Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Общая характеристика микотоксинов 10
1.1.1 Механизм действия микотоксинов на животный организм 11
1.1.2 Т-2 токсин и его метаболиты 14
1.2 Использование клеточных культур в токсикологии 17
1.2.1 Культуры клеток как альтернативные модели в токсикологических исследованиях 17
1.2.2 Методы оценки цитотоксичности 22
1.3. Исследования токсичности микотоксинов на культурах клеток 35
2. Собственные исследования 44
2.1 Материалы и методы 44
2.1.1 Материалы исследований 44
2.1.2 Методы исследований 46
2.2 Результаты собственных исследований 49
2.2.1 Исследование цитотоксичности Т-2 токсина in vitro 49
2.2.2 Изучение видовых особенностей токсичности Т-2 токсина in vivo и in vitro 60
2.2.3 Исследование цитотоксичности НТ-2 токсина in vitro 62
2.2.4 Исследование динамики пролиферативной активности в культуре клеток при внесении Т-2 токсина 71
2.2.5 Цитотоксичность Т-2 токсина in vitro на фоне воздействия различных фармакологических средств 74
2.2.6 Определение перекисного окисления липидов 77
2.2.7 Изучение эффективности натрия селенита в качестве потенциального антидота Т-2 токсина 78
8 Изучение профилактической эффективности ксимедона в экспериментальном Т-2 токсикозе 79
9 Токсичность Т-2 токсина при постановке кожной пробы на кроликах 80 Обсуждение результатов собственных исследований 82
Цитотоксичность Т-2 и НТ-2 токсинов и роль при этом перекисного окисления липидов в механизме гибели клеток 82 Возможность использования культур клеток в качестве биопробы при Т-2 токсикозе 85
Возможность применения культур клеток для предварительного скрининга потенциальных антидотов при Т-2 токсикозе 88
Выводы 91
Практические предложения 93
Список литературы 94
Приложения
- Механизм действия микотоксинов на животный организм
- Культуры клеток как альтернативные модели в токсикологических исследованиях
- Исследование цитотоксичности Т-2 токсина in vitro
- Изучение эффективности натрия селенита в качестве потенциального антидота Т-2 токсина
Введение к работе
Актуальность темы. Вопросы этического, разумного и экономного использования животных в современных биологических исследованиях привлекают все большее внимание специалистов и общественности. На сегодня они вполне решаемы, поскольку существуют достаточные возможности не только для сведения количества подопытных животных к минимуму, но и к полной или частичной их замене (Червонская Г.П. и др., & 1998; Дядищев Н.Р. и др., 1998; Еропкин М.Ю., 1999; Botham P., Lewis R., 1996; Hurna Е., 1997; Combes R., Balls M., 2001 и др.).
На практике подобное можно осуществить благодаря широкому внедрению в эксперимент альтернативных биологических моделей, в том числе культуральных. Последние высокочувствительны к воздействию малых количеств испытуемых веществ, эффект которых на организменном уровне может проявиться лишь при больших дозировках и спустя значительное время (Червонская Г.П. и др., 1998; Афиногенова А.Г. и др., 1999; Еськов А.П. и др., 2003; Flint О., 1996; Louekari К., 1996 и др.).
Культуры клеток занимают все более заметное и важное место в токсикологических, фармакологических и других исследованиях. При этом сфера применения расширяется, а техника культивирования in vitro совершенствуется и автоматизируется. Использование культуральных тестов является свидетельством высокого уровня эксперимента в любой сфере как фундаментальных, так и прикладных народно-хозяйственных отраслях (Червонская Г.П. и др., 1998).
Между тем, дороговизна общепринятых химических методов анализа микотоксинов и изучения их токсических свойств на животных вынуждает к поиску и разработке новых более чувствительных и быстрых тестов. Биологические методы в этом плане перспективны и, несмотря на неспецифичность при идентификации микотоксинов, позволяют выявлять их присутствие в исследуемом субстрате (Watson D., Lindsay D., 1982; Buckle A., ш Sanders M., 1990; Babich H., Borenfreund E., 1991 и др.).
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение возможности использования клеточных культур (КК) как альтернативы традиционной методике кожной пробы при экспериментальном Т-2 токсикозе и для предварительного скрининга антидотов. В соответствии с целью исследования поставлены следующие задачи:
1. Сравнить различные методы оценки цитотоксичности in vitro;
2. Определить токсические дозы Т-2 и НТ-2 токсинов на (fc перевиваемых культурах клеток почек различных видов животных: крупного рогатого скота (MDBK), свиньи (СПЭВ), овцы (ППЭО) и собаки (MDCK);
3. Изучить коррелятивные отношения токсических доз исследуемых микотоксинов in vivo и in vitro;
4. Провести сравнительную оценку определения токсического действия Т-2 токсина биологической пробой на кроликах и культуральным методом;
5. Охарактеризовать in vivo и in vitro эффективность препаратов с потенциально антидотными свойствами при Т-2 токсикозе. Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное исследование цитотоксичности Т-2 токсина и его метаболита - НТ-2 токсина in vitro на перевиваемых культурах клеток различных видов животных. Определены цитотоксические дозы Т-2 и НТ-2 токсинов для клеточных линий MDBK, СПЭВ, ППЭО и MDCK. Показана дозозависимость fr цитотоксического эффекта данных микотоксинов, выражаемого изменением ростовых и пролиферативных характеристик клеточных культур, снижением жизнеспособности клеток in vitro. Изучены коррелятивные отношения между тестами in vivo и in vitro. Оценена возможность применения клеточных линий в качестве биологической пробы, а также для скрининга потенциальных антидотов при экспериментальном Т-2 токсикозе. Установлено значительное увеличение Т-2 токсином в дозе IC50 содержания , малонового диальдегида (МДА) в культуре клеток MDBK, С свидетельствующее о роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) в механизме гибели клеток in vitro при данном воздействии.
Практическая ценность работы. Результаты проведенных экспериментов расширяют сферу использования культур клеток в токсикологии. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения их в качестве биологического теста при выявлении микотоксинов. Клеточная модель - линия MDBK - проявила высокую $ чувствительность к исследованным лекарственным средствам (натрия селениту и ксимедону) при одновременном внесении с Т-2 токсином и может быть использована в дальнейшем поиске потенциальных антидотов.
Результаты исследования использованы при разработке «Методики по определению цитотоксичности медицинских металлических изделий», утвержденную директором ФГНУ ВНИВИ и генеральным директором ГУП ВНИПИМИ, 21.03.2002; «Методических указаний по санитарно микологической оценке и улучшению качества кормов», утвержденных директором ФГНУ ВНИВИ, 19.11.2003; «Методических рекомендаций по диагностике отравлений животных микотоксинами», утвержденных директором ФГНУ ВНИВИ, 20.12.2004.
Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, доложены и обсуждены на научно-практической конференции, посвященной 70-летию Казанского медико-инструментального завода (Казань, 2001); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы fa ветеринарной медицины», посвященной 60-летию факультета ветеринарной медицины Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2003), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы агропромышленного комплекса» (Казань, 2004), Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию ФГУП «Щелковский биокомбинат» «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее» (Щелково, 2004), Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.
Основные научные положения диссертации, выносимые на защиту:
метод расчета цитотоксичности in vitro;
использование клеточных культур для оценки токсического действия Т-2 и НТ-2 токсинов;
возможность использования КК для предварительного скрининга препаратов с потенциально антидотными свойствами при Т-2 токсикозе. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 110 стр, содержит 23 таблицы, проиллюстрирована 5 рисунками, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, приложения. Список литературы включает 180 библиографических источников, в т.ч. 119 на иностранном языке.
Механизм действия микотоксинов на животный организм
Микотоксины - вторичные метаболиты микромицетов, образуются из первичных метаболитов в процессе окисления, восстановления, алкилирования, галогенизации и конденсации. При раскрытии механизма действия микотоксинов необходимы знания их биосинтеза грибами и биотрансформации в организме животного. В настоящее время изучено четыре основных способа образования микотоксинов из первичных метаболитов: - поликетидный (характерен для афлатоксинов, стеригматоцистина, охратоксинов, патулина и др.); терпеноидный (характерен для трихотеценовых микотоксинов); через цикл трикарбоновых кислот (характерен для рубратоксинов): исходными соединениями служат аминокислоты; - смешанный, сочетание двух и более основных путей (характерен для производных циклопиазоновой кислоты). В начале цепи превращений трихотеценовых микотоксинов по терпеноидному пути стоит мевалонит, важным этапом при этом является продукция фарнезилпирофосфата. Образование основной циклической системы трихотеценовой молекулы происходит путем циклизации фарнезилпирофосфата - превращение в триходиен, триходиол и 12-,13-эпокситрихотецен.
Большинство микотоксинов попадает в организм путем всасывания из желудочно-кишечного тракта после поедания кормов, пораженных токсичными грибами. Из желудочно-кишечного тракта токсичные метаболиты через воротную вену проникают в печень, где происходит процесс их детоксикации. Продукты метаболизма микотоксинов с желчью выводятся в экскременты или через почки - в мочу, а далее - из организма (рис. 2).
Весь сложный процесс биотрансформации микотоксинов в организме базируется на двух основных этапах - метаболизации и конъюгации. При метаболизации микотоксины подвергаются гидролизу, окислению, восстановлению и другим различным реакциям. В результате метаболизации появляются новые функциональные группировки, являющиеся активным центром конъюгации. В процессе конъюгации метаболиты микотоксинов соединяются с различными веществами (аминокислотами, серной, глюкуроновой кислотами и др.), что блокирует функциональные группы -СООН и -ОН и приводит к снижению токсичности. Однако следует иметь в виду, что в процессе метаболизма иногда образуются и более токсичные, чем исходный микотоксин, вторичные продукты. Это явление называется метаболической активацией. При значительных количествах токсина, поступившего в организм, защитные силы не в состоянии провести его детоксикацию.
В механизме действия трихотеценовых микотоксинов - обширной группы токсических метаболитов, прослеживаются два основных пути. Трихотецены с выраженным токсическим действием (Т-2, ниваленол, веррукарин А и др.) ингибируют процесс инициации трансляции, то есть включаются на этапе перед образованием комплекса между рибосомой, информационной РНК, метионил-тРНК, включая пептидилтрансферазу, необходимую для образования первой пептидной связи.
Микотоксины воздействуют угнетающе на клеточные и гуморальные факторы иммунитета (Тремасов М.Я. и др., 1996; Pier А.С. et al, 1980). Установлено, что введение в организм животного микотоксинов приводит к уменьшению антителообразования (Chen Y., 1980; De Nicola D. et al., 1978) нарушению фагоцитоза (Тутельян B.A., Кравченко Л.В., 1985; Mann D., Buenind G., 1982). У животных, вакцинированных против бактериальных и вирусных инфекций на фоне микотоксикозов, отмечают прорывы иммунитета (Oswald LP., 1998). Микотоксины усугубляют тяжесть течения глубоких микозов.
Особенности подавления микотоксинами иммунных реакций определяются биохимическим механизмом их воздействия на клетки. Особую опасность, в связи с широким распространением в природе, представляют микотоксины микроскопических грибов из рода Fusarium и, в первую очередь, трихотеценовые микотоксины (ТТМТ), которые, как полагают, вызывают развитие алиментарной токсической алейкемии у людей (Тутельян В.А. и др., 1985).
Трихотеценовые микотоксины оказывают избирательное действие на кроветворные и иммунокомпетентные органы. Алиментарный токсикоз у крыс, вызванный зерном, зараженным Fusarium sporotrichiella, вырабатывающим Т-2 токсин сопровождался значительными изменениями ферментного статуса органов, участвующих в кроветворении и иммуногенезе. В печени это проявлялось умеренным снижением активности некоторых лизосомальных гидролаз, в селезенке, тимусе и костном мозге -возрастанием активности большинства изученных ферментов. Обнаруженное снижение активности лизосомальных ферментов и концентрации белка во всех органах и в сыворотке крови является следствием ингибирующего действия Т-2 токсина на биосинтез белка. Активация большинства лизосомальных ферментов в селезенке, тимусе и костном мозге связана с процессами деструкции и атрофии этих органов (Кравченко Л.В., Авреньева Л.И., 1984). Поступивший с кормом Т-2 токсин ассимилируется организмом животного из содержимого желудка и тонких кишок. В опытах на свиньях установлено быстрое распределение Т-2 токсина в органах и тканях животного (мышцах, печени, почках). Токсин вызывает воспаление слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта с участками некроза. Для него характерно избирательное поражение быстро делящихся клеток тимуса, костного мозга, лимфатических узлов.
Культуры клеток как альтернативные модели в токсикологических исследованиях
Понятие «альтернативные модели» в токсикологии включает в себя, прежде всего, использование в токсикологическом эксперименте различных клеточных культур (постоянных, первично-трипсинизированных и диплоидных клеточных линий) (Еропкин М.Ю., 1999). Культура клеток приобретает все большее значение в фармако-токсиколого-гигиенических исследованиях и экспертной оценке (Червонская Г.П. и др., 1997). Последние годы отмечены интенсивным внедрением в токсикологию альтернативных моделей. Это движение зародилось еще в пятидесятые годы, когда Russel W., Birch R. (1959) выдвинули концепцию проведения экспериментов на животных - так называемая концепция «трех R» -replacement (замена), reduction (уменьшение числа), refinement (увеличение чувствительности и точности метода, повышение качества эксперимента) (Balls М., Clothier R., 1991; Orlans В., 1996). К настоящему времени это движение оформилось в ряд национальных и международных организаций. В 1969 году по инициативе Дороти Хегерти (Лукьянов А.С. и др., 1996; Annett В., 1995) был создан Фонд финансовой поддержки работ по замене животных в медицинских исследованиях (FRAME) со штаб-квартирой в Ноттингене (Великобритания), который организовал выпуск специального журнала по альтернативным моделям - ATLA (Alternatives to Laboratory Animals). По инициативе FRAME были созданы Европейский центр по проверке (валидации) альтернативных методов (ECVAM) и Европейская исследовательская группа по альтернативам в токсикологическом тестировании (ERGATT) со штаб-квартирой в Испре (Италия). Аналогичные центры созданы и в других странах, например СААТ (Центр альтернатив тестирования на животных) при университете им. Дж. Хопкинса в США, ZEBET в Германии и др. Совместная деятельность FRAME и предприятий фармакологической промышленности направлена на уменьшение объема экспериментальных исследований на животных и замену их системами in vitro. Особое внимание обращено на финансирование исследований по созданию клонированных клеток человека, различающихся по метаболической активности, что необходимо для разработки систем анализа фармакокинетики in vitro (Blaauboer В., 1996). В целом использование животных при тестировании различных веществ снизилось. Так, концерн «Bayer» в период с 1984 по 1998 г. число животных, используемых в тестировании, уменьшил на 85%. Животные совершенно исключены из фототоксического теста и теста поражения кожи (In vitro toxicology industrial platform position paper, 2001).
С целью снижения числа животных, обновления методов и замены опытов на животных альтернативными экспериментами в 1979 году был образован комитет токсикологов. Многими странами, членами Единого Европейского Сообщества (EEC), приняты законы, ограничивающие проведение в токсикологии опытов на живых животных (Balls М.,1991). Так же, как внедрение альтернативных моделей в токсикологию, направление поиска альтернативных подходов может быть представлено тремя R (rapid, reliable, rational) - быстро, достоверно, рационально (Tanimura Т., Sakamoto М., 1995). В фундаментальных биологических исследованиях альтернативные методы, то есть эксперименты без использования лабораторных животных применяются все чаще. В 1987 году в США вышел закон, предписывающий применять альтернативные модели в токсикологии, и уже в 1991 году 50-70% исследований по экспериментальной биологии проводились с их использованием. Одной из актуальных проблем для этой страны стоит внедрение альтернативных моделей в промышленную токсикологию и уменьшение в экспериментах числа лабораторных животных (Zbinden G., 1991).
Альтернативные классическим тестам на экспериментальных животных методы оценки токсичности химических соединений с использованием клеточных культур находят все более широкое применение. Они позволяют значительно уменьшить расход биологического материала и сократить сроки исследования. Еще одно преимущество моделей in vitro заключается в возможности установления характера биологической активности на клеточном уровне и учета синергических и разнонаправленных эффектов смесей химических соединений (Еропкин МЮ.идр., 1995).
Положительными сторонами системы альтернативной оценки in vitro так же является ее экономичность, возможность проводить исследования на культурах клеток человека, высокая степень воспроизводимости результатов опытов и оперативность в получении информации. Тем не менее, даже при наличии многочисленных разработок и усовершенствования существующих тест-систем, полностью отказаться от испытаний на животных, вероятно нельзя. Полученные данные на тест-системах в опытах in vitro, на наш взгляд, призваны уточнять и дополнять данные, полученные на организменных моделях — лабораторных животных. Только комплексное применение методов in vivo и in vitro позволят наиболее полно оценить степень опасности того или иного токсина (Дядищев Н.Р. и др., 1998). Альтернативные использованию животных тесты, несмотря на трудности и нерешенные проблемы, уже широко признаны и применяются во все возрастающих масштабах в поэтапном исследовании токсичности, например в отнесении вещества, к тому или иному классу токсичности в результате анализа данных, полученных исключительно in vitro. Постоянно существующая потребность в повышении скорости и качества токсикологических экспериментов в перспективе неминуемо приведет к сокращению использования лабораторных животных (Еропкин М.Ю., 1999).
Наука не приемлет термин «альтернатива» в методических и методологических подходах к изучению любого явления в природе. Из истории науки известно, что «альтернативные» подходы в решении научных проблем всегда приводили к тупиковым ситуациям или ложным выводам. В результате тщательного анализа исследований был сформулирован «принцип дополнительности». Это одна из самых глубоких философских и естественнонаучных идей нашего времени. Следует отметить, что может быть невольно, но отечественная токсикология всегда развивалась в соответствии с этим принципом, при котором сведения о биологической активности яда в зависимости от поставленных задач получали, как правило, только на основе комплексных (то есть дополнительных) исследований: математического моделирования, токсикометрических исследований на разных видах животных и разных уровнях организации биологической системы, с различной экспозицией, исследованием токсикокинетики, метаболических превращений и механизма действия, и разработкой на их основе методов диагностики и лечения возможных отравлений. Именно такой подход дает возможность наиболее точно установить минимальный риск острых и хронических отравлений (Сидорин Г.И. и др., 1998).
Исследование цитотоксичности Т-2 токсина in vitro
Показано, что при определении цитотоксичности Т-2 токсина для перевиваемых культур клеток животных с помощью ИЦ (по Дьяконову Л.П., 2000) и ЦТИ (по Червонской Г.П., 1988) получаются противоречивые и трудно сопоставимые результаты. Кроме того, у обоих этих методов расчета имелись определенные недостатки. ИЦ необходимо рассчитывать и для контроля, и лишь затем сравнивать полученные результаты. Данный индекс не определяется при 100%-ой гибели клеток в контроле. При расчете ЦТИ невозможно точно определить процент погибших клеток, так как при этом они открепляются от монослоя, попадая среду инкубации, которая сливается из флаконов перед обработкой клеток смесью растворов трипсина и версена. Кроме того, значение данного индекса только при наличии скрытого повреждения в культуре не имело сильного разброса результатов (оно колебалось в данном опыте от -0,01 до -0,15), тогда как при 50% и 100% гибели клеток различия были значительными. Например, при 50% гибели они колебались от -0,88 до -6,28, а при отсутствии неповрежденных клеток в культуре от-59,61 до -237,1.
Коэффициент жизнеспособности клеток в культуре (КЖ) так же нельзя рассматривать самостоятельно, отдельно от индекса пролиферации (ИП). Например, в контроле КЖ равен 99,08±0,43, при индексе пролиферации 4,03±0,05, а при обработке токсином в дозе 2,08хЮ"9М КЖ был равен 96,33+1,22, тогда как РІП - 2,09+0,12.
В связи с вышеизложенным мы провели поиск нового показателя, более оптимально отражающего токсические эффекты на клетки in vitro и, на основании полученных результатов, предлагаем цитотоксичность рассчитывать через отношение живых клеток, оставшихся после экспозиции с препаратом к числу живых клеток в контроле по формуле.
Из данных таблиц 5 и 6 следует, что доза Т-2 токсина 1,07x10"6 М вызывала 100% гибель клеточной культуры MDBK. Индекс КЖ при этом равнялся 0, ИП - 0,43+0,05. Величина ЦТИ в данном случае не играет особой роли, так как рассчитывается лишь при наличии скрытого повреждения клеток в культуре, и должна быть менее 0,15 (Червонская Г.П. и др., 1988). Предлагаемый нами цитотоксический индекс (ЦИ) также равнялся 0. Таким образом, данную дозу токсина для клеточной линии MDBK мы рассматривали как 1С loo При дозе Т-2 токсина 2,08x10"9 М индекс КЖ равнялся 96,33+1,22, ИП -2,09±0,12 (это примерно в 2 раза меньше, чем в контроле), ИЦ равнялся 0,50±О,03 (что в 2 раза больше, чем в контроле). Предлагаемый нами цитотоксический индекс составлял 0,50±0,03, и доза рассматривалась как 1С5о 53 При дозе токсина 0,26x10"9 М индексы КЖ, ИП, ИЦ существенного не отличались от контроля, ЦТИ = -0,08±0,05, что менее 0,15, а предлагаемый нами ЦИ фактически равнялся 1. Данная доза является максимально переносимой (МПД), не вызывающей скрытого повреждения клеток в культуре. Из таблицы 10 видно, что значительной разницы в величинах цитотоксических доз Т-2 токсина для клеточных линий различных видов животных нет. Так, к примеру, при определении ІС50 и МПД для клеточных линий MDBK и MDCK результаты были аналогичными, а колебания доз для СПЭВ и ППЭО относительно двух вышеуказанных линий клеток несущественными, с учетом степени разведения токсина. 2.2.2 Изучение видовых особенностей токсичности Т-2 токсина in vivo и in vitro При изучении коррелятивных отношений токсичности Т-2 токсина для культур клеток in vitro и организма животных in vivo получены результаты, представленные в табл.11: Таблица 11 - Токсичность Т-2 токсина для различных видов животных in vivo и in vitro Видживотных Токсичность In vivo, мг/кг In vitro, M пдк LD50 LDioo МПД,хЮ-9 IC50,xlO-9 IC,oo,xlO-6 Крупныйрогатыйскот 0,025 3,25 3,9 0,26 2,08 1,07 Свиньи 0,007 5,0 6,0 0,13 1,03 2,15 Овцы 0,011 зд 3,65 0,51 4,18 0,54 Собаки 0,014 4,0 4,8 0,26 2,08 0,54 Существенного различия для коэффициента корреляции токсических доз Т-2 токсина между различными видами животных не отмечалось. При этом он при сравнении LDioo, LD5o, ПДК Т-2 токсина в кормах и ІСюо, 1С50 и МПД для крупного рогатого скота и культуры клеток MDBK, для свиней и клеточной линии СПЭВ, для собак и клеток MDCK был равен в наших опытах 0,63 (р 0,01); для овец и клеточной линии ППЭО - 0,59 (р 0,01). Это связано, очевидно, с тем, что в опытах in vivo разница между LD5o и LDioo составляла в среднем около 20%, тогда как в опытах in vitro значения IC50 и 1С юо различались на два порядка. При сравнении LDioo Для различных видов животных и ІСюо Для культур клеток коэффициент корреляции составил всего 0,38 (р 0,05), что свидетельствует о незначительной степени взаимосвязи между данными показателями токсичности Т-2 токсина. Взаимосвязь ПДК и МПД практически отсутствовала (коэффициент корреляции составил 0,02, р 0,05). В соотношении же LD50 и IC50, напротив, наблюдалась значительная обратная корреляция (-0,75, р 0,01) особенно выраженная у 3-х из исследованных (свиньи, овцы и собаки) видов животных.
Изучение эффективности натрия селенита в качестве потенциального антидота Т-2 токсина
Известно, что натрия селенит является соединением с выраженным антиоксидантным действием (Червяков Д.К. и др., 1977). Имеются единичные сообщения об использовании его в качестве средства, повышающего устойчивость организма к Т-2 токсину (Кравченко Л.В. и др., 1990).
Проведена серия опытов на беспородных белых крысах по изучению профилактической эффективности натрия селенита при остром отравлении животных Т-2 токсином в дозе LD5o Результаты исследования представлены в таблице 20. Из табл. 20 видно, что что натрия селенит наиболее эффективен для профилактики острого Т-2 токсикоза в дозах 0,12 — 0,13 мг/кг. Выживаемость животных увеличивалась на 20%, по сравнению с контролем. Увеличение смертности животных при внесении натрия селенита в дозе 0,15 мг/кг связано, очевидно, с тем, что данный препарат является ядовитым веществом даже при небольшой передозировке. Наблюдалась четкая тенденция увеличения продолжительности жизни опытных животных по сравнению с контрольными. Клинические признаки интоксикации также были менее выражены.
Согласно данным табл. 21 наибольшую профилактическую эффективность при остром экспериментальном Т-2 токсикозе ксимедон проявлял в дозе 100 мг/кг. Выживаемость животных при этом составляла 80%, что выше контрольных значений на 30%. При дозах препарата 50 и 200 мг/кг выживаемость животных увеличивалась на 10 и 20% по сравнению с контролем, соответственно. Одновременно с меньшей выраженностью клинических признаков микотоксикоза наблюдалась четкая тенденция увеличения продолжительности жизни опытных животных по сравнению с контрольными.
Т-2 токсину присущи дерматотоксические свойства, выявление которых положено в основу кожной пробы на кролике.
Исследование токсичности Т-2 токсина провели на 5 группах по 4 животных в каждой. Т-2 токсин наносили в виде 5%-ого водно-спиртового раствора в исследуемой дозе. Контрольной группе наносили водно-спиртовый раствор без токсина в том же количестве. Результаты исследования представлены в таблице 22.
Примечание: + - гиперемия, заканчивающаяся шелушением кожи; ++ - гиперемия, болезненность и отечность, проявляющаяся незначительным утолщением кожи с последующим образованием отдельных корочек; +++ -резкая гиперемия, болезненность, складчатость, отек проявляющийся резким утолщением кожи, на всей поверхности участка появляются язвы, затем сплошной струп.
Дерматотоксичность Т-2 токсина носила дозозависимый характер. Так, при дозе 0,01 мкг/пробу на протяжении практически всего времени наблюдения (96 часов) отмечалась гиперемия кожных покровов. Во второй группе животных (1 мкг/пробу) покраснение кожи было более выраженным и сохранялось в течение всего эксперимента. При аппликации Т-2 токсина в дозах 500 и 1000 мкг/пробу наблюдали некротические явления" кожных покровов. В тоже время в контрольной группе в первые 24 часа наблюдения также отмечали слабовыраженную гиперемию, не сопровождавшуюся в последующем шелушением кожи.
Таким образом, минимальной дозой Т-2 токсина, которую можно определить кожной пробой является 0,01 мкг/пробу. Полученные при исследовании токсичности Т-2 токсина для перевиваемых культур клеток различных видов животных данные согласуются с результатами исследований Laufraite S. et al. (1995) по 1С5о и не соответствуют по 1Сюо для грануломоноцитарных колониеобразующих клеток человека и культуры клеток крыс при 7-, 10- и 14-дневных экспозициях. IC50 Для указанных клеток составила, соответственно, 1,6x10"9, 3,6х10 9, 1,4х10"9 и 2,2х10"9, 3,3х10"9, 2,6х10"9 М. Полная же их гибель происходила при увеличении концентрации токсина до 10"7М, тогда как в наших экспериментах она отмечалась при концентрации Т-2 токсина 10"6 М, что мы связываем с меньшим сроком экспозиции.
Несмотря на отсутствие значительных различий для 1С so, ІСюо и МПД в проведенных нами опытах, некоторые исследователи отмечают существенную разницу этих доз для культур клеток отдельных видов животных. Например, ІС50 для культуры клеток бычьей почки в исследованиях Holt P. et al. (1988) была равна 4,72х10"9 М, для соединительно-тканных клеток мыши - 23,4x10"9 М. При 27 часовой экспозиции клеток костного мозга мыши 1С5о составила 0,86x10"3 М, тогда как тимоциты мыши при этой дозе погибали уже через 5-6 ч (Dininno V. et al., 1988). Эти факты объяснимы, вероятно, методическими особенностями экспериментов, определяемыми задачами указанных исследователей.
По мнению Khachatourians G. (1990), чувствительность клеток к токсическому действию Т-2 токсина в значительной степени зависит от состояния и структуры мембран и определяется липофильными и амфипатическими свойствами токсина. Эти же исследования показали наличие прямой корреляции между текучестью мембран, содержанием в них фосфатидилхолина и чувствительностью к действию данного микотоксина. Его цитотоксические свойства связывают так же со способностью ингибировать митохондриальную электронно-транспортную систему и нарушать энергетический обмен клетки. Известно, что НТ-2 токсин является основным метаболитом при воздействии Т-2 токсина на животных. Аналогичный процесс происходит и в КК. Так, например, в исследованиях Trusal L. (1986) и Yagen В. et al. (1991) было установлено, что в течение 1,5 часа до 30% Т-2 токсина метаболизируется в НТ-2 токсин, в меньшем количестве обнаруживали Т-2 триол и Т-2 тетраол, причем количество метаболитов нарастало в течение 4 часов инкубации. По нашим данным, цитотоксичность НТ-2 токсина для перевиваемых клеточных линий значительно ниже в сравнении с Т-2 токсином. Так, если 1С5о Т-2 токсина составляла 10"9 М, то та же доза НТ-2 токсина - 10"6 М. Данная тенденция прослеживается и в опытах in vivo, хотя для НТ-2 токсина определена LD5o лишь у некоторых видов животных. Например, для свиней и крупного рогатого скота, она составляет 40 и 32 мг/кг, соответственно, что на порядок больше, чем данная доза Т-2 токсина. Ранее в многочисленных работах различных исследователей было показано ингибирование Т-2 токсином биосинтеза белка в культурах клеток на стадии трансляции (Ueno Y. et al., 1973.; Cannon M. et al., 1976; Middlebrook J. et al., 1989 6; Sorenson W. et al., 1986), в результате чего происходит гибель клетки. В тоже время, некоторые авторы указывают, что одним из проявлений цитотоксического действия различных веществ является активация ПОЛ (Котелевцев СВ. и др., 1986; Еропкин М.Ю. и др., 1999). Нашими исследованиями на перевиваемой клеточной линии MDBK показано, что внесение Т-2 токсина увеличивало содержание МДА.
