Содержание к диссертации
Введение
2. Стерины губок 8
2.1. Литературный обзор 8
2.1.1. Общие сведения о стеринах 8
2.1.2. Методы исследования стеринов 9
2.1.2.1. Хроматографическое выделение и разделение стеринов 9
2.1.2.2. Газо-жидкостная хроматография 9
2.1.2.3. Масс-спектрометрия 10
2.1.2.4. СпектроскопияЯМР'Ни 13С 11
2.1.3. Некоторые литературные данные о губках и их стеринах 12
2.2. Обсуждение результатов 14
2.2.1. Выделение фракций свободных стеринов губок и их разделение 14
2.2.2. Стерины трех губок рода Xestospongia (отряд Haplosclerida, семейство
Petrosiidae) 15
2.2.3. Стерины и другие стероидные соединения пяти губок рода Haliclona (отряд Haplosclerida, семейство Chalinidae) ,...23
2.2.4. Стерины Callyspongia sp. (отряд Haplosclerida, семейство Callyspongiidae) ЗО
2.2.5. Стерины двух губок рода Amphimedon (отряд Haplosclerida, семейство Niphatidae) 31
2.2.6. Стерины семи губок рода Oceanapia (отряд Haplosclerida, семейство Phloeodictyidae) 33
2.2.7. Стерины Lissodendoryx behringi (отряд Poecilosclerida, семейство Coelosphaeridae) 39
2.2.8. Стерины Clathria major (отряд Poecilosclerida, семейство Microcionidae) 40
2.2.9. Стерины Monanchora clathrata (отряд Poecilosclerida, семейство Crambeidae) 41
2.2.10. Стерины двух образцов губки Geodinella robusta (отряд Astrophorida, семейство Geodiidae) 44
2.2.11. Стерины Erylus formosus (отряд Astrophorida, семейство Geodiidae) 45
2.2.12. Стерины Melophlus sarasinorum (отряд Astrophorida, семейство Ancorinidae) 46
2.2.13. Стерины Agelas mauritiana (отряд Agelasida, семейство Agelasiidae) 47
2.2.14. Стерины Darwinella australiensis (отряд Dendroceratida, семейство Darwinellidae) 49
2.2.15. Стерины Scalarispongia sp. (отряд Dictyoceratida, семейство Thorectidae) 51
2.2.16. Стерины губки Phakellia elegans (отряд Halichondrida, семейство Axinellidae) 51
2.2.17. Стерины губки Teichaxinella labirintica (отряд Halichondrida, семейство Axinellidae) 58
2.2.18. Стерины неидентифицированной губки сем. Axinellidae (отряд Halichondrida) 62
2.2.19. Стерины Didiscus aceratus (отряд Halichondrida, семейство Desmoxyidae) 63
2.2.20. Стерины Topsentia sp. (отряд Halichondrida, семейство Halichondriidae) 64
2.2.21. Стерины Axynissa aplysinoides (отряд Halichondrida, семейство Halichondriidae) 65
2.2.22. Стерины неидентифицированной известковой губки (класс Calcarea) 68
2.2.23. Некоторые заключения из сравнительного анализа стеринов изученных губок 69
2.3. О функциях стеринов губок 70
3. Токсины, сопутствующие изученным стеринам 74
3.1. Гемолитическая активность спиртовых экстрактов исследованных губок 74
3.2. Свободные жирные кислоты из Amphimedon sp. 1: 75
3.3. Сестертерпеноиды из губки Darwinella australiensis 78
3.4. Тритерпеновые гликозиды из губки Melophlus sarasinorum 87
3.5. Тритерпеновые гликозиды из губки Erylus formosus 99
3.6. 2,3-Секо-стероидные кислоты из губки Haliclona sp. 5 100
3.7. Дитерпеноиды с 9-метиладениновым фрагментом и бромсодержащий алкалоид из губки Agelas mauritiana 106
3.8. Биполярный сфингозиноподобный липид из губки Oceanapia sp. 1 110
3.9. Производное сесквитерпеноида из губки Axinyssa aplysinoides Ill
3.10. Полициклический гуанидиновый алкалоид из губки Monanchora clathrata...113
3.11. Результаты параллельного исследования разных групп вторичных метаболитов губок 115
4. Экспериментальная часть 119
5. Выводы 147
6. Список цитируемой литературы
- Хроматографическое выделение и разделение стеринов
- Стерины Monanchora clathrata (отряд Poecilosclerida, семейство Crambeidae)
- Сестертерпеноиды из губки Darwinella australiensis
- Производное сесквитерпеноида из губки Axinyssa aplysinoides
Введение к работе
Губки (тип Porifera) принадлежат к одной из самых древних групп животных и имеют самый разнообразный набор стеринов среди представителей животного царства. Стерины губок включают как обычные для эукариотических организмов мембранные компоненты (холестерин и его распространенные производные), так и соединения с необычными структурными чертами, функциональная роль которых остается неясной [1-3]. Исследование функций необычных стеринов морских губок до сих пор является актуальным направлением в изучении этих соединений.
Полученные ранее результаты параллельного изучения цитотоксичных вторичных метаболитов и стериновых фракций из одних и тех же морских беспозвоночных (голотурий, морских звезд, губок) позволили предположить, что, по крайней мере, в ряде случаев замена обычных стеринов на редкие представляет собой механизм защиты мембран токсин-продуцирующих видов от воздействия собственных токсинов. Наличие такой функциональной взаимосвязи («биохимической координации») в голотуриях и морских звездах между А7-стеринами и етанолами, с одной стороны, и токсичными гликозидами, с другой стороны, было обосновано ранее [4]. Была высказана гипотеза, что и в губках наличие разных необычных стеринов может быть связано с присутствием различных сопутствующих мембранолитических токсинов [5, 6].
Мембранотропные вторичные метаболиты губок давно рассматриваются в качестве потенциальных лекарственных средств. Если механизм их цитотоксического воздействия связан со стериновыми составляющими мембран, то изучение стеринов соответствующих продуцентов перспективно с точки зрения создания комбинированных препаратов с пониженной токсичностью.
Данная работа является первым систематическим изучением биохимической координации среди губок. Целью настоящего исследования являлись выделение, установление структуры свободных стеринов и сопутствующих им гемолитиков и цитотоксинов губок, а также выявление некоторых закономерностей совместного присутствия этих двух различных по своим биологическим функциям групп соединений (стеринов и токсинов) в организме животного. В дополнение к этому представляло интерес изучение распределения свободных стеринов в представителях различных таксонов Porifera, что могло дать новую хемотаксономическую информацию.
В данной работе мембранолитическая активность этанольных экстрактов, фракций и индивидуальных соединений была определена на мышиных эритроцитах. Как известно, эритроциты животных имеют высокое содержание холестерина (25-30%) и являются традиционной моделью для изучения функционального состояния мембран. В случае
гемолиза визуально наблюдается непосредственный результат действия различных веществ на мембрану эритроцитов.
В качестве объектов исследования были выбраны тридцать пять образцов губок, относящихся, за исключением одной известковой губки (класс Calcarea) к классу Demospongiae. Мы изучили стерины данных беспозвоночных, а также гемолитическую активность этанольных экстрактов большинства губок. Этанольные экстракты из тридцати видов показали различную степень гемолитической активности, вплоть до ее отсутствия. Из экстрактов семи губок, показавших наибольшую активность, нами были выделены гемолитические агенты разной химической природы (жирные кислоты, терпеноиды, гликозиды, стероидные кислоты, алкалоиды).
В диссертации использованы следующие сокращения:
ТСХ — тонкослойная хроматография; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография высокого давления; ГЖХ - газо-жидкостная хроматография; ОВУ -относительное время удерживания; СК ЯМР Ни С — спектроскопия ядерного магнитного резонанса на протонах и ядрах углерода; КССВ - константа спин-спинового взаимодействия; ХС - химический сдвиг; DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) - ЯМР-эксперимент с неискаженным усилением сигнала с помощью переноса поляризации с протона на ядро углерода; ID NOE (Nuclear Overhauser Effect) — одномерный ЯМР-эксперимент ядерного эффекта Оверхаузера; NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера; COSY (Correlation Spectroscopy) - корреляционная спектроскопия; TOCSY (Total Correlation Spectroscopy) - полная корреляционная спектроскопия; HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) - ЯМР-эксперимент гетероядерной одноквантовой корреляции; НМВС (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation) - ЯМР-эксперимент гетероядерной корреляции через несколько связей; МС - масс-спектрометрия; HRFABMS (High Resolution Fast Atom Bombardment Mass-spectrometry) - масс-спектрометрия высокого разрешения с ионизацией быстрыми атомами; MALDIOF (Matrix Assistant Laser Desorbtion/Ionization Time-of-Flight Mass-spectrometry) - масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией/ионизацией; ГЖХ-МС - хромато-масс-спектрометрия; CAD (Collision Activation Dissociation) - вид масс-спектрометрии с диссоциацией, активированной столкновениями.
Нам представлялось удобным использовать для стероидных соединений часто употребляемую для них нумерацию, при которой стероидные ядра обозначаются буквами, а боковые цепи - цифрами. Таким образом, каждому стерину (стероиду) дается обозначение, состоящее из одной буквы и одной цифры. Например, холестерин будет иметь при этом номер А4. Соединения нестероидного характера пронумерованы обычным способом. Ниже приводятся структуры и буквенные обозначения тетрациклических ядер стероидов (схема 1) и их боковых цепей (схема 2). Среди стероидов, представленных на схемах 1 и 2, присутствуют как соединения, идентифицированные в данной работе, так и те, которые упоминаются при обсуждении результатов.
Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Макарьевой Т.Н., а также академику Стонику В.А. за чуткость и всяческую поддержку, к.х.н. Денисенко В.А., к.х.н. Дмитренку А.С, н.с. Дмитренку П.С., Моисеенко О.П., к.б.н. Прокофьевой Н.Г., к.х.н. Пономаренко Л.П. за съемку ЯМР- и масс-спектров, проведение биотестирования и ГЖХ-анализа, за абсолютно бескорыстную помощь в работе, ценные идеи и критические замечания.
Хроматографическое выделение и разделение стеринов
Однако даже такой мощный метод разделения, как ГЖХ, нередко не позволяет полностью идентифицировать сложные смеси стеринов из морских организмов. Поэтому широко применяют сочетание ГЖХ и масс-спектрометрии (хромато-масс спектрометрию), что позволяет в процессе хроматографического разделения фракции получать масс-спектры ее компонентов.
Наиболее часто для идентификации стеринов применяется масс-спектрометрия электронного удара. Основные закономерности фрагментации стероидных спиртов были установлены Джерасси [12], Вульфсоном и Заикиным [13] и другими. Масс » спектрометрия дает возможность подтвердить стероидную природу изучаемого соединения, установить наличие и положение кратных связей, а также алкильных заместителей в ядре или в боковой цепи. Наиболее характеристичные сигналы в масс спектрах ацетатов стеринов приведены в таблице 1 (эти производные чаще используют для идентификации стеринов) [2].
Широкое использование в структурных исследованиях морских стеринов нашла ЯМР-спектроскопия, особенно на ядрах водорода. При изучении стероидов с помощью Н ЯМР-спектроскопии большое значение имеет анализ химических сдвигов (ХС) сигналов ангулярных метильных групп. Положение этих сигналов характеристично для различных типов ненасыщенности стероидного ядра (таблица 2).
Положение сигнала СНз-18 зависит от строения боковой цепи сильнее, чем СНз-19. Например, у соединений Д5-ряда 8н СНз-18 находится в диапазоне 0,62-0,74 м.д. и может заметно сдвигаться в слабое поле у стеринов с двойной связью в боковой цепи по сравнению со стеринами с насыщенной боковой цепью [15].
Кроме того, определение точных значений ХС протонов других метильных групп дает возможность установить стереохимические особенности изучаемых соединений. Например, эпимерные по С-24 стерины часто идентифицируют в экстрактах морских организмов по их спектрам ЯМР. В тех случаях, когда оба эпимера присутствуют в экстракте, их разделение хроматографическими методами выполнить, как правило, не удается. Если же в природной смеси имеется только один из эпимеров, то его стереохимическая идентификация затруднена из-за отсутствия различий между эпимерами в ИК-, УФ-, масс-спектрах, небольшой разницы в их температурах плавления и удельном вращении. Для определения конфигурации при С-24 применяют Н ЯМР-спектроскопию, используя характеристичность ХС протонов метильных групп СНз-21, СНз-26 и СНз-27 для той или иной конфигурации хирального центра С-24 [14, 18].
Различия в ХС атомов углерода боковой цепи позволяют также провести стереохимическую идентификацию таких стероидов по их спектрам 13С ЯМР [19-22].
Губки (тип Porifera) считаются простейшими из многоклеточных организмов. Это очень древняя группа животных, которая, по-существу, находится в эволюционном тупике [23]. Губки относятся к фильтрующим донным беспозвоночным. Все они имеют внутреннюю полость, в направлении которой через отверстия в теле перекачивается морская вода. Вместе с водой в тело попадают пищевые частицы, растворенное органическое вещество и кислород. Что касается пищевых частиц, то пищу губок составляют представители ультрапланктона (бактерии) и наннопланктона (микроводоросли, простейшие). С выходящим током воды удаляются продукты обмена. Клетки этих животных не образуют настоящих тканей (мышечных, нервных и т.д.) и обособленных органов. Имеющиеся ткани поддерживаются скелетом из твердых игл (спикул). Губки неподвижны, почти не реагируют на внешние раздражители.
В клетках или межклеточном матриксе данных морских беспозвоночных поселяются различные микроорганизмы: археи, бактерии, грибы, микроводоросли и простейшие. Поэтому губки часто представляют собой симбиотические системы.
Известны три класса губок: Calcispongiae или Calcarea (известковые), Hyalospongiae (стеклянные или шестилучевые) и Demospongiae (обыкновенные). О принадлежности той или иной губки к определенному классу свидетельствуют химический состав и устройство ее микроскелета [24]. Химически наиболее изучены губки самого распространенного класса Demospongiae.
Изучение стероидного состава губок показало, что наиболее широко в основной массе этих животных представлены А5-стерины с обычным строением циклической системы и боковой цепи, станолы (стерины с насыщенным ядром) присутствуют в минорных количествах [25-28]. Однако немало губок продуцируют стерины, не встречающиеся в других биологических объектах. Некоторые из них были найдены в последнее время в высших растениях, но исключительно в качестве минорных компонентов стериновых фракций.
Стерины Monanchora clathrata (отряд Poecilosclerida, семейство Crambeidae)
Эти соединения являются обычными стеринами пиррофитовых водорослей, но довольно редки для других биологических источников [2]. Наличие 4а-метил-стеринов определили с помощью Н ЯМР-спектроскопии по характерному положению сигнала Н За при 3,10 м.д., а также наличию дублета 4а-метильной группы при 0,99 м.д. (J=6,3 Гц) Ь [63]. Значения ХС сигналов протонов СНз-18 при 5 0,53-0,54 (для 4а-метил-Д7-стеринов), 0,66-0,68 (для 4а-метил-Д-стеринов) и СНз-19 при 5 0,80 соответствуют значениям ХС СНз-18 и СНз-19 для Д7- и Д-типов стеринов, не имеющих метильной группы при С-4.
Идентификацию отдельных компонентов проводили с помощью ГЖХ (ОВУ) и хромато-масс-спектрометрии, как в работе [64]. Так, в масс-спектре ацетата станола Е4 вместо обычного для 4а-десметил-станолов основного пика при m/z 215 присутствует пик при m/z 229 (100%), соответствующий фрагментарному иону, образующемуся в результате разрыва в кольце D 4а-метил-стерина. Масс-спектры гомологов Е8 и Е14 с насыщенным ядром и 22,23-двойной связью содержат интенсивные пики при m/z 271 (Ь/Ґ-АсОН-боковая цепь) и 329 (М -боковая цепь) вместо соответствующих пиков при m/z 257 и 315, как в спектрах Д22-станолов без 4а-метильной группы. В спектрах F13 и F8 ионы при m/z 327, 269, 227 и другие, характерные для 4а-метил-С28Д7-стеринов, имеют на 14 единиц большие величины m/z по сравнению с типичными фрагментарными ионами Д7-стеринов.
Идентифицированные нами 4а-метил-стерины, обычные для фитопланктонных динофлагеллят, могут иметь для изученной губки как пищевое, так и симбиотическое происхождение. В частности, представители этой группы микроводорослей, зооксантеллы, были ранее обнаружены в качестве внутриклеточных симбионтов морских губокHaliclona sp. [65] и Anthosigmella varians [66].
Мы не обнаружили в литературе данных по стериновому составу губок рода Monanchora. В то же время биохимически близка к М. clathrata губка Crambe crambe из того же семейства Crambeidae. Стериновая фракция Crambe crambe содержит 57,8% Д -стеринов, 15,5% Д -стеринов, 6,7% станолов и 13,7% Д -стеринов. Основной стерин этой губки был также идентифицирован как латостерин (С4) [67]. Хотя в М. clathrata мы не с п обнаружили Д -стеринов, но из ее спиртового экстракта нами была выделена фракция перекисей стеринов. В Н ЯМР-спектре этой фракции присутствовали сигналы протонов при 5 0,82 (с, СНз-18), 0,88 (с, СН3-19), два дублета при б 6,24 (д., J=8,6 Гц, Н-7) и 6,50 (д., J=8,6 Гц, Н-6), 3,97 (м., Н-3), которые указывали на наличие 5,8-эпидиокси-фрагмента в стероидном ядре обнаруженных соединений. Перекиси данного типа, как известно, образуются из Д5 7-стеринов при их окислении, что свидетельствует о прежнем наличии последнего типа стеринов в губке. Кроме того, из губок родов Monanchora и Crambe были выделены и другие одинаковые вторичные метаболиты, что привело исследователей к мысли объединить эти виды губок в один род [68].
В стериновых фракциях из глубоководного и мелководного сборов дальневосточных губок вида Geodinella robusta идентифицировано 18 известных С2б-С29-стеринов (таблица 19).
Стерины глубоководной G. robusta. Идентифицировано 15 С2б-С29-соединений: Д5-стеринов - 93,3%, станолов - 4,6%. В обоих сборах губок основным стерином является 24-метиленхолестерин (А10). Его содержание в мелководной губке составляет 38,3%, в глубоководной губке - 52,8%. В целом стериновые составы двух изученных образцов близки, имеются несущественные различия в количественном содержании ряда стеринов, а также в наличии следовых и минорных компонентов. К сожалению, мы не обнаружили никаких литературных сведений по стеринам рода Geodinella.
Стериновая фракция губки содержит 95,0% Д5-стеринов и 2,6% станолов. Основными компонентами являются фукостерин (А23, 30,7%) и 24-метиленхолестерин (А20, 29,0%). В литературе мы нашли сведения о стериновом составе другого сбора Е. formosus (Пуэрто-Рико) [69]. Фракция выделенных из него свободных стеринов включает 93,0% А5-стеринов и 7,0% станолов, основным компонентом является ситостерин (А20к, 57%). В пуэрториканской губке относительно много фукостерина (А23), но 24-метиленхолестерин (A10) не был обнаружен вовсе. Вероятная причина этого может заключаться в том, что идентификация стеринов в данном случае проводилась без разделения общей фракции на подфракции. А 24-метиленхолестерин (А10) и 24-метилхолест-5-ен-Зр-ол (А13), присутствовавший в пуэрториканской Е. formosus в значительных количествах, имеют практически идентичные времена удерживания.
Сестертерпеноиды из губки Darwinella australiensis
Интерпретация COSY- и TOCSY-спектров, начиная с сигнала Н-5 при 8 2,31, обнаружила присутствие линейной спиновой системы, включающей данный протон, протоны двух метиленовых, одной метиновой и метильной групп. Наличие этого фрагмента было подтверждено результатами эксперимента НМВС. Важные для # структурного анализа корреляции в спектре НМВС между сигналами протонов СНз-23 при 5 1,14 и ядер углерода при 5 178,3 (С-10), 47,8 (С-8), 46,2 (С-9) указывали на наличие в структуре выделенного соединения циклогексанового кольца с двумя метальными заместителями, конденсированного с циклогексеноновым кольцом.
Из шести олефиновых углеродов, имеющихся в молекуле, значения ХС сигналов четырех - при 5 143,9 (СН), 140,1 (СН), 126,3 (С), 111,9 (СН) - обнаруживали присутствие 3-алкилфуранового фрагмента. Об этом же свидетельствовали значения констант спин спинового взаимодействия и мультиплетность сигналов протонов, присоединенных к данным углеродам, а также соответствующие НМВС-корреляции (таблица 39). Связь между фурановой и бициклической системами через углеводородную цепь была определена с помощью COSY, HSQC, НМВС-экспериментов. В ИК-спектре соединения присутствуют интенсивные полосы поглощения при 1260 и 1220 см"1, характерные для сульфатной группы. В "Н ЯМР-спектре наблюдали сигналы метиленовых протонов гидроксиметиленовой группы при 6 3,98 (д.д., J=9,3; 4,9 Гц) и 3,89 (д-Д-, J=9,3; 5,9 Гц). НМВС-Корреляции сигналов этих протонов с сигналами при 6 39,7 (СН-13), 32,3 (СНг-14) и 26,5 (СН2-12) указывали на локализацию сульфатной группы при С-24 боковой цепи.
Ключевые NOE-корреляции для Д -декалинового фрагмента соединения 48.
Бициклический фрагмент сестертерпеноида содержит асимметрические центры С-5, С-8 и С-9. Относительная стереохимия этих центров была установлена на основании экспериментов ROESY, ID NOE и спин-декаплинга. ROESY-Спектр содержит кросс-пики между сигналами Н-5 (б 2,31) и одного из Н-11 (5 2,05), что указывало на уис-ориентацию Н-5 и боковой цепи (рис. 10). Сигнал другого протона при С-11 (8 1,00) коррелирует с сигналом СНз-22 (5 0,60), что предполагает г/иоориентацию боковой цепи и СНз-22, а, следовательно, транс-расположение метильных групп СНз-22 и СНз-23. Ранее в работах [128, 129] приводились структуры халисульфатов со сходным бициклическим фрагментом, который имел только 2/ис-расположенные СНз-22 и СНз-23. В статье [130] других авторов заявляется о пересмотре относительной конфигурации в халисульфате 7, что было также связано с установлением /яранс-ориентации СНз-22 и СНз-23. Чтобы подтвердить транс-ориентацию этих заместителей в обнаруженном нами соединении, был проведен Н ЯМР-эксперимент с подавлением спин-спинового взаимодействия протонов, в результате которого при облучении протонов СНз-22 мультиплет Н-8 (б 1,38) трансформировался в дублет дублетов (J=12,7; 3,9 Гц). Как известно, дублет дублетов с указанными значениями КССВ соответствует протону, находящемуся в аксиальном положении - Н-8а. Следовательно, СНз-22 находится в экваториальном положении, а метальные группы при С-8 и С-9 - в тярднс-ориентации. Так, относительная конфигурация трех асимметрических центров в бициклической системе была определена как 5R , 8S , 9S . Следовательно, новому фураносестертерпеноиду халисульфату 8 соответствует структура 48. 21 Исходя из данных HRFABMS и 13С ЯМР-спектроскопии (таблица 39), для другого выделенного соединения полярной фракции мы предложили молекулярную формулу C25H39C 6SNa. Спектры ЯМР этого халисульфата имеют много общего со спектрами халисульфата 8. В то же время в них отсутствует сигнал карбонильной группы и вместо него имеется сигнал метиленового углерода при 8 24,3, отнесение которого как СНг-2 подтверждено двумерными экспериментами. В 13С ЯМР-спектре по сравнению со спектром соединения 48 изменились положения сигналов фуранового фрагмента: они находятся при б 177,2 (С-19), 174,6 (С-17), 115,4 (СН-18) и 75,0 (СН2-25). Соответствующие различия наблюдали и в спектре Н ЯМР, в котором вместо сигналов фуранового фрагмента появились новые сигналы при 8 5,89 (1Н, т., J=l,5 Гц) и 4,90 (2Н, уш. с). Спектр НМВС содержит кросс-пики между сигналами при б 174,6 (С-17), 115,4 (СН-18) и 75,0 (СН2-25) и триплетом аллильного Н-16 при 8 2,48. Сигнал при 8 177,2 (С 85 19) коррелирует с сигналами протонов кольца при 8 5,89 и 4,90. Кроме того, в ИК-спектре наблюдали полосу поглощения при 1740 см 1. Эти данные указывали на присутствие в структуре а,р-ненасыщенного у-лактона, продукта окислительной трансформации фуранового кольца. Так, было показано, что халисульфат 9 (49) является новым сульфатированным сестертерпеноидом, имеющим ненасыщенный лактонный фрагмент. На основании ROESY- и ID NOE-спектров был сделан вывод о том, что соединение 49 имеет такую же относительную конфигурацию бициклической части молекулы, как и 48. 50
Согласно данным HRFABMS и 13С ЯМР -спектроскопии, еще одному компоненту фракции сульфатированных сестертерпеноидов соответствует молекулярная формула С25Нз90б8Ыа. Значения ХС сигналов декалинового фрагмента и боковой цепи в спектрах ЯМР Н и 13С этого соединения и халисульфата 9 (49) почти идентичны (таблица 39). Однако имеются различия в области сигналов у-лактонного кольца. Кроме того, появился добавочный синглет метоксильной группы: 8н 3,52 (ЗН, с), 5с 56,8 (СНз). Изменения также наблюдали в ИК-спектре: полоса поглощения карбонильной группы находится при 1770 см"1. В НМВС-спектре сигналы трех из четырех углеродов лактонного кольца при 5 173,6 (С), 144,8 (СН) и 134,0 (С) коррелируют с сигналом соседних протонов при С-16 (5 2,28). Сигнал при 5 104,4 (СН) дает кросс-пики с сигналами олефинового и метоксильных протонов при 8 7,01 и 3,52, соответственно. В совокупности с результатами эксперимента COSY эти данные позволили сделать вывод о том, что метоксильная группа присоединена к С-19, а карбонильная группа находится в положении 25
Производное сесквитерпеноида из губки Axinyssa aplysinoides
После фракционирования сконцентрированного этанольного экстракта австралийской губки М. clathrata (бутанол/вода) из бутанол-растворимой фракции с помощью гель-фильтрации (этанол:хлороформ, 1:1), колоночной хроматографии на силикагеле (этилацетат:этанол, 1:1) и ВЭЖХ на обратной фазе (45% этанол) мы выделили ранее известный полициклический гуанидиновый алкалоид 110. Идентификацию проводили с помощью методов 1Н и 13С ЯМР-спектроскопии, включая эксперименты DEPT, HSQC, НМВС, COSY, NOESY.
ЯМР-Спектр выделенного соединения содержит сигналы двадцати одного углеродного атома. На присутствие гуанидинового фрагмента указывает сигнал при 5с 148,4 (гуанидиновый С-21), а также синглеты обменных протонов в !Н ЯМР-спектре при 8н 9,63 (NH ) и 9,89 (NH"). В 13С- и Н ЯМР-спектрах наблюдали сигналы ядер углерода и протонов дизамещенной двойной связи при 5с 133,7 и 129,7, 5н 5,48 (д.т., J=2,2; 11,0 Гц) и 5,67 (м.). На наличие кислорода и азота в структуре соединения указывают сигналы связанных с ними двух четвертичных углеродов при 5с 83,5 и 80,1, двух О-связанных метановых групп при 6с 70,9 и 67,0, 5н 4,50 (м.) и 3,90 (м.), двух N-связанных метановых групп при 8с 53,0 и 51,4, 5н 4,02 (м., 2Н). Полные данные протонных и углеродных спектров (CDCb или CD3OD), а также НМВС-спектра для соединения 106 приведены в «Экспериментальной части». В NOESY-спектре (CDCb или CD3OD) наблюдали корреляции Н-За/Н-7а, Н-За/Н-6а, Н-7р/Н-9а, NH7H-19a, NH7H-3a, NH 7H-9P; кросс-пики Н-10р/Н-9р и Н-13р/Н-14р были гораздо интенсивнее сигналов Н-10р/Н-9а и Н-13р/Н-14а.
Вся полученная спектроскопическая информация указывала на то, что обнаруженное соединение является пентациклическим гуанидиновым алкалоидом крамбесцидином 359 (110), выделенным прежде из сейшельской губки Monanchora unguiculata [68].
При определении гемолитического эффекта крамбесцидина 359 оказалось, что этот алкалоид не вызывает гемолиза мышиных эритроцитов. Однако данное соединение проявляло цитотоксическую активность по отношению к мышиным опухолевым клеткам карциномы Эрлиха с ИК50 20 мкг/мл.
Судя по обзорным Н ЯМР-спектрам, губка содержит и другие полициклические гуанидиновые алкалоиды. Вероятно, в величину гемолитического эффекта спиртового экстракта М. clathrata (ГКюо 37 мкг/мл) могли вносить свой вклад также церамиды, содержание которых в губке по нашим данным превышает стандартную величину.
Итак, из этанольных экстрактов девяти изученных губок были выделены токсины различной химической природы и свободные стерины.
Из губки Amphimedon sp. 1, чей экстракт показал наибольшую гемолитическую активность, выделена сумма свободных жирных кислот, обладающих гемолитическими свойствами. Не исключено, что изученные жирные кислоты являются продуктами гидролиза фосфолипидов мембран, который, возможно, имел место в процессе хранения и экстракции губки. Поэтому их присутствие может быть не связано со структурным изменением в клеточных мембранах, в частности в составе стеринов. К тому же стериновый состав губки Amphimedon sp. 1 был близок к составам сумм стеринов из Amphimedon sp. 2 и Haliclona sp. 2, этанольные экстракты которых не показали гемолитической активности. Однако нельзя исключить, что в случае нативности выделенных жирных кислот реализуются другие способы защиты, например, через изменения в белковых или липидных компонентах клеток. В любом случае наличие предполагаемой биохимической корреляции «мембранолитические свободные жирные кислоты - необычные мембранные компоненты» еще предстоит проверить с помощью дополнительных экспериментов.
Из губки Darwinella australiensis были выделены сестертерпеноиды, наличие путей биосинтеза которых, вероятно, вызвало «количественный» метаболический сдвиг в сторону уменьшения биосинтеза свободных стеринов этого беспозвоночного (содержание терпеноидов 1,48%, а свободных стеринов 0,10% от сухого веса). Стериновая сумма губки состоит, в основном, из А - и Л -стеринов, необычной чертой является преобладание А -компонентов. Таким образом, этот пример может быть использован для изучения биохимической координации как со стороны качественного состава, так и количественного содержания биосинтезируемых вторичных метаболитов.
Из губок Melophlus sarasinorum и Erylus formosus были выделены суммы тритерпеновых гликозидов. Стериновые фракции этих двух губок содержат распространенные стерины и близки друг к другу по составу. Похожий набор стеринов имеет также губка Geodinella robusta, которая не содержит гликозиды и принадлежит к тому же семейству, что и Е. formosus. Ранее в нашей лаборатории были изучены стероидные гликозиды и свободные стерины из губки Mycale laxissima [172]. Стерины были представлены обычными компонентами, причем основными являлись холестерин (А4) и 24-метилхолеста-5,22-диен-Зр-ол (А8). Очевидно, литическое воздействие своих гликозидов на мембраны клеток губок блокируется иным путем, чем в голотуриях и морских звездах, то есть, без значительной структурной перестройки стериновых компонентов мембран. Содержание свободных стеринов от сухого веса в М. sarasinorum составляет около 0,35% (суммы гликозидов 2,39%), ав. formosus - 0,12%. То есть, у М. sarasinorum содержание стеринов близко к среднему значению для большинства губок, не синтезирующих гликозиды, а у Е. formosus меньше средней величины.
В губке Haliclona sp. 5 был обнаружен только холестерин в следовых количествах. Из ее экстракта выделены стероидные кетоны, эфиры обычных А5-стеринов, а также гемолитики 2,3-секо-стероидные кислоты. Возможно, в губке протекают интенсивные реакции окисления свободных стеринов, результатом чего стало практически полное отсутствие последних соединений. Так что наличие окисленных стероидов-гемолитиков является следствием необычности стеринового состава. В принципе, механизм гемолитического воздействия стероидных кислот может быть связан с их амфифильной природой и структурным сродством к стеринам мембран. Этот случай также укладывается в концепцию биохимической координации (вариант, когда наличие токсинов приводит к уменьшению количественного содержания стеринов).
