 0,5 мг/л и ГК в концентрации 0,1 мг/л.
Таким образом, подобраны оптимальные концентрации фитогормонов для каллусообразования листовых, стеблевых и корневых эксплантах S. baicalensis. В 2004 г. были получены каллусные культуры ОП1ЛК (из листьев) и ОП1СК (из стеблевых сегментов), а в июне 2005 ОП2ЛК (из листьев), ОП2СК (из стеблевых сегментов) и ОП2КК (из корневых сегментов). Отмечено, что высокие концентрации ауксинов и гуминовых кислот приводят к побегообразованию на сегментах стеблей, а затем корнеобразованию, что нежелательно при получении каллусной культуры. С другой стороны эти вещества можно использовать для получения каллусной культуре из листьев и корней.
Каллусная культура - это неорганизованная профилирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток, она аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции - рыхлой, средней плотности, плотной (Бутенко, 1999).
После получения каллусной культуры S. baicalensis её пересаживали на модифицированную среду MS с различным содержанием ИУК и кинетина. При визуальном наблюдении за культурами было замечено, что культура ОП1ЛК светло-желтого цвета, а ОП1СК - с беловатым оттенком (Рисунок 15 а). Каллусная культура из стеблей более рыхлая, чем их листьев, а корневой каллус плотный и темный (Рисунок 15 б).
При исследовании изменения объема клеток ОП1ЛК и ОП1СК S. baicalensis отмечено, размеры клеток каллуса шлемника байкальского составляют 20-35 мкм, объем - 7000-33000 мкм3 (Таблица 11). На первых этапах культивирования клетки стеблевого каллуса на средах с относительно высоким содержанием ИУК (1 мг/л) и добавкой препарата ГК (0,1 мг/л), растягиваются, и соотношение длины к ширине клетки около 2.
Длительное выращивании листового каллуса шлемника байкальского на среде с гуминовыми кислотами было неудачным, так во время 7 субкультивирования значительная часть культуры потемнела (Рисунок 16).
При исследовании динамики ростовых процессов изучали изменение объемов клеток, изменение доли мелких, средних и крупных клеток, индекс роста, накопление воздушно сухой массы в течение 10-ого субкультивирования каллусной культуры ОП1Ж S. baicalensis (Рисунок 17) на среде MS, содержащей 0,2 мг/л ИУК и 0,2 мг/л кинетина. Было отмечено, что объемы клеток увеличивались в первые 15 суток культивирования, а затем к 20 суткам происходило резкое снижение (до 10447 мкм3). максимальное значение объема клеток каллуса установили на 25 сутки (20740 мкм3) (Рисунок 17 а). Показано, что среднее арифметическое, по сравнению со средним кубическим, дает заниженные результаты, и не может быть использовано для вычисления среднего объема клеток.
При определении долей крупных, средних и мелких клеток каллусной культуры ОП1Ж S. baicalensis было установлено, что доля мелких клеток в течение пассажа снижалось на 20 % (Рисунок 17 б). К 20 суткам происходило увеличение количества средних клеток. Доля крупных клеток в культуре шлемника байкальского невелика - от 5 % до 16%. Динамику ростовых процессов в каллусной культуре ОШЛК S. baicalensis изучали, определяя индекс роста и увеличение воздушно-сухой биомассы. Удвоение воздушно-сухой массы происходило к 20-ым суткам культивирования (Рисунок 17 в), после 25-ых суток кривая роста выходила на плато, дальнейшие изменения массы незначительны. На 15 сутки отмечали снижение воздушно-сухой массы, что могло быть связано с делением или катаболическими процессами (Рисунок 17 г). В течение 30 суток с 1 литра среды можно получить 1,27-1,41 г воздушно сухой массы каллусной культуры ОП1ЛК.
Как отмечают Н.А. Трофимова (1982) и Н. Yamomoto (1991) для роста каллусных культур шлемника байкальского, полученных из семядолей или сегментов стеблей, больше всего подходят ИУК и кинетин. Н.А. Трофимова (1982) предложила использовать высокие концентрации ауксинов - 2 иг/я. Н. Yamomoto (1991) определил оптимальный уровень содержания ИУК и кинетина в среде - 10 5-10 7 и 10"5 соответственно для культивирования стеблевого каллуса. В связи с этим мы исследовали влияние различных концентраций фитогормонов на размеры и объем клеток, индекс роста и накопление воздушно-сухой биомассы каллусной культурой из листовых эксплантов ОП2Ж S. baicalensis (Рисунок 18).
