Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Фотодинамическая терапия 7
1.1.1. Фотохимические основы ФДТ 8
1.1.1.1, Воздействие синглетного кислорода (фотодинамический эффект II типа) 11
1.1.1.2. Фотоокисление с участием радикальных частиц и переноса электрона (фотодинамический эффект 1 типа) 13
1.1.2. Фотосенсибилизаторы, применяемые в фотодинамической терапии рака 15
1.1.2.1, Сенсибилизаторы первого поколения на основе порфиринов 15
1.1.2.2. Сенсибилизаторы второго поколения 17
1.1.3. Транспорт и распределение фотосенсибилизаторов в организме 25
1.1.3.1. Распределение фотосенсибилизаторов в организме 25
1.1.4. Патофизиологические процессы, вызывающие некроз клеток 30
1.1.4.1. Реакции, сенсибилизируемые в клетке 30
1.1.4.2. Острая воспалительная реакция (ранняя фаза) 31
1.1.4.3. Отложенная воспалительная реакция (поздняя фаза) 34
1.1.5. Недостатки, ограничения и пути совершенствования методов фотодинамической терапии 36
1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами олигонуклеотидных реагентов 39
1.2.1. Синглет-синглетный перенос энергии 41
1.2.2. Двухквантовое резонансное триплет-триплетное возбуждение 43
1.2.3. Перспективы использования фотореагентов для направленной модификации нуклеиновых кислот in vivo 45
2. Материалы и методы 47
2.1. Материалы 47
2.2. Олигонуклеотиды 47
2.3. Методы 48
2.3.1. Получение фотоактивируемых реакционноспособных производных олигонуклеотидов 48
2.3.2. Синтез производных олигонуклеотидов, несущих остаток сенсибилизатора 49
2.3.3. Выделение олигонуклеотидных производных методом ВЭЖХ 50
2.3.4. Гашение флуоресценции периленильных производных 50
2.3.5. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды 51
2.3.6. Фотомодификация нуклеиновых кислот, 51
2.3.7. Электрофоретический анализ продуктов модификации, радиоавтография и денситометрия 52
2.3.8. Определение степени и позиционной направленности модификации ДНК-мишени 52
2.3.9. Культивирование клеток. 53
2.3.10. Модификация клеточных белков фотоактивируемым производным олигонуклеотида 53
2.3.11. Электрофоретический анализ белков. 54
3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНК-мишени на эффективность сенсибилизированной фотомодификации 55
3.1.1. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишеней Ml и М2 56
3.1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени МЗ 60
3.2. Влияние строения сенсибилизатора на скорость и эффективность сенсибилизированной фотомодификации ДНК 65
3.2.1. Влияние заместителей в антраценовом остатке 66
3.2.1.1. Строение и спектрально-люминесцентные свойства сенсибилизаторов на основе антрацена 66
3.2.1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени 67
3.3. Использование перилена в качестве сенсибилизатора 71
3.3.1. Спектрально-люминесцентные свойства перилена 71
3.3.2. Гашение флуоресценции олигонуклеотидного производного перилена в двуцепочечных комплексах 72
3.3.3. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени 75
3.3.4. Механизм сенсибилизации фотореагента основан на переносе электрона 78
3.4. Сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотид-связывающих белков, представленных на поверхности эукариотических клеток 85
Выводы 94
- Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами олигонуклеотидных реагентов
- Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды
- Влияние строения сенсибилизатора на скорость и эффективность сенсибилизированной фотомодификации ДНК
- Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени
Введение к работе
Фотореакционноспособные производные олигонуклеотидов являются перспективными реагентами для направленной химической модификации определенных последовательностей нуклеиновых кислот и инструментами для исследования структуры и функции биополимеров [1,2].
Фотореакционноспособные конъюгаты олигонуклеотидов обладают рядом преимуществ по сравнению с другими реагентами на основе олигонуклеотидов - они инертны в отсутствие облучения, а процесс фотоактивации легко регулировать. Фотоактивация позволяет повысить селективность воздействия - реакция преимущественно проходит в сформированном аффинном комплексе. Фотоакгивные антисмысловые олигонуклеотиды могут связываться с целевыми мРНК и, после облучения, ингибировать их трансляцию. Они способны образовывать трехтяжевые комплексы с двуцепочечной ДНК и ингибировать репликацию и транскрипцию генов in vitro и in vivo. Фотоактивируемые конъюгаты олигонуклеотидов могут взаимодействовать с белками, обладающими сродством к нуклеиновым кислотам, что позволяет применять их для исследования механизмов взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами и модулировать активность белков in vivo.
Бинарные системы олигонуклеотидных конъюгатов позволяют осуществить фотомодификацию ДНК с повышенной эффективностью и селективностью [3-8]. Принцип подхода заключается в том, что используются два олигонуклеотида, комплементарные соседним участкам ДНК- или РНК-мишени, к одному из которых присоединен сенсибилизатор, к другому - фотореагент. При комплементарном связывании таких пар олигонуклеотидных конъюгатов с нуклеиновой кислотой сенсибилизатор и фотореагент сближаются, в результате чего формируется фотореакционноспособные центр. Облучение образовавшегося комплекса длинно-
волновым светом вызывает возбуждение сенсибилизатора с последующей активацией реагента за счет безизлучательного переноса энергии и фотомодификацию биополимера.
Фотомодификация нуклеиновых кислот и белков взаимодействующих с РНК и ДНК бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов может быть использована как инструмент в исследовательских, диагностических и терапевтических целях, В условиях in vivo исключительно важно, чтобы фотомодификация инициировалась видимым или ИК-светом, более глубоко проникающим в клетки и не вызывающим, в отличие от коротковолнового УФ, нежелательных побочных эффектов облучения. Поэтому применение бинарных систем олигонуклеотидных конъюгатов активизируемых длинноволновым светом особенно перспективно для приложения in vivo.
Целью данной работы являлось:
а) - разработка новых, активируемых видимым светом, бинарных систем производ
ных олигонуклеотидов для фотосенсибилизированной модификации биополимеров;
б) ~ изучение влияния химической структуры сенсибилизатора и влияния последова
тельности целевой нуклеиновой кислоты на эффективность фотомодификацию ДНК-
мишени;
в) - использование бинарных систем конъюгатов олигонуклеотидов для исследования
процессов взаимодействия нуклеиновых кислот с клеточными белками in vivo.
Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами олигонуклеотидных реагентов
Одним из подходов направленного химического воздействия на нуклеиновые кислоты является использование адресованных реагентов на основе синтетических олигонуклеотидов [147]. Метод нашел широкое применение для решения большого круга задач как в системах in vitro, так и in vivo. Однако, олигонуклеотидные производные in vivo обладают недостаточной для модификации нуклеиновых кислот специфичностью, так как в физиологических условиях (37 С) олигонуклеотиды, имеющие длину 18-20 оснований, необходимую для высокоспецифического узнавания уникальных нуклеотидных последовательностей в составе ДНК, способны образовывать многочисленные несовершенные комплексы с неполностью комплементарными последовательностями [148]. Для уменьшения нецелевого расхода фотореакционноспособных производных и снижения побочных фототоксических эффектов, было предложено разделить процессы поглощения света и фотомодификации. Для этого были сконструированы бинарные системы оли-гонуклеотидных конъюгатов, комплементарных соседним участкам ДНК-мишени и содержащих химически инертные группы - сенсибилизатор (S) и фотореагент (R). Сближенные в составе прилегающих комплементарных комплексов группы S и R образуют фотореакцион-носпособный центр, который может быть активирован облучением длинноволновым УФ-или видимым светом за счет безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения с сенсибилизатора на фотореагент. Возбужденный таким образом фотореагент вызывает фотомодификацию только той ДНК-мишени, которая находится в составе комплементарного комплекса [3, 4, 7-9]. Длина обоих олигонуклеотидов-адресов выбрана такой (оба адреса -декануклеотиды), чтобы при 37 С вероятность формирования несовершенных дуплексов с неполностью комплементарными последовательностями была незначительна [5]. Для осуществления синглет-синглетного переноса энергии необходимо, чтобы энергия 0,0-перехода между самыми нижними колебательными уровнями основного и первого возбужденного электронных состояний в молекуле сенсибилизатора была больше энергии соответствующего перехода в молекуле фотореагента R, и чтобы спектр испускания возбужденного сенсибилизатора (S ) перекрывался со спектром поглощения реагента R [149]. Энергия 0,0-перехода в ароматических азидах составляет 70 ккал-моль", и их малоинтенсивное пк-поглощение простирается до 450 нм [150].
Производные полиароматических углеводородов пирена 17 и бензантрацена 18 имеют высокие квантовые выходы флуоресценции и малые стоксовы сдвиги (т.е. минимальные потери энергии при фотовозбуждении и последующей флуоресценции). Энергия 0,0-переходов в незамещенных пирене и бензантра-цене составляет, соответственно, 76 и 72 ккал-моль [150, 151] и больше, чем энергия 0,0-переходов в азидах 19 и 20, Таким образом, спектры флуоресценции пирена и бензантрацена перекрываются со спектрами поглощения этих азидов [7]. Эффективность переноса энергии существенно зависит от расстояния между сенсибилизатором и фотореагентом и при обычно используемых микромолярных концентрациях олигонуклеотидных производных переноса энергии с сенсибилизатора на фотореагент в растворе не наблюдается. Начальная скорость сенсибилизированной к УФ-свету (365-390 нм) фотомодификации в 100-1500 раз больше скорости прямой комплементарно адресованной модификации и снижается при увеличении длины линкера в ряду лиренильных производных [7]. Аналогично проходит фотомодификация комплексов оцДНК 21 и 22 олигонуклео-тидным производным азида 20. При эквимолярном соотношении концентраций конъюгатов и мишени предельные выходы ковалентных адцуктов прямой фотомодификации в комплексе 21 и сенсибилизированной олигонуклеотидным производным бензантрацена 18 фотомодификации в комплексе 22 одинаковы (— 30%), но начальная скорость сенсибилизированной реакции в 120 раз больше скорости прямой. В обоих случаях ускорение фотомодификации происходит за счет эффективного переноса энергии с фотовозбужденного сенсибилизатора S на фотореагент R. При 50-кратном избытке олигонуклеотидных конъюгатов начальная скорость сенсибилизированной фотомодификации практически не меняется по сравнению со скоростью сенсибилизированной модификации при эквимолярном соотношении реагентов, однако при этом наблюдается увеличение выхода ковалентных аддуктов. Выход продуктов прямой фотомодификации в этих условиях возрастает незначительно [3, 4]. Исследование зависимости эффективности модификации мишени фотореагентом в комплексе 22 от соотношения концентраций сенсибилизатора 17 и ДНК-мишени показало, что каждая молекула сенсибилизатора способна инициировать модификацию нескольких молекул мишени. Так, при 100-кратном недостатке сенсибилизатора (облучение при 42 С) каждая его молекула вызывает фотомодификацию до 24 молекул мишени [4]. Оценка специфичности прямой и сенсибилизированной фотомодификации природной ДНК-мишени [4] была поведена на примере модификации смеси 18 фрагментов оцДНК M13BMR4, один из которых содержал комплементарную последовательность-мишень, (как в комплексах 21 и 22). При 37 С начальная скорость сенсибилизированной пиреном 1 фотомодификации фотореагентом 4 на 4 порядка выше, а степень модификации в 60 раз больше, чем в случае прямой реакции. При той же температуре уровень неспецифической модификации по фрагментам ДНК М13, не содержащим комплементарной вставки, для сенсибилизированной реакции в — 1.5 раза меньше, чем для прямой [4].
Показано, что специфичность сенсибилизированной фотомодификации, определенная как отношение эффективностей специфической и неспецифической модификаций, в 90 раз выше, чем прямой реакции [4]. 1.2.2. Двухкванто вое резонансное трип лет-трип летное возбуждение Пирен обладает достаточно высоким квантовым выходом интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние (q isc = 0.37 [152], но энергия триплетного уровня пирена (Е(Т) = 48.7 ккал моль"1 [153]) намного ниже, чем энергия триплетного уровня ароматических азидов (Е(Т) я 68 ккал-моль"1 [151]). Следовательно, одноквантовая триплетная сенсибилизация азида 19 пиреном невозможна. В то же время пирен обладает интенсивным триплет-триплетным поглощением в видимой области. Время жизни триплетного состояния (Т) достаточно велико (т 0.5 с), и пирен, находясь в этом состоянии, способен поглотить второй квант, в данном случае, видимо- го света (hv2), и перейти на более высокий триплетный уровень. Энергия возбужденного триплетного уровня пирена (Е(Тг) = 77.8 ккал моль"1 [153]) больше, чем энергия триплетного уровня азида 19. Вследствие этого двухквантовый триплет-триплетный перенос энергии с сенсибилизатора на Ті-уровень фотореагента термодинамически разрешен и должен протекать с диффузионно-контролируемой скоростью. Далее возбужденный за счет триплет-трип летного переноса энергии азид 19 диссоциирует на азот и триплетный нитрен. Последний фотомодифицирует ДНК-мишень с образованием характерных для этой бирадикальной частицы продуктов [9]. Так, при одновременном облучении УФ- и видимым светом в диапазоне 365-580 нм комплекса ДНК-мишени с бинарной системой олигонуклеотидных конъюгатов 22, содержащих остатки пирена 17 и азида 19., происходит шестикратное увеличение скорости модификации и изменение ее позиционной направленности с остатка гуанина G1 на остаток тимина Т1 по сравнению с облучением в диапазоне 365 - 390 нм [8]. Критическое расстояние, на которое осуществляется двухквантовый триплет-триплетный перенос энергии, обычно равно 5-6 А, что в 2-3 раза меньше, чем расстояние, необходимое для одноквантового триплет-триплетного переноса, и в 4 -10 раз меньше, чем необходимое для синглет-синглетного переноса энергии [154]. Протекание двухбайтового процесса сенсибилизации в комплементарном комплексе (22) позволяет предположить, что остатки сенсибилизатора и фотореагента имеют возможность сближаться на расстояние до 6 А, по крайней мере, в момент поглощения квантов света. Для подтверждения этого методом 2Э-ЯМР была изучена структура комплекса бинарной системы с ДНК-мишенью [155]. Остаток пирена 17 располагается со стороны малой бороздки, фотореагент располагается со стороны большой. Расстояние между центрами остатков пирена и азида составляет 8-9 А [155]. Такое сближение сенсибилизатора и фотореагента соособствует высокоэффективному переносу энергии.
Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды
В экспериментах по фотомодификации ДНК-мишеней (М1-М4) І0-15 мкл реакционной смеси, содержащей 0.1-1 мкМ раствор ДНК-мишени и 0.1-50 мкМ растворы олигонуклеотидных производных фотореагента и сенсибилизатора в б мМ NaaHP04 (рН 7.6), 0.2 М NaCl и 0.02 мМ EDTA, помещали в цилиндрические лунки иммунологических планшетов диаметром 4 мм, закрывали крышками, термостатировали при 25 С и облучали конденсированным светом ртутной лампы ДРК-І20 осветителя ОИ-18А (ЛОМО, Санкт-Петербург) через наборы стеклянных светофильтров. Интенсивность падающего на образцы УФ-света контролировали с помощью ферриоксалатного актинометра [192], интенсивность падающего видимого света контролировали с помощью люксметра Ю-117 [193]. Для предотвращения испарения образцов во время облучения в планшеты для иммунологических реакций, кроме образцов, помещали полоски фильтровальной бумаги, смоченные водой. Уменьшение объема раствора образцов, связанное с испарением не превышало 10-15%. После облучения из реакционной смеси отбирали аликвоты по 2 мкл, смешивали с 2 мкл раствора 80% формамида, содержащего 0.1% бромфенолового синего и 0.1% ксиленцианола FF, и анализировали методом электрофореза в 20% ПААГ, (0.05 М трис-борат, рН 7.4, 7М мочевина). После электрофореза гель накрывали лавсановой пленкой и экспонировали на рентгеновскую пленку Agfa CP-BU ("Agfa", Германия) с усиливающим экраном в течение 8-24 ч при -20С. Радиоавтографы гелей сканировали на лазерном денситометре 2222 Ultroscan-XL ("LICB", Швеция). Для сканирования использовали радиоавтографы, оптическая плотность которых не выходила за границы диапазона линейного соответствия количества радиоактивности в зоне со степенью потемнения рентгеновской пленки. Для определения этого диапазона строили калибровочную кривую по данным денситометрирования калибровочной авторадиограмы. 2.3.8. Определение степени и позиционной направленности модификации ДНК-мишени В результате фотоиндуцируемой модификации ДНК-мишени происходит ковалентное присоединение олигонуклеотидного производного, несущего фотоактивируемую группировку, к ДНК-мишени (образование ковал ентных аддуктов). Ко валентные аддукты ДНК-мишении и олигонуклеотидного конъюгата имеют меньшую электрофоретическую подвижность, чем исходная ДНК-мишень.
Степень модификации ДНК-мишени определяли как отношение, выраженное в процентах, количества радиоактивности в продуктах, с меньшей электрофоретической подвижностью, чем исходная ДНК мишень, к суммарной радиоактивности в пробе. Для определения сайта модификации аликвоту реакционной смеси после фотомодификации подвергали кипячению в течение 30 минут в 1 М растворе пиперидина. Затем в образцы добавляли ДНК носитель из расчета 0.2 мкг/мкл и осаждали нуклеотидный материал 2% раствором LiClG"4 в ацетоне, промывали ацетоном, растворяли в буфере для нанесения и наносили на секвенирующий 13% ПААГ (7 М мочевина, Трис-борат рН 7.5). В качестве маркеров использовали продукты G и A+G специфичного расщепления мишени по методу Максам а и Гилберта [194]. 2,3.9. Культивирование клеток. В работе использовали культивируемые клетки фибробластов почки эмбриона свиньи СПЭВ, Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мг/мл гентамицина при 37 С в атмосфере 5% СОг. Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию трипановым синим. В экспериментах жизнеспособность клеток составляла не менее 90%. Все эксперименты с клетками проводили при 4 С. 2.3,10. Модификация клеточных белков фотоактивируемым производным олигонуклеотида Для проведения специфической фотомодификации олигонуклеотид-связывающих белков клетки выращивали в 48-луночных планшетах. Перед экспериментом клетки промывали средой ДМ.ЕМ и инкубировали на льду в среде ДМЕМ, содержащей смесь олигонукдеотидов в течение 5 мин. Затем клетки в планшетах, помещенных в лед, облучали конденсированным светом ртутной лампы ДРК-120 осветителя ОИ-18А (ЛОМО, Санкт-Петербург) через следующие наборы стеклянных светофильтров (к, нм; W, мВтсм" (X, нм; W, мВгсм"2): ЕС-7, СЗС-23 (365-580; 10); ЖС-10, СЗС-23 (400-580; 8). Далее клетки трижды отмывали средой IMDM от несвязавшегося олигонуклеотида, механически снимали в 0,2 мл среды и осаждали центрифугированием (1 мин, 4000 g). Для электрофоретического анализа модифицированных, белков осадок клеток растворяли в буфере (0,03 М трис-HCl, рН 6,8, 1% SDS, 5% р-меркаптоэтанол, 20% глицерин) и прогревали 3 мин при 100 С. Модифицированные белки разделяли SDS-электрофорезом в 12% ПААГ и визуализовали при помощи авторадиографии. 2.3.11. Электрофоретический анализ белков. Электрофорез проводили по методу LaemmH (Laemmli, і 970). Концентрирующий гель содержал 5% акриламид, 0,08% бис-акриламид, 0,125 М трис-HCl, рН 6,8; 0,1% SDS. Разделяющий гель содержал 12 % акриламид, 0,375 М трис-HCl, рН 8,8; 0,1% SDS. Электродный буфер 0,025 М трис-HCl, 0,192 М глицин, 0,1% SDS, рН 8,3. Электрофорез проводили с силой тока 5 мА, при достижении красителем границы концентрирующего и разделяющего гелей - 10-15 мА. Радиоавтографы гелей сканировали на лазерном денситометре 2222 Ultroscan-XL (LKB, Швеция). Для сканирования использовали радиоавтографы, оптическая плотность которых не выходила за границы диапазона линейного соответствия количества радиоактивности в зоне со степенью потемнения рентгеновской пленки. Для определения этого диапазона строили калибровочную кривую по данным денситометрирования калибровочной авторадиограммы.
Бинарные системы олигонуклеотидных конъюгатов могут быть использованы для избирательной модификации нуклеиновых кислот и белков, обладающих сродством к нуклеиновым кислотам, как in vitro, так и in vivo в исследовательских, диагностических и терапевтических целях. Необходимым условием для осуществления аффинной фотомодификации биополимеров in vivo является инициация реакции видимым или ИК-светом, проникающим в клетки и не вызывающим побочных эффектов облучения. 3.1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНК-мишени на эффективность сенсибилизированной фотомодификации Для достижения значимых биологических эффектов при воздействии на ДНК in vivo необходимо, чтобы эффективность модификации была высокой [156]. При фотомодификации ДНК олитонуклеотидными реагентами, эффективность реакции зависит от реакционной способности реагента по отношению к нуклеотидам целевой последовательности ДНК-мишени и от геометрических параметров комплекса. Влияние строения фотореагента [6, 1 58] и сенсибилизатора, длины линкера [7] и способа присоединения фотореагента к гетероциклическому основанию [158] (по 3 - или 5 -концевому фосфату[7, 158]) на эффективность фотомодификации было изучено ранее. Из этих данных следует, что эффективность прямой фотомодификации ДНК-мишени зависит от ее последовательности в сайте модификации (предельная степень модификации растет в ряду Т С, А G и составляет 40%, 45%, 45 и 65% соответственно) [158]. Для разработки подходов, направленных на увеличение эффективности сенсибилизированной фотомодификации ДНК бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов, была исследована зависимость выхода продуктов модификации от состава нуклеотидной последовательности ДНК-мишеней в предполагаемом сайте модификации. 3.1.1. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишеней Ml и М2 Выбор мишеней МІ (нуклеотидная последовательность которой аналогична последовательности регуляторного участка от -96 до -76 гена CYP102, кодирующего цитохром Р450 [159)) и М2, различающихся одним остатком - А12 и G12, был основан на предположении, что присутствие гуанозина в области формирования фотореакционного центра должно приводить к повышению эффективности модификации ДНК-мишени. Структура ДНК-мишеней и оли гонуклеотидных конъюгатов: сенсибилизатора OLl-BzA (несущего остаток Т -(5-фтор-12-метилбензо[а]антрацен-7-илацетил)этилендиамина), реагентов OL2-R и OL3-R (несущих остаток (4-азидотетрафторбензилиден)-г4 -(3-аминопропил)гидразина) приведены на схеме 1. Использование OLl-BzA в качестве сенсибилизатора было обусловлено тем, что закономерности сенсибилизированной модификации ДНК-мишени МІ, в сочетании с используемым фотореагентом, были подробно исследованы ранее [3, 4].
Влияние строения сенсибилизатора на скорость и эффективность сенсибилизированной фотомодификации ДНК
Ключевым моментом при разработке бинарных систем, активируемых видимым светом, является поиск химических соединений, способных выступать в качестве сенсибилизатора в данных условиях. Для реализации рациональных подходов к поиску таких соединений необходимо исследовать как химическое строение и спектрально-люминесцентные свойства сенсибилизатора влияют на скорость, эффективность и спектральную зависимость сенсибилизированной фотомодификации нуклеиновых кислот. Далее представлены результаты исследования влияния различных заместителей в антраценовом остатке сенсибилизатора на скорость и эффективность сенсибилизированной фотомодификации ДНК-мишени с помощью бинарной системы олигонуклеотидных производных. Введение аминометильной группы в антраценовое ядро вызывает длинноволновой сдвиг максимума поглощения на 7 нм (А1), введение 3-аминопропионилгидразоновой группы - длинноволновой сдвиг максимума поглощения на 10 нм (A3). Хлорирование антрацена приводит к батохромному сдвигу на 8-11 нм (А2 и А4). Наличие атома хлора и аминометильной группы приводит к увеличению интенсивности флуоресценции (А2), в то время как наличие 3-аминопропионилгидразоновой группы на два порядка снижает ее интенсивность (A3 и А4). Стоксов сдвиг (разница между максимумом флуоресценции и максимумом по- глощения) для аминометильных производных составляет 31-33 нм, для гидразонопроизводных - 77-78 нм. Эти данные свидетельствуют о том, что для аминометильных производных А1 и А2 безызлучательные потери энергии в фото возбужден ном состоянии меньше, чем для гидразонопроизводных A3, А4. Методом гашения флуоресценции антрацена и его производных А1-А4 перфторари-лазидом RH (схема 3) были оценены значения эффективных констант переноса энергии (Кэфф). Полученные значения представлены в таблице 2. Видно, что значение констант падает при увеличении длины волны максимума флуоресценции (А-л). Принимая во внимание приведенные выше спектральные характеристики, можно предположить, что при облучении светом с длиной волны соответствующей максимумам поглощения исследуемых соединений (390-400 нм) наибольшей эффективности переноса энергии на перфторароматический азид следует ожидать при использовании 9-ам и ном етил антрацена и 9-хлор-10-аминометилантрацена в качестве сенсибилизаторов.
В то же время, существенный батохромный сдвиг максимума флуоресценции, обусловленный введением дополнительного электронного сопряжения 3-аминопропионилгидразоновой группы (соединения A3 и А4) может позволить активировать фотореагент светом с большей длинной волны. 3.2.1.2. Сенсибилизированная фотамодификация ДНК-мишени В качестве мишени был использован синтетический 25-звенный дезоксирибоолиго-нуклеотид МЗ. Строение ДНК-мишени, олигонуклеотидных конъюгатов, сенсибилизаторов и фотореагента К-(п-азидотетрафторбензаль)-гидразон-г Г-пропиониламина (R) представлено на схеме 3. Можно констатировать, что предельная степень сенсибилизированной фотомодификации увеличивается в ряду сенсибилизаторов OL4-A4 OL4-A3 OL4-A1 OL4-A2, достигая для последних двух 98-99% (рис. 9, дор. 6, 9). В целом, этот результат качественно согласуется с относительной эффективностью флуоресценции (FOTH) исходных производных антрацена А1-А4 (табл.1). Возможно, что низкая эффективность сенсибилизации фотомодификации конъюгата OL4-A4 может быть обусловлена тем, что у этого соединения энергии возбужденного состояния недостаточно для активации азидогруппы. Следовательно, с учетом начальной скорости (определенной после денситометриче-ской обработки представленного на рис. 9 радиоавтографа) и предельной степени фотомодификации при облучении в максимуме поглощения, наиболее перспективным сенсибилизатором является конъюгат 9-хлорантраценил-10-мегиламина OL4-A2. Несколько иная картина наблюдается при облучении видимым светом в диапазоне длин волн 420-580 нм (рис, 10), где небольшое поглощение наблюдается только для олиго-нуклеотидных производных 9-антраценальгидразона OL4-A3 и OL4-A4. Начальная скорость накопления ковалентных аддуктов фотомодификации ДНК-мишени увеличивается следующим образом; прямая OL4-A1 OL4-A2 OL4-A4 OL4-A3. Предельная степень моди- фикации для фотореакции, сенсибилизированной олигонуклеотидным производным 9-антраценальгидразон-пропиониламина OL4-A3 также выше, чем для остальных конъюгатов. Еще более заметным становятся преимущества соединения OL4-A3 как сенсибилизатора при облучении видимым светом с большей длиной волны. При облучении светом с длиной волны более 460 нм (данные не приведены) наблюдается только фотомодификация, сенсибилизированная олигонуклеотидным конъюгатом OL4-A3, в то время, как ни прямая реакция, ни реакция, сенсибилизированная производными OL4-A1 и OL4-A2, в этих условиях не протекают. По-видимому, это обусловлено тем, что введение гидразоно-группы в антраценовое ядро приводит к расширению полосы поглощения антраценового производного A3. Максимальная длина поглощения (?ч,акС) Для этого соединения - 387 нм, при этом полоса поглощения простирается в видимую область, что позволяет сенсибилизировать фотомодификацию при облучении видимым светом с длиной волны 460 нм, Таким образом, конъюгат OL4-A3 позволяет высокоспецифично проводить сенсибилизированную фотомодификацию в условиях, когда в отсутствие этого сенсибилизатора фотореагент практически инертен. В диссертационной работе Гайдамакова С. А. [161) было описано применение в качестве сенсибилизатора 3-периленметиламина.
Была отмечена высокая эффективность сенсибилизированной этим соединением реакции фотомодификации. В данной части работы предлагается детальное исследование механизмов сенсибилизации производным олигонук-леотида OLl-Per модификации ДНК-мишени Ml фотореагентом OL2-R. 3.3.1. Спектрально-люминесцентные свойства перилена Перилен и его производные используются как флуоресцентные стандарты [162] и как синглетные сенсибилизаторы, так как их квантовые выходы флуоресценции 1.0, а квантовые выходы интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние близки к нулю [63]. Хотя у перилена о,о меньше (64 [150], 65.8 [163] ккал/моль), чем энергия 0,0-перехода ароматических азидов (70-72 ккал/моль [150]), он способен сенсибилизировать их фоторазложение за счет фотонидуцированного переноса электрона [150]. Как и другие производные перилена, 3-периленметиламин [162] обладает сильным поглощением в УФ и в видимой части спектра - X, нм, (є, M W1): 252 (47000), 412 (30000), 439 (39000), и интенсивной флуоресценцией (А.фЛ 455, 485 и 515 нм). Спектр его поглощения батохромно сдвинут относительно спектра ранее описанного сенсибилизатора BzAH [3, 4] на 60 нм. Конъюгат OLl-Per обладает следующим спектром поглощения: X, нм, (є, М см" ): 256 (125000), 420 (29000), 448 (35000). При присоединении 3-периленметиламина к олиго-нуклеотиду наблюдаются батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения на 9 нм и гашение флуоресценции сенсибилизатора на 20%. В качестве мишени был использован синтетический 21-звенный дезоксирибоолиго-нуклеотид Ml. Строение ДНК-мишени3 олигонуклеотидных конъюгатов, сенсибилизаторов и фотореагента г 1-(4-азидотетрафторбензилиден)-М -(3-аминопропил)гидразина (R) представлено на схеме 4.
Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени
Для изучения того, каким образом различия е эффективности гашения флуоресценции остатков бензантрацена и перилена отражаются на эффективности модификации нуклеиновых кислот, была проведена прямая и сенсибилизированная фотомодификация мишени Ml при облучении видимым светом (440-580 нм, что является оптимальными условиями для пе-риленового производного олигонуклеотида) в составе дуплексов (16), (III), (IVa) и (IV6). Видно (рис. 12), что фотомодификация ДНК фотореагентом OL2-R в комплексе (IV6), сенсибилизированная олигонуклеотидным производным перилена OLl-Per заканчивается после 1 мин облучении (дорожка 5) и выход ковалентных аддуктов сшивки фотореагента с ДНК-мишенью достигает 70%. При дальнейшем облучении выход не меняется (дорожки би 7). Ни производное OLl-Per (дорожка 9\ ни производное фотореагента OL2-R (дорожка 10) по отдельности не вызывают фотомодификации после 100 мин облучения. Сенсибилизированная производным бензантрацена OLl-BzA фотомодификация ДНК в комплексе (IVa) (дорожки 2-4) в данных условиях не наблюдается (данные условия облучения неоптимальные для сенсибилизации фотомодификации бензантраценовым производным). На рис. 13 представлены данные по прямой (кривая 7) и сенсибилизированной олиго-нуклеотидным производным бензантрацена (кривая 2) и перилена (кривая 3) фотомодификации ДНК-мишени при облучении видимым светом в более широком диапазоне экспозиций (Н). Видно, что 10%-ный выход ковалентных аддуктов сшивки реагента с мишенью в случае фотомодификации, сенсибилизированной периленом, достигается при lg Н = 0.3 (кривая 3), бензантраценом - при lg Н = 4.7 (кривая 2), а при lg Н = 5.7 в случае прямой фотомодификации (кривая /). Следовательно, скорость сенсибилизированной производным перилена OLl-Per фотомодификации ДНК в комплексе IV6 примерно в 300000 раз, а сенсибилизированной производным бензантрацена OLl-BzA - примерно в 10 раз больше, чем прямой фотореакции в комплексе III. При облучении видимым светом комплекса Ml + OLl-Per (дорожка /) не выявляется продуктов расщепления, следовательно, сенсибилизатор в отсутствие фотореагента не вызывает модификации мишени.
Облучение комплекса Ml + OL1 + OL2-R УФ-светом приводит к образованию небольшого количества аддуктов (дорожка 2), расщепляющихся пиперидином по остатку гуанозина G11 ДНК-мишени (дорожка 4). Сенсибилизированная фотомодификация в комплексе Ml + OLl-Per + OL2-R, инициированная видимым светом, приводит к образованию значительного количества ковалентных аддуктов (дорожка 3), расщепляющихся по тому же остатку гуанозина (дорожка 5). Ранее было показано [195], что при направленной фотомодификации ДНК ковалентные аддукты являются продуктами присоединения синглетного нитрена по остатку гуанозина. Идентичность позиционной направленности прямой и сенсибилизированной фотомодификации показывает, что наиболее вероятным путем возбуждения фотореагента при облучении видимым светом является синглет-синглетная сенсибилизация. Из полученных результатов (рис. 13 и 14) следует, что высокоэффективную сенсибилизированную фотомодификацию ДНК в комплексе IV6 можно проводить специфично, поскольку в условиях, необходимых для модификации, производные OLl-Per и OL2-R по отдельности не активны. Вследствие высокой эффективности сенсибилизированной фотомодификации было решено более подробно изучить механизм фотосенсибилизации фотореагента периленом. 3.3.4. Механизм сенсибилизации фотореагента основан на переносе электрона Перенос электрона из основного состояния азида на возбужденное состояние сенсибилизатора считается наиболее вероятным механизмом синглет-синглетной сенсибилизации ароматических азидов периленом, хотя перенос электрона не исключает также синглет- синглетного переноса энергии [150]. Оба механизма могут реализовываться параллельно, но вклад переноса электрона увеличивается при росте диэлектрической проницаемости растворителя, которая способствует разделению зарядов. Константа скорости гашения флуоресценции перилена ароматическими азидами увеличивается при росте диэлектрической проницаемости растворителя и достигает диффузионно контролируемого предела в метаноле при є = 32 [150], Примерно такое же значение диэлектрической проницаемости наблюдается в бороздках двухцепочечной ДНК [164]. Было предположено, что обнаруженное значительное увеличение скорости сенсибилизированной фотомодификации ДНК-мишени (по сравнению со скоростью реакции сенсибилизированной бензантраценовым производным) производным перилена ОІЛ-Per может быть обусловлено переносом электрона. Ранее было показано, что в бинарных системах олигонуклеотидных производных конъюгаты антрацена, пирена и бензантрацена являются эффективными сенсибилизаторами, ускоряющими фотомодификацию ДНК-мишени и не расходующимися в ходе реакции [4]. Поэтому была изучена способность производного перилена ОЫ-Рег выступать в качестве не расходующегося сенсибилизатора. Полученные данные были сопоставлены с данными по фотомодификации, сенсибилизированной производным бензантрацена OLl-BzA (рис. 15). Фотомодификацию проводили в различных, оптимальных для каждого сенсибилизатора, условиях облучения. Видно, что при фотомодификации сенсибилизированной конъюгатом OLl-BzA (при облучении в диапазоне длин волн, оптимальных для этого сенсибилизатора: 400-580 нм) (панель а), заметный выход ковалентных аддуктов наблюдается даже при значительном недостатке сенсибилизатора (дор. 2-5). При увеличении соотношения концентраций [OL1-BzA]/[Ml] больше 1, выход аддуктов продолжает увеличиваться и достигает 60% при десятикратном избытке сенсибилизатора (дорожка 8). Для сенсибилизированной периленовым производным фотомодификации (панель б) наблюдается другая зависимость выхода ковалентных аддуктов от соотношения концентраций сенсибилизатор/ДНК-мишень.
При значительном недостатке сенсибилизатора фотомодификация практически отсутствует (дорожка 2-3), далее выход ковалентных аддуктов линейно увеличивается при росте соотношения концентраций [OLl-Per]/[Ml] от 0.1 до 3 (до- рожки 4-7). Последующее увеличение избытка сенсибилизатора приводит к незначительному увеличению эффективности фотомодификации, достигая 70% при 30-ти кратном избытке производного OLl-Per (дорожка 9). Количественные данные по сенсибилизированной фотомодификации ДНК в комплексах Ml + OLl-BzA + OL2-R и Ml + OLl-Per + OL2-R при недостатке сенсибилизаторов представлены на рис. 16. Видно, что при 100-кратном недостатке производного бензантраце-на OLl-BzA выход модификации составляет 24% (кривая 2). Можно сделать вывод, что в отличие от производного бензантрацена, каждая молекула которого способна инициировать фотомодификацию до 24 молекул мишени, каждая молекула конъюгата перилена OLl-Per вызывает фотомодификацию только одной молекулы мишени (прямая /). Из представленных на рис. 15 и 16 результатов можно сделать вывод, что при сенси- билизированной производным перилена OLl-Per фотомодификации ДНК в комплексе IV6 эффект многократной инициации фотореагента одной молекулой сенсибилизатора не проявляется. Возможным объяснением этого может быть фотоокисление сенсибилизатора в ходе фотомодификации ДНК. Перфторнафтойная кислота (1) и 2-азидоперфтор-7-нафтойная кислота (2), описанные ранее [165], были выбраны вследствие того, что их спектры поглощения (Хмакс 340 и 345 нм соответственно) не перекрываются со спектром поглощения перилена (Хмакс 251 и 433 нм). При облучении в течение 1 ч видимым светом {440-580 нм) не наблюдается фотолиза ни перилена (3), ни азида (2), ни смеси перилен-перфторнафтойная кислота, ни в кислородных, ни в бескислородных условиях. При облучении в течение 1 ч видимым светом (440-580 нм) смеси перилен - 2-азидоперфтор-7-нафтойная кислота в присутствии кислорода одновременно происходит фотопревращение как азида, так и перилена с тщ 8 мин. По данным ВЭЖХ, перилен практически целиком превращается в соединение, не флуоресцирующее и обладающее характерным для 1,12-периленхинона (4) спектром поглощения (Хмкс 334 и 444 нм) [166]. Можно предположить, что идет фотоокисление перилена кислородом воздуха.
