Содержание к диссертации
Введение
1. Шлемник байкальский - источник биологически активных веществ
1.1. Химический состав 9
1.1.1. Флавоноиды шлемника 10
1.2. Фармакологическое действие 17
2 Генетически трансформированные корни перспективная система in vitro 23
3. Объект и методики исследования
3.1. Объект исследования 31
3.2. Методики исследования 33
3.2.1. Получение трансформированных корней шлемника байкальского 33
3.2.2. Определение ростовых параметров 37
3.2.3. Определение эндогенных гормонов 39
3.2.4. Определение содержания пигментов 44
3.2.5. Определение содержания флавоноидов 45
4. Характеристика ростовой активности pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника байкальского
4.1. Введение в культуру 49
4.1.1. Подбор питательной среды 52
4.2. Динамика роста в пассаже 54
4.3. Влияние различных факторов на рост культуры 61
4.3.1. Действие света 61
4.3.1.1. Формирование фотосинтетического аппарата 70
4.3.2. Влияние фенилаланина 72
4.3.3. Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты 75
5. Содержание флавоноидов в трансформированных корней шлемника байкальского
5.1. Флавоноиды и динамика их образования 79
5.1.1. Динамика образования флавоноидов 84
5.2. Влияние различных факторов на содержание флавоноидов 88
5.2.1. Влияние различных питательных сред 88
5.2.2. Действие света 90
5.2.3. Влияние фенилаланина 90
5.2.4. Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты 92
Заключение 96
Выводы 98
Список литературы 99
- Флавоноиды шлемника
- Определение содержания флавоноидов
- Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты
- Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты
Введение к работе
Актуальность проблемы. Род шлемник (Scutellaria L.) является одним из самых многочисленных в семействе Lamiaceae, он насчитывает около 360 видов растений (Paton, 1991), но к настоящему времени наиболее полно изучены химический состав и фармакологические свойства шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi). Это многолетнее растение применяется в традиционной и официальной медицине, в основном, России, Китая, Японии, Кореи и Монголии, что объясняется его ограниченным ареалом.
Спиртовая настойка корней шлемника обладает четко выраженным противовоспалительным, гипотензивным и седативным действием (Вершинин, Яб-локов, 1946; Huang, 1993). В последние годы внимание к шлемнику байкальскому особенно возросло в связи с тем, что экспериментально доказан ряд других ценных свойств экстрактов из его корней. Обнаружена антиаллергическая, антиоксидантная и противоопухолевая активность, что подтверждено клиническими испытаниями (Ryu et al., 1985; Разина и др., 1987; Konoshima et al., 1992; Гольдберг и др., 1994; Gabrielska et al., 1997; Miao et al., 1997).
Основными действующими веществами, определяющими фармакологические свойства растения являются флавоноиды.
В связи с ценными лекарственными свойствами корней шлемника байкальского, медленными темпами возобновления роста растений в естественных зарослях (5-10 лет) и сложностью получения экологически чистого сырья было апробировано введение шлемника в культуру in vitro. Сравнительно недавно были получены каллусная и суспензионная культуры шлемника байкальского (Трофимова, 1982; Yamamoto et al., 1986; Yamamoto, 1991; Seo etal., 1993), аза-тем - корневые культуры методом трансформации фрагментов проростков pRi Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes (Zhou et al., 1997; Nishikawa, Ishirnaru, 1997, Nishikawa et al., 1999). Последний способ представляет наибольшую ценность для выращивания больших масс корней шлемника, так как в этом случае корни культивируются на безгормональной питательной среде, что гарантирует получение экологически чистого сырья.
Однако, полученные до настоящего времени быстро растущие pRi Т-ДНК трансформированные корневые культуры шлемника байкальского были инициированы с помощью штаммов A.rhizogenes, Т-ДНК которых содержата маркерные гены, нетипичные для диких штаммов агробактерии, что не желательно при биотехнологическом использовании культивируемых корней шлемника. Использование при проведении трансформации дикого, немодифииированного штамма агробактерии обеспечивает сохранение природной естественности системы, и поэтому может представлять ценность для биотехнологических разработок с целью получения экологически чистых препаратов, обладающих важными фармакологическими свойствами.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было введение в культуру pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника байкальского с использованием не модифицированного, а дикого штамма A.rhbogenes, опреде-
ление ее биосинтетической продуктивности и поиск способов направленной регуляции образования в корневой культуре флавоноидов.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
-
получить культуру pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника байкальского с использованием дикого штамма A. rhizogenes и подобрать оптимальную питательную среду для роста корневой культуры;
-
исследовать динамику роста трансформированных корней шлемника, и изменение гормонального статуса культуры при выращивании на свету;
-
исследовать влияние освещения, фенилаланина и метилового эфира жасмоновой кислоты на продуктивность корней;
-
провести качественный и количественный анализ флавоноидов, образующихся в культуре трансформированных корней шлемника.
Научная новизна. Впервые получена культура трансформированных корней шлемника байкальского путем инокуляции листовых эксплантов стерильных проростков диким штаммом А-4 A. rhizogenes.
Результаты настоящей работы расширяют представления о роли баланса эндогенных гормонов в процессах роста культур трансформированных корней т vitro. Впервые получены экспериментальные данные о том, что изменение ростовой активности pRi Т-ДНК трансформированных корней на свету сопровождалось изменением гормонального баланса.
Практическая ценность работы. Выращивание трансформированных корней шлемника байкальского, способных к интенсивному, стабильному росту и синтезу флавоноидов в контролируемых условиях, может быть перспективным при решении проблемы дефицита лекарственного сырья.
Результаты, полученные в данной работе, используются при чтении лекционных курсов «Основы биотехнологии», «Клеточная культура растительной ткани» и при проведении практических занятий со студентами биолого-почвенного факультета Томского государственного университета.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на V Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999); на Международной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 1999); на VII Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (2000).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа (116 страниц, 28 рисунков, 9 таблиц) состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объекта исследования и методик работы, изложение результатов экспериментов и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы (177 наименований, из них 97 зарубежных издания).
Флавоноиды шлемника
Основными компонентами в составе фенольных соединений и основными действующими веществами шлемника байкальского являются флавоноиды.
Флавоноиды представляют собой наиболее многочисленную группу природных фенольных соединений. Основу их структуры составляет флаван (рисунок 1), содержащий два бензольных ядра (А и В), соединенных друг с другом трехуглеродным фрагментом (Запрометов, 1993).
Кольцо А молекул флавоноидов образуется из ацетата, а кольцо В - из продуктов шикиматного пути (Гудвин, Мерсер, 1986; Запрометов, 1993)
Исследованием химического состава шлемника байкальского начали заниматься еще в прошлом веке. В 1889 японским исследователем из корней был выделен первый флавон - вогонин, однако его структура была установлена только много лет спустя. Следующим из корней был выделен байкалин. При кислотном гидролизе байкалина образуются глюкуроновая кислота и флавоновый агликон, названный байкалеином (Tang, Eisenbrand, 1992). Вогонин, байкалин и байкалеин являются основными действующими метаболитами корней шлемника (рисунок 2) (Kubo et al., 1985; Tang, Eisenbrand, 1992; Kimura et al., 1997).
Интенсивные исследования флавоноидов шлемника байкальского начались в середине 60-х годов в нашей стране, Японии и Китае. Эти работы развернулись в связи с выявлением новых видов биологической активности флавоноидов этого растения (Гольдберг и др, 1994).
Флавоноиды, выделенные из корней шлемника байкальского представлены в таблице 1.
В результате многочисленных работ отечественнных и зарубежных исследователей последних лет в корнях шлемника байкальского обнаружено и охарактеризовано 77 флавоноидных соединений. На основании химического исследования флавоноиды корней отнесены к пяти классам: халконам, фла-ванонам, флаванонолам, флавонам и флавонолам. Огромное разнообразие флавоноидных производных обусловлено также большим разнообразием типов и моделей замещения в А- и В-кольцах. Гликозиды представлены в основном глюкуронидами, которым сопутствуют глюкозиды (Takagi et al., 1981; Гольдберг и др., 1994; Morimoto et al., 1995).
Определение содержания флавоноидов
Качественное определение. Лиофилизированно высушенные и измельченные корни (10 г сухого веса) экстрагировали на ультразвуковой бане метанолом (100 мл 6 раз по 30 мин). Объединенный экстракт упаривали в вакууме при температуре 40 С досуха, остаток эмульгировали в воде и флавоноиды последовательно экстрагировали дихлорметаном (СН2С12) и этилацетатом. Объединенные экстракты упаривали, остаток растворяли в аликвоте этил ацетата и использовали для тонкослойного хроматографирования (ТСХ) на готовых пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck). В случае ТСХ липофильной фракции (СН2С12) разделение веществ проводили в системе хлороформ : метанол (9 : 1); при разделении этилацетатной фракции использовали иное соотношение растворителей (6 : 4). Метчиками служили стандарты флавонов - вогонин, байкалеин и байкалина (Aldrich Chem. Co.).
Детекцию веществ проводили в УФ-свете (254 и 365 нм), используя поглощение веществ при 254 нм и их характерную первичную флуоресценцию при 365 нм. Кроме того, для подтверждения идентичности веществ применяли обработку хроматограмм реактивом Naturstoff Reagens (NST/PEG). дающим специфичное окрашивание флавонов в видимом свете (Wagner et al., 1983). Полосы с выявленными флавонами отмечали, силикагель элюировали смесью хлороформа и метанола (6 : 4), элюаты упаривали, остаток растворяли на ультразвуковой бане в метаноле и снимали спектры поглощения растворов в ультрафиолете на регистрирующем спектрофотометре (SPECORD М40, Carl Zeiss Jena), сопоставляя поглощение неизвестных веществ с поглощением имеющихся стандартов и с литературными данными (Mabry et al., 1970).
Количественное определение. Для определения содержания флавоноидов в корневой культуре и в корнях целых 6-летних растений 500 мг измельченных сухих корней экстрагировали метанолом (20 мл) в колбах на ультразвуковой бане при 40 С (3 раза по 30 мин). Экстракт фильтровали в мерные колбы и доводили до 100 мл.
Определение содержания агликонов проводили по методу, который используется в Фармакопее Германии для количественного определения содержания флавоноидов в растительном сырье (Qualitative ..., 1995). Для этого 20 мл метанольного экстракта разбавляли в делительной воронке 20 мл воды и трижды экстрагировали этилацетатом (по 10 мл). Объединенный экстракт промывали 2 раза водой, обезвоживали Na2S04 (б/в) и переводили в мерные колбы, доводя до 50 мл этилацетатом. 10 мл полученного экстракта смешивали с 1 мл А1С13-реагента и доводили до 25 мл в мерных колбах 5 % раствором уксусной кислоты в метаноле. Контроль содержал 10 мл эти л ацетатного экстракта с добавлением до 25 мл раствора 5 % уксусной кислотой в метаноле. После 30 минутной экспозиции определяли поглощение раствора при 425 нм. Процентное содержание флавоноидов рассчитывали с помощью удельного коэффициента поглощения байкалеина при 425 нм, определенного по этой же методике (Е1% =500). При суммарном определении содержания флавоноидов использовали тот факт, что метанольный экстракт корней и корневой культуры шлемника байкальского имел спектр поглощения в ультрафиолете, типичный для флавонов (рисунок 4), в связи с чем их содержание в исходном метанольном экстракте определяли спектрофотометрически при 276 нм. Концентрацию флавоноидов рассчитывали с использованием удельного коэффициента поглощения метанольного раствора байкалеина при 276 нм, определенного эксперементально (Е1% =929).
Определение содержания флавоноидов проводили в 5-ти биологических и 3-х аналитических повторностях.
Статистическая обработка экспериментальных данных осуществлялась на ПК с помощью специализированного пакета "Statistica for Windows 4.3" (выборки группы близки к нормальному распределению). В таблицах приведены данные в виде средних арифметических со стандартной ошибкой, на рисунках - в виде средних арифметических с двусторонним доверительным интервалом (Р=0,95).
Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты
Метиловый эфир жасмоновой кислоты (МЖ) является регулятором роста и развития растения (Parthier, 1991) и принимает участие в ответной реакции растительных клеток на различные стрессы (Gundlach et al., 1992).
Известно, что введение в питательную среду МЖ с целью индукции в культивируемых клетках, органах и тканей in vitro биосинтеза вторичных соединений, во многих случаях приводит к ингибированию роста (Furze, Rhodes et al., 1991). Так, в экспериментах В.В.Урманцевой и др. (1999) МЖ ингибировал рост культуры клеток Arnebia euchroma на 35-40 %. Однако в работе SJ. Neill et al. (1994) было показано, что добавление в питательную среду МЖ в концентрации 100 мкМ не влияло на рост трансформированных корней табака (Nicotiana tabacum), но значительно повышало синтез вторичных метаболитов. Поэтому в нашей работе была использована эта концентрация МЖ.
Трехдневная элиситация корневой культуры шлемника байкальского МЖ оказала ингибирующее действие на рост корней (рисунок 21). За сутки в опытных вариантах образовывалось в 2 раза меньше биомассы, по сравнению с контрольными. За время элиситации МЖ подавлял рост корневой культуры на 22 % по сравнению с контролем. В итоге, продуктивность корней по биомассе (г сухой массы/л среды) составляла 5,71 ± 0,03 в опытном варианте и 7,41 ± 0,65 в контроле.
Вероятно, выбранная нами концентрация МЖ является слишком высокой для чувствительных корней шлемника и, возможно, при использовании более низких концентраций можно добиться меньшего ингибирования роста при сохранении индуцирующего эффекта на образование флавоноидов. Влияние МЖ на синтез флавоноидов в трансформированных корней шлемника будет рассмотрено в следующей главе.
Основной целью нашей работы было получение культуры трансформированных корней шлемника байкальского, быстро растущей и способной синтезировать биологически активные вещества, ответственные за фармакологическое действие корней интактного растения. Такими веществами в шлемнике байкальском являются флавоноиды.
Вопрос о способности полученной культуры трансформированных корней шлемника к образованию флавоноидов будет рассмотрен в следующей главе.
Влияние метилового эфира жасмоновой кислоты
В последние годы для увеличения продуктивности культивируемых клеток, тканей и органов растений используют элиситоры различного происхождения, в том числе жасмоновую кислоту и ее производные (Furze et al, 1991, Buitelaar et. al., 1992; Liu et al., 1993, Мантрова и др., 1999, Урманцева и др., 1999).
Жасмоновая кислота и ее производные принимают участие в ответной реакции растительных клеток на действие стрессовых факторов. Именно жасмоновой кислоте и ее производным принадлежит центральная роль в ответной реакции растительных клеток на стрессовый сигнал (Kutchan, 1993, Gross, Parthier, 1994).
Экзогенные или синтезируемые в ответ на обработку элиситорами жасмонаты вызывают усиление биосинтеза разных классов вторичных соединений. К настоящему времени экспериментально доказано индуцирующие действие метилового эфира жасмоновой кислоты (метилжасмоната) на активность ряда ферментов фенилпропаноидного пути (Mizukami et al., 1993).
Результаты химического анализа "элиситированных" корней шлемника свидетельствовали о том, что обработка их метилжасмонатом в возрасте 21 суток сопровождалась увеличением содержания в них флавоноидов (таблица 9). Концентрация флавоноидов в опытных вариантах была в 2,3 раза выше по сравнению с контролем. В связи с тем, что введение МЖ в питательную среду оказывало ингибирующее действие на рост корневой культуры продуктивность по флавоноидам в расчете на колбу увеличивалось в 1,79 раза.
Результаты работы показывают перспективность использования МЖ для индукции биосинтеза в культуре pRi Т-ДНК трансформированных корней шлемника байкальского флавоноидов и возможность значительного повышения продуктивности культуры.
