Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Химические и биологические свойства нейротоксйнов аксонального действия (Литературные обзор). 7
1.1. Нейротоксины яда скорпионов 10
1.2.. Полипептидные нейротоксины морских анемон 23
1.3. Механизм действия и рецепция токсинов скорпионов и анемон . 28
1.4. Токсины скорпиона - блокаторы калиевых каналов 38
1.5. Токсичные полипептиды немертин 40
1.6. Алкалоидные нейротоксины 44
1.7. Механизм действия и рецепция алкалоидных ней-ротоксинов 51
1.8 Токсины, вызывающие деполяризацию аксональной мембраны 60
1.9. Тетродотоксин и сакситоксин - блокаторы натриевых каналов 65
1.10. Механизм действия и рецепция токсинов-блока-торов 78
1.11. Другие природные нейротоксины аксонального действия 89
Результаты и их обсуждение , 95
ГЛАВА II. Выделение и характеристика полшшптидных токсинов 96
ГЛАВА III. Структура полипептидных токсинов 115
Глава IV.Взаимодействие нейротоксйнов с мембраной нервной клетки 130
ГЛАВА V Выделение и характеристика кошонентов натриевого канала 147
ГЛАВА VI. Экспериментальная часть 166
УІ.І. Материалы 167
УІ.2. Выделение и характеристика полипептидных то ксинов 168
УГ.З. Структурный анализ полипептидных токсинов . 175
УІ.4. Изучение взаимодействия аксональных нейротоксинов с электровозбудимыми мембранами . 187
УІ.5. Выделение и характеристика компонентов на триевого канала 199
Выводы 205
Литература
- Полипептидные нейротоксины морских анемон
- Механизм действия и рецепция алкалоидных ней-ротоксинов
- Выделение и характеристика полипептидных то ксинов
- Изучение взаимодействия аксональных нейротоксинов с электровозбудимыми мембранами
Полипептидные нейротоксины морских анемон
Специфичность действия инсектотоксинов, по-видимому, основана на селективности их взаимодействия только с нервной системой насекомых Предполагается,, что эффект этих токсинов связан с модуляцией натриевой инактивации, сопряженной с повышением проницаемости для ионов натрия мембраны нервного волокна / 53 /. При введении насекомым инсектотоксины вызывают контрактуру и двигательный паралич / 53 /.
В таблице 2 приведены также аминокислотные составы четырех известных в настоящее время токсинов для ракообразных из яда скорпионов Scorpio maurus palmatus (Smp CT2, Smp СТЗа И Smp CTb) /54/ И Androctonus australis Hector (AaH CT) / 9 /.
Токсин AaS CT состоит из 70 аминокислотных, остатков с пятью внутримолекулярными дисульфидными связями В молекулах: токсинов ИЗ ЯДа Scorpio maurus palmatus отсутствуют остэтки метионинэ, лейцина, фенилаланина, гистидина и триптофана» Они построены из-31-34 аминокислотных остатков и имеют,, вероятно,, четыре дисуль-фидных мостика. Какие-либо данные о структуре и биологических свойствах этих токсинов практически отсутствуют.
Полипептидные нейротоксины морских анемон Морские анемоны и актинии продуцируют токсические компоненты полипептидной природы, обладающие мощным паралитическим действием на ракообразных- и рыб, и представляющие собой функциональные аналоги токсинов скорпиона. Наиболее хорошо изучены полипептидные нейротоксины ИЗ: анеМОНЫ Anemonia sulcata. ДЛЯ ПОЛуЧвНИЯ этих токсинов проводилась экстракция гомогената анемон горячим 50$ раствором этанола Затем токсические компоненты выделялись посредством хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе СМ-32,, SP -сефадексе С-25 и сефадексе G-БО . Окончательная очистка токсинов достигалась при помощи ионообменной хроматографии на SP сефадексе С-25 и ДЕАЕ-сефадексе А-25 / 55 / В результате в индивидуальном виде были получены три нейротоксина: АТХ I, П и Ш с молекулярной массой соответственно 4702 4197 и 2678 Да (значение ЛД5о для ATX-I и АТХ-П для крабов составляло менее 2 мкг/ кг). Интересно отметить, что при выделении токсических компонентов непосредственно из щупалец анемон удавалось получить только
Два токсина атх i и п / 56 /. в і98г году ИЗ Anemonia sulcata был получен также токсин АТХ-У / 57 /. Подобным образом индивидуальные: нейротоксины выделены из других видов морских анемон:
Все известны в настоящее время нейротоксины анемон за исключением ТОКСИНа АТХ-Ш ИЗ Anemonia sulcata ПредСТЭВЛЯЮТ СОбОЙ полипептиды с молекулярной массой около 5 кДа, обладающие основным характером (pi 8). На рис. 7 представлены установленные аминокислотные последовательности нейротоксинов морских анемон. Интересной особенностью АТХ I и П является- наличие одновременно двух аминокислотных остатков в положении S и 2. Все нейротоксины обладают заметной структурной гомологией и большим числом инвариантных аминокислотных остатков. Так,, гомология структур АТХ I и И составляет около 65$, a ATX-I и АР-А - 59$. Для токсина АТХ-П установлено положение внутримолекулярных дисульфидных связей между остатками цистеина 4-44, 6-34 и 27-45 (рис. 8). Предполагается, что в других токсинах анемон дисульфидные мостики занимают аналогичные позиции / 70 А
На фоне значительной структурной гомологии полипептидше токсины анемон весьма отличаются по биологическим эффектам. Например, АТХ-У в пять раз более токсичен.для млекопитающих, чем-АТХ-Н. Еще более значительны различия в действии АТХ-У и АТХ-І. Оба эти токсина обладают примерно одинаковой токсичностью по отношению к ракообразным, но АТХ-У примерно в 250 раз активнее АТХ-І при тестировании на мышах
По данным спектроскопии комбинационного рассеяния молекула токсина АТХ-П не обладает упорядоченной вторичной структурой. Щ и исследовании токсинов методами С ЯМР показано, что « .-аминогруппы АТХ-П и АР-А не взаимодействуют с концевыми карбоксилами, а у -карбоксилная группа, по-видимому, аспарагиновой кислоты - 7 обладает аномально низким значением рКа = 1,7. Вероятно, это объясняется: образованием солевого мостика между этой группой и лизином - 37 (АР-А)) или лизином-38 (АТХ-П); / 71 /
Механизм действия и рецепция алкалоидных ней-ротоксинов
Физиологическое действие алкалоидных нейротоксинов проявляется в нарушении дыхания, аритмии и фибрилляции сердца, контрактуре мышц, угнетении основных условных рефлексов,, ослаблении биопотенциалов головного мозга и др» / 137, 140, 148, 159, 162 А В основе этих эффектов лежит способность вызывать увеличение проницаемости электровозбудимых мембран в состоянии покоя для ионов натрия за счет активации быстрых натриевых каналов. По этой причине алкалоидные токсины носят другое название: токсины-активаторы. Подобный процесс сопровождается деполяризацией возбудимой мембраны и, следовательно,, нарушением нормальной функции нервных и мышечных клеток / 22, 127, 156, 162, I67-I7I /. Деполяризация имеет место при воздействий алкалоидов как изнутри, так и снаружи нервного волокна и снимается при удалении из среды ионов натрия. Тетродотоксин и сакситоксин неконкурентным образом блокируют действие алкалоидных токсинов, то есть являются их функциональными ингибиторами / 22, 156, 162, 172 /.
Стероидные нейротоксины затрагивают практически все параметры работы натриевых каналов и вызывают одновременное изменение процессов инактивации, активации и ионной селективности мембранных систем транспорта ионов натрия / 22, 156, 168, 173 /. Под влиянием этих нейротоксинов натриевые каналы частично или полностью утрачивают способность к инактивации. Потенциалозави-симость их активации сдвигается на 40-50 мВ в сторону отрицательных потенциалов,, а кинетика активации из s-образной становится экспоненциальной Постоянные времени активации увеличиваются при аппликации батрахотоксина в 5-Ю раз, а аконитина - в два раза. Селективность натриевых каналов значительно снижается для различных катионов и модифицированные каналы приобретают способность пропускать ионы рубидия, цезия и кальция / 168, 173-176 /.
Деполяризующий эффект алкалоидных нейротоксинов сопровождается рядом различных явлений: блоком быстрого аксонального транспорта / 177-178 /, увеличением уровня ц-АШ / 179 /, ингибирова-нием фосфорилирования белков нервной клетки / 180, 181 /, а так же. усилением секреции и уменьшением-аккумуляции нейромедиаторов нервными окончаниями / 182 /.
Наиболее сильным биологическим действием обладает батрахо-токсин, под влиянием которого натриевые каналы полностью теряют способность к инактивации, причем подавляется как быстрая, так и медленная натриевая инактивация. Активация каналов происходит уже при потенциалах около - 100 мВ. Селективность модифицированных каналов претерпевает изменения во время деполяризации мембраны / 183 /, а соответствующие расчеты показывают, что токсин о увеличивает размер селективного фильтра ионной поры до 3,8x6 А
Батрахотоксин снижает чувствительность натриевых каналов к действию местных анестетиков, антиаритмиков, стрихнина, оенантотоксина и тлі- / 168 /. Сделано предположение, что этот стероидный алкалоид взаимодействует главным образом с открытыми натриевыми каналами, находящимися в проводящем состоянии. На каждом канале есть только один рецепторний центр, с которым может связываться молекула токсина / 184 /. Поскольку токсин более активен при высоких значениях рН / 131 /,: а форма основания легче внедряется- в липидную фазу мембраны,; можно предположитьР что рецепторний центр локализован в гидрофобной части канала» По способности ингибировать аксональный транспорт батрахотоксин в 50000-100000 раз превосходит винбластин и винкристин. Действие токсина обратимо и его можно отмыть от мембранных препаратов, преимущественно находящихся в деполяризованном состоянии. Все указанные выше эффекты батрахотоксина не проявляются в присутствии тетродотоксина.
Другие алкалоидные нейротоксины также вызывают существенные изменения свойств натриевых каналов мембраны нервного волокна. Однако сила их. действия неодинакова.. При исследовании изме нения проницаемости синаптосомальныг мембран мозга крыс для ионов 22Na в присутствии токсинов было обнаружено, что максималь-ным эффектом обладал батрахотоксин (KQ 5 - 2x10 М), а вератри-дин и грайянотоксин индуцировали натриевую проницаемость более слабо (значения KQ g, соответственно ЮМ и ЗхЮ 5 М) / 185 /. В аналогичном эксперименте по изучению проникновения ионов натрия в клетки неиробластомы найдено,, что батрахотоксин способен активировать практически ЕСЄ натриевые каналы, в то время как грайянотоксин, вератридшги аконитин активировали соответственно 51$, 8% и 2% (табл 6)).
Выделение и характеристика полипептидных то ксинов
Определение токсичности яда и его фракций для млекопитающих проводили внутривенной или внутрибрюшинной инъекцией белым мышам весом около 20 г, причем для растворения токсичного материала использовали 1% раствор бычьего сывороточного альбумина в физиологическом растворе. Для каждой дозы использовали группы из трех животных и полученный результат Еыражали в мкг вещества (ЛД5о мкг/кг), вызывающего летальный эффект у 50% мышей в пересчете по методу / 340 / на I кг веса животных. Для определения паралитической активности к насекомым использовали тараканов Nauphoeta cinerea ВЄСОМ ОКОЛО 500 МГ. При ЭТОМ ИНЪеК цйи водных растворов тестируемого материала объемом до 10 мкл. проводили анестезированным (углекислым газом) насекомым под третий сегмент брюшка. Количество вещества, вызывающее длительный устойчивый паралич у 100$ тараканов, принимали за ДІОо и выражали в мкг на таракана.
В процессе деления яда использовали летучие буферные растворы на основе бикарбоната или ацетата аммония. Буферные соли из фракций удаляли при лиофилизации на приборе 10-ОЮ ( virtis, США). Спектрофотометрический контроль за разделением проводили на приборе Uvicord П ( LKB, Швеция) при 280 нм. Элюирование белкового материала с колонок осуществляли с помощью перистальтических насосов 12000 Varioperpex ИЛИ 2115 Multiperpex ( LKB, Швеция).
Гомогенность полученных фракций и индивидуальность токсинов контролировали с помощью электрофоретического анализа в 15$ полиакриламидном геле (рН 4,3) по методу Рейсфельда и др. / 341/ а также при определении N-концевых аминокислотных остатков по методу Грея / 342 /.
Ддя установления аминокислотного состава токсинов и других белковых веществ от 0,5 до 15 нмоль полипептида гидролизовали в запаянных вакуумированных стеклянных ампулах в присутствии 0,1-0,5 мл 5,7 н. соляной кислоты в течение 24 ч при 110. Количественный расчет аминокислотных остатков проводили на основании данных по кислотному гидролизу в течение 24, 48 и 72 ч серии параллельных образцов. Айптокислотшй анализ проводили на приборе ВС 201 ( Bio-Cal, ФРГ) или Д-500 ( Durrum, США). Число остатков серина и треонина устанавливали экстраполяцией к нулевому времени гидролиза, а валина, лейцина и изолейцина - по максимальному времени гидролиза. Количество свободных сульфгидриль-ных групп оценивали с помощью 5,5 -дитиобис(2-нитробензойной ки слоты) по методу / 343 /. При установлении содержания триптофа-на гидролиз осуществляли 4 Н метасульфонсвой кислотой в аналогичных условиях. Триптофан: определяли также спектрофотометриче-ски / 344 / на спектрофотометре модели 240 ( Gilford , Франция) по поглощению растворов известной концентрации в 10% уксусной кислоте, вычитая при этом поглощение остатков тирозина, число которых находили посредством аминокислотного анализа. При установлении аминокислотного состава пептидов использовали для гидролиза 2-Ю нмоль пептида.
Определение молекулярной массы полипептидных токсинов проводили по методу Эндрюса / 345 / с использованием сефадексов G-50 или G-200, а также посредством электрофоретического анализа в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия по методу Шапиро и др. / 346 /.
Яд среднеазиатского подвида скорпиона Buthus eupeus был получен из Института биохимии Ж УзССР и из Ташкентского зоо-комбината. 200-300 мг сухого яда суспендировали в 6-9 мл 0,1 М аммоний-бикарбонатного буфера (рП 8,2) и центрифугировали 60 мин при 40000 об/мин на центрифуге L5-50 ( Beckman, США). Осадок ресуспендировали в 2-3 мл того же буферного раствора и повторно центрифугировали. Объединенный супернатант пропускали через серию из трех хроматографических колонок (2,5x100 см) с биогелем Р-Г0, уравновешенным в том же буфере, со скоростью 30 мл/ч (рис. 22). Токсичную фракцию А далее разделяли хроматографией с рециклизацией в аналогичных условиях при скорости элюции 25 мл/ч. Полученные семь токсичных фракций подвергали разделению на колон ке (1,5x20 см) с СМ-целлюлозой СМ-32, уравновешенной в 0,05 М ацетате аммония (рН 4,5-5,0), посредством градиентного элгоиро-вания с повышением рН и концентрации аммоний-ацетатного буфера. Условия фракционирования: первый градиент - повышение рН до 7,5 (450 мл); второй градиент - повышение концентрации ацетата аммония (рН 7,5) от 0,05 до 0,5 М (550 мл); скорость элюции 25-50 мл/ч, объем фракции 8-15 мл. Токсичные фракции КМр КЪ , КМ, MHj и MJQ (рис. 23) хроматографировали с рециклизацией при скорости 5,2 мл/ч на колонке (1x100 см) с ДЕАЕ-сефадексом А-50 в 0,2 М аммоний-ацетатном буфере (рН 8,5). Обычно на третьем цикле достигалось удовлетворительное разделение полипептидных компонентов.
Изучение взаимодействия аксональных нейротоксинов с электровозбудимыми мембранами
Раствор аконитина в хлороформе упаривали на роторном испарителе до образования на внутренней поверхности колбы тонкой пленки. В центр колбы помещали вольфрамовую спираль и после вакуумирования в колбу пускали газообразный тритий (давление около ІСГ2 Тор). Затем осуществляли 5т-6 циклов нагрева спирали переменным током до температуры 2000К с промежутками в 10 с. После этого токсин растворяли, заново формировали пленку и повторяли мечение тритием ( процедуру повторяли 5-7 раз). Легко обмениваемый тритий удаляли из препаратов токсина многократной отгонкой с метанолом, меченый аконитин растворяли в хлороформе и очищали с помощью хроматографии в тонком слое силикагеля в системе хлороформ-циклогексан-диэтиламин (7:2:1). Зону, имеющую равную подвижность с нативным аконитином, собирали и элюировали метанолом. Окончательную очистку меченого токсина проводили на колонке (0,9x40 см) с сефадексом G-20 в системе хлороформ-метанол (1:1) при скорости элюции 4,5 т/ч. Идентификацию меченого токсина осуществляли посредством измерения радиоактивности аликвот фракцией. Фракции с максимальной радиоактивностью объединяли, удаляли растворитель упариванием на роторном испарителе и растворяли в метаноле, содержащем соляную кислоту (3-4 капли 5,7 н. кислоты на 20 мл;метанола). Раствор упаривали и сухой остаток растворяли в воде. Водный раствор меченого аконитина (1(Г4 - 5ХІСГ4 м) хранили в замороженном виде при -50С.
Тетродотоксин (3,13 мкмоль) растворяли в 250 мкл 0,5$ трифторуксусной кислоты, раствор лиофильно высушивали и смешивали с 0,62 мл раствора, содержащего 10 мМ уксусную кислоту и 5-ГО мМ Naio. ІГериодатное окисление проводили в течение 30 мин при комнатной температуре и останавливали добавлением ЗГ мкл 0,1 М раствора ацетата свинца. После охлаждения и удаления выпавшего осадка супернатант лиофилизовали. Полученный нор-тетродотоксин хранили при -50С
К 313 мклі 10 мМ раствора нортетродотоксина приливали 100 мкж 0,4 Ж аммоний-бикарбонатного буфера pff 7,I5v При охлаждении на ледяной бане через смесь в течение 5 мин пропускали через капилляр газообразную синильную кислоту, образующуюся при сливании 0,7 мл 5 М раствора цианистого натрия с 5; М серной кислотой. После дополнительного охлаждения на ледяной бане еще 15 мин к реакционной смеси добавляли с интервалом 1-2 мин 5x5 мкл Г М уксусной кислоты, раствор нагревали до комнатной температуры, приливали через 15 мин еще I мл: I М уксусной кислоты и лиофилизовали. Сухой остаток растворяли в воде и повторно лиофилизовали. Полученный циангидрин нортетродотоксина хранили при -50С.
К 0,2-1,5 мг циангидрина нортетродотоксина в 0,3 мл 0,5% уксусной кислоты добавляли катализатор (15$ палладий на угле) в соотношении 10:Г к исходному аналогу токсина. Смесь замораживали жидким азотом, вакуумировали, помещали в атмосферу 100$ трития, нагревали до комнатной температуры и выдерживали 3 часа при непрерывном помешивании (введение тритиевой метки осуществлялось на установке Института молекулярной генетики AHJ СССР). Затем откачивали тритий, катализатор отфильтровывали и промывали 5x0,& мл 10$ раствора уксусной-кислоты в метаноле. Объединенные растворы упаривали, добавляли 3 млі метанола и повторно высушивали. Эта операция повторялась еще дважды. Cyxoff остаток растворяли в Г0 мМ ацетате аммония (рН 7,0) и наносили на колонку (2-3 мл) с биорексом 70 в этом же буфере.. После пропускания через колонку 200-300 мл; того же буфера проводили хро-матографическое разделение в градиенте концентрации (10-200 ыЮ ацетата аммония при скорости элвдии 20 мл/ч в течение 12 ч. Радиоактивные фракций, содержащие меченый токсин, объединяли, лиофилизовали и повторно хроматографировали в аналогичных условиях.
