Введение к работе
Актуальность проблемы. В рамках биоорганической химии химия нуклеиновых кислот представляет собой обширный раздел, бурно развивающийся на протяжении последних 50 лет. Развитие методов синтеза НК обеспечило возможность поисковых исследований по применению олигонуклеотидов природного строения, их производных, аналогов (АО) и миметиков НК для решения фундаментальных научных проблем молекулярной биологии.
В процессе поиска подходов к решению одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии, а именно - к выяснению функций отдельных генов и возможности избирательной регуляции их экспрессии, был предложен метод комплементарно-адресованной модификации НК. Позднее идея антисмысловой регуляции экспрессии генов была продемонстрирована на примере подавления репликации и трансляции вируса саркомы Рауса с помощью олигодезоксирибонуклеотидов (OdN), комплементарных вирусной РНК. В последние 30 лет этот подход в разных вариантах (антисмысловая - «antisense», или смысловая - «sense», стратегии) интенсивно применяется как при изучении, например, фундаментальных проблем молекулярного эмбриогенеза, так и при разработке и внедрении в медицинскую практику новых типов лекарственных средств. Другой крайне важной областью, где прогресс немыслим без широкого применения природных и модифицированных олигонуклеотидов, является диагностика наличия с помощью зондов на основе OdN определенных последовательностей НК в биологических образцах или других препаратах.
Еще в начале поисковых исследований по применению олигонуклеотидов в качестве инструментов молекулярно-биологических исследований стало ясно, что дальнейшее изучение взаимодействия OdN с клетками, попытки регуляции экспрессии генов с помощью антисмыслового подхода и применение олигонуклеотидов в медицинской практике сталкиваются с серьезными проблемами. Первая проблема заключалась в отсутствии эффективных методов синтеза OdN в количествах, достаточных для широкомасштабных фундаментальных исследований и практического применения. Вторая проблема - олигонуклеотиды природного строения плохо проникают через клеточные мембраны и быстро деградирут в биологических средах под действием ферментов. Кроме того, OdN не обладают достаточным разнообразием функциональных групп для создания новых поколений инструментов молекулярной биологии, например, диагностических зондов и аптамеров, что ставит перед исследователями задачу дополнительной функционализации олигонуклеотидов. Возможность обратимого модифицирования OdN открывает новые перспективы в применении производных OdN при изучении белково-нуклеиновых взаимодействий, для аффинной хроматографии, при направленной регуляции экспрессии генов.
На пути к решению этих проблем были предложены эффективные методы синтеза олигонуклеотидов на полимерном носителе и в растворе. Для повышения устойчивости к ферментативной деградации и улучшения проникновения через клеточные мембраны было признано необходимым использовать модифицированные олигонуклеотиды. Было отмечено, что особенно удобно проводить модифицирование олигонуклеотидов, если на конце олигомера имеется фосфатная группа. Это связано с наличием предложенных к тому времени эффективных и селективных методов активации моноэфиров фосфорной кислоты, что позволяет легко синтезировать конъюгаты олигонуклеотидов с остатками,
содержащими различные функционально активные группы (алкилирующие, фотоактивируемые).
Однако, достигнутый к началу 90-х гг. уровень исследований по синтезу природных и модифицированных OdN не позволял в полной мере решить существовавшие проблемы ввиду недостаточного развития препаративных методов и стратегии получения производных олигонуклеотидов. Мало разработанными оставались подходы к обратимому модифицированию OdN и ферментативные способы синтеза модифицированных OdN. Практически отсутствовали примеры многофункциональных и глубоко модифицированных производных (миметиков НК).
В связи с изложенным, необходимо было осуществить исследование, направленное на разработку методов синтеза модифицированных OdN, особенно подходов, позволяющих эффективно получать значительные количества этих соединений как в плане увеличения разнообразия структур, так и с точки зрения масштабирования синтеза конкретных олигомеров. Общая стратегия при этом должна была быть направленной на создание эффективных инструментов решения фундаментальных задач молекулярной биологии. При этом приоритетными изменениями физико-химических и биологических свойств природных соединений представлялись повышение термостабильности комплементарных комплексов их производных, разработка подходов к обратимому модифицированию, создание новых аналогов OdN и миметиков НК, перспективных для изучения регуляции экспрессии генов с помощью антисмыслового подхода, увеличение разнообразия функциональных групп в олигонуклеотидах для синтеза высокофункционализированных НК.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлась разработка методологии получения модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов, в том числе в препаративных масштабах, для создания эффективных инструментов молекулярно-биологических исследований. Для этого необходимо было решить следующие задачи:
-
Модернизировать синтетическую базу получения природных и модифицированных OdN в препаративных количествах. Предполагалось разработать новый эффективный метод синтеза защищенных мономеров и усовершенствовать триэфирный метод синтеза 5'-фосфорилированных OdN в растворе с использованием 5'-фосфо-2'-дезоксинуклеотидов в качестве исходных соединений.
-
Создать комплекс подходов к синтезу модифицированных по сахарофосфатному остову и по гетероциклическим основаниям OdN. Предполагалось разработать новые подходы к синтезу производных OdN, модифицированных по сахарофосфатному остову и по гетероциклическим основаниям, в том числе с обратимыми в случае необходимости модификациями. Для модифицирования OdN по концам олигомера предполагалось разработать новые методы получения бис-модифицированных производных и изучить различные стратегии синтеза 5'-конъюгатов с использованием 5'-фосфорилированных OdN.
-
Осуществить дизайн и разработать методы синтеза новых производных олигонуклеотидов. Предполагалось осуществить дизайн и разработать методы синтеза новых конъюгатов и аналогов OdN и новых миметиков НК с учетом выбранных приоритетных направлений изменения физико-химических и биологических свойств природных соединений, разработать новые методы синтеза трифосфатов природных и модифицированных OdN (на примере динуклеотидов), как потенциальных субстратов для получения высокофункционализированных НК ферментативными методами.
Научная новизна и практическая значимость работы. Настоящая работа представляет собой систематическое исследование, посвященное разработке комплекса подходов к синтезу модифицированных OdN, в результате которого создана новая методология получения модифицированных OdN, в том числе в препаративных количествах.
Разработан эффективный препаративный метод получения природных и модифицированных OdN, основанный на применении триэфирного метода синтеза в растворе с использованием 5'-фосфатов 2'-дезоксинуклеозидов в качестве исходных соединений. Метод отличается универсальностью, масштабами синтеза и экономичностью. С его помощью получены серии 5'-фосфорилированных природных и модифицированных OdN в препаративных количествах. Эти олигомеры успешно использованы сотрудниками НИБХ СО АН и ИХБФМ СО РАН в качестве инструментов молекулярно-биологических исследований при проведении большого цикла фундаментальных работ по изучению закономерностей комплементарно-адресованной модификации НК, исследованию возможностей антисмыслового подхода к регуляции экспрессии генов и контролированию развития вирусных инфекций в культурах клеток и in vivo. С использованием полученных в настоящей работе фосфотриэфирных этилированных аналогов олигонуклеотидов сотрудниками НИБХ СО АН осуществлен цикл фундаментальных исследований по выявлению зависимости степени поглощения олиготимидилатов клетками от гидрофобности олигомеров (доли фосфотриэфирных фрагментов) и от конфигурации асимметрического фосфотриэфирного центра. Обнаружена зависимость степени комплементарно-адресованной модификации поли(А)-трактов мРНК этиловыми эфирами олиготимидилатов от конфигурации при асимметрических атомах фосфора в культуре клеток.
Применение эффективного препаративного метода получения природных и модифицированных OdN в растворе, разработанного в ходе настоящего исследования, позволило обеспечить модельными соединениями проведение фундаментальных работ по определению пространственной структуры комплементарных комплексов природных OdN, их конъюгатов и аналогов в растворе методом ЯМР в НИБХ СО РАН и Университете штата Техас (США). В настоящее время мы работаем над дизайном и синтезом модельных соединений (конъюгатов моно-, ди- и олигонуклеотидов) для изучения химической поляризации ядер методом ЯМР в МТЦ СО РАН.
В ходе разработки комплекса подходов к синтезу модифицированных по сахарофосфатному остову и по гетероциклическим основаниям OdN получены новые 5'-и/или З'-конъюгаты OdN с соединениями различной природы: интеркалирующими (хромонами, кумаринами), реакционноспособными (порфиринами, фталоцианинами, урокановой и имидазолуксусной кислотами), гидрофобными (холестерином) остатками. Для синтеза OdN, модифицированных внутри олигонуклеотиднои цепи, впервые предложено использовать амидофосфиты, содержащие метоксиоксалильные группы-предшественники, присоединенные к гетероциклическим основаниям или к углеводному остатку. Реализация прекурсорного подхода с помощью этих синтонов открывает перспективы получения олигомеров, модифицированных внутри цепи, методами комбинаторной химии.
В ходе поиска транспортных форм OdN, предназначенных для антисмысловой терапии (npo-OdN), предложен новый подход к обратимому блокированию межнуклеотидных фосфатных групп в OdN, заключающийся в применении фотолабильных фосфотриэфирных аналогов OdN. В рамках подхода осуществлен дизайн и разработаны
методы синтеза новых фотолабильных триэфирных аналогов олигонуклеотидов в растворе и на полимерном носителе. Найдены условия фотодеблокирования этих соединений.
Для осуществления обратимого модифицирования OdN по концам олигомера или внутри цепи предложены оригинальные универсальные фотолабильные линкерные группы, содержащие о-нитробензильный фрагмент. Дизайн новых линкеров позволяет реализовывать различные стратегии синтеза конъюгатов OdN, гибко варьируя методы получения и место модифицирования в зависимости от целей дальнейшего применения конъюгатов.
Предложен новый эффективный метод синтеза 5'-трифосфатов природных динуклеотидов, основанный на активации 5'-монофосфата динуклеотидов под действием 2,2'-дипиридилдисульфида и трифенилфосфина в присутствии нуклеофильного катализатора. Разработан новый подход к синтезу 5'-трифосфатов модифицированных моно- и динуклеозидов. Подход заключается в комбинации синтеза нуклеозидной части молекулы в растворе с использованием широкого арсенала олигонуклеотидной химии с последующим введением трифосфатного остатка в защищенные соответствующим образом олигомеры и последующей постсинтетической обработке в случае необходимости. Разработанные методы обеспечивают получение природных и модифицированных 5'-трифосфатов моно- и динуклеотидов с высоким выходом и в препаративных количествах.
С использованием новых подходов и методов созданы серии 5'-трифосфатов природных и модифицированных динуклеотидов - потенциальных субстратов для ферментов матрично-зависимого синтеза олигонуклеотидов. Трифосфаты содержат широкий спектр модификаций как в углеводофосфатном остове, так и в гетероциклических основаниях и могут быть полезны при синтезе высокофункционализированных НК или при создании аптамеров. Методы синтеза трифосфатов природных и модифицированных динуклеотидов защищены патентами РФ.
Разработаны дизайн и оригинальная стратегия получения новых оксалилдиамидных миметиков НК с использованием морфолиновых аналогов нуклеозидов. Стратегия основана на разности реакционных способностей аминогрупп мономерных синтонов и заключается в применении бифункциональных реагентов и минимального количества защитных групп. Разработаны новые методы синтеза в растворе и на полимере JV-метиленкарбоксамидных морфолиновых миметиков НК - урацил- и аденин-содержащих олигомеров длиной до 12-16 звеньев. Впервые показано, что комплексы N-метиленкарбоксамидных аденин-содержащих олигомеров с поли(и) обладают большей термостабильностью в сравнении с поли((1Т).
Предложенные в работе подходы и методы позволяют осуществлять дизайн новых производных OdN и создавать новые инструменты молекулярно-биологических исследований на основе природных и модифицированных OdN.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы опубликованы в 24 статьях (2 обзорах) и 2 патентах. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: VIII Всесоюзный симпозиум по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Рига, СССР, 1989); International Symposium "Synthetic oligonucleotides: Problems and Frontiers of Practical Application (Moscow, USSR, 1991); International Conference on Nucleic Acid Therapeutics (Holyday Inn Surfside, Clear Beach, USA, 1991); X Congresso Nationale della Divisione di Chimica Farmaceutica della Societa Chimica Italiana (Siena, Italy, 1991); XVII Congresso Nationale della Societa Chimica Italiana (Genova, Italy, 1992);. Russian-French Symposium
"Molecular mechanisms of gene expression" (Novosibirsk, Russia, 1995); International Conference "RNA as therapeutic and genomics target" (Novosibirsk, Russia, 2001); Workshop "Biology and Biochemistry of Extracellular Nucleic Acids" (Novosibirsk, Russia, 2003); International Symposium "Advances in Science for drug discovery" (Moscow, Russia, 2005); International Conference on Chemical Biology (Novosibirsk, Russia, 2005); 31st FEBS Congress "Molecules in Health and Diseases" (Istanbul, Turkey, 2006); Международная конференция «Физико-химическая биология» (Новосибирск, Россия, 2006), Eight Tetrahedron Symposium "Challenges in Organic Chemistry" (Berlin, Germany, 2007); IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008); Joint Symposium of the 18th International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids and the 35th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry (Kioto, Japan, 2008); V Съезд Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, Россия, 2008)'; 2nd International Symposium-Cum-Training Course on Molecular Medicine and Drug Design (MMDR-2) (Karachi, Pakistan, 2009); Научная конференции «Химическая биология -Фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (Новосибирск, Россия, 2009); XIX International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (Lyon, France, 2010); Ilnd International conference «Physico-Chemical Biology» dedicated to the 85th anniversary of academician D. G. Knorre (Novosibirsk, Russia, 2011); Sixth Cambridge Symposium on Nucleic Acids Chemistry and Biology (Cambridge, UK, 2011).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 411 страницах, содержит 56 рисунков, 64 схемы и 9 таблиц. Библиография включает 603 литературных источника.
