Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эволюция белковых комплексов, имеющих в своем составе ацетилтрансферазу гистонов MYST1 —10
Предисловие 10
Структура и функция компенсасомы - комплекса, включающего в себя белки MSL1 и MOF у Drosophila 13
Основные компоненты компенсасомы 13
Дополнительные компоненты комплекса 19
Механизм работы компенсасомы 19
Комплекс MSL у других организмов? 21
Другие комплексы с участием хампина /MSL1 и ацетилтрансферазы MYST1 25
Ацетилтрансферазы MYST и апоптоз 30
Эволюционные аспекты, связанные с функционированием комплексов на основе ацетилтрансфераз.МУЗТІ 30
Современные представления о механизме функционирования хроматина согласно парадигме «сканирования хроматина» 32
Подвижность белков в ядре 33
Флуктуации доступности нуклеосом 34
«Открытые состояния», случайное связывание и общая схема ядерных процессов — 34
Глава 2: Результаты и обсуждение 37
Изучение первичной структуры хампина мыши, ее филогенетический анализ и изучение тканевой специфичности экспрессии его изоформ 37
Бактериальная продукция фрагментов хампина и получение специфических антител - 45
Изучение внутриклеточной локализации изоформ хампина и картирование участков, содержащих сигналы ядерной локализации 47
Результаты поиска белковых взаимодействий хампина и его партнеров в дрожжевой двугибридной системе 55
Анализ тканевой специфичности партнеров хампина, их краткая характеристика, филогенетический анализ 56
Бактериальная продукция партнеров хампина. Получение антител к некоторым белкам. Проблемы. 62
Разработка двухтеговой системы для экспрессии в бактериях. Свойства белков.
Оптимизация условий связьгаания на примере взаимодействия MYSTl-хампин 64
Применение двухтеговой системы для подтверждения взаимодействий и картирования
участков взаимодействий между хампином и некоторыми белками 68
Характеристика некоторых партнеров хампина и их ко-локализация в клетке 73
Необычные свойства ТТС4 и регуляция его внутриклеточной локализации 77
Внутриклеточная локализация белков NELF-C и NELF-D— 83
Глава 3: Экспериментальная часть 88
Материалы 88
Олигонуклеотидные праймеры для ПНР, использованные в работе 90
Конструирование экспрессирующих плазмидных ДНК - 92
Свойства белков, продуцированных в бактериях 94
Методы исследования 95
Выводы - 108
Благодарности 109
Список литературы 110
- Структура и функция компенсасомы - комплекса, включающего в себя белки MSL1 и MOF у Drosophila
- Эволюционные аспекты, связанные с функционированием комплексов на основе ацетилтрансфераз.МУЗТІ
- Бактериальная продукция фрагментов хампина и получение специфических антител
- Олигонуклеотидные праймеры для ПНР, использованные в работе
Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из главных подходов в современной науке биоорганической химии является использование высокопоточных методов для анализа структурных компонентов живой клетки и организма в целом. К таким методам в нашу «постгеномную эру» следует отнести анализ протеомов организмов, изучение совокупности всех белок-белковых взаимодействий в рамках конкретного протеома, называемой термином «интерактом», а также ряд других - изучение «метаболома», «деградома» и прочих. Предполагается, что создание полных карт взаимодействий между биомолекулами (в данном случае белками) позволит лучше понять принципы функционирования живого организма. Действительно, такая информация важна как с точки зрения фундаментальной науки, так и с точки зрения ее практических приложений, в особенности, - для медицины. Несмотря на достаточно глобальный характер этой задачи, уже сейчас можно утверждать, что она не является невыполнимой. Развитие методов в изучении белок-белковых взаимодействий уже позволяет аннотировать предварительные карты белковых взаимодействий целых организмов, например, полные для дрожжей () или частичные для человека О- В то же время, учитывая специфические особенности отдельных белков в картах интерактомов будут оставаться^ «темные пятна». В таких случаях основная надежда остается на усилия небольших групп ученых, применяющих низкопоточные методы, и решающих такие проблемы применительно к особенностям индивидуальных белков. Не следует также забывать, что важным критерием характеристики взаимодействия между белками*, является его функциональная значимость. Для решения таких задач пока еще не существует универсальных высокопоточных подходов.
Ранее в нашей лаборатории был идентифицирован фрагмент белка, кодируемого геном мыши 4121402D02Rik, как возможный партнер бета-субъединицы семейства Х,К-АТФаз Рм в бактериальной двугибридной системе. Анализ консервативности данного гена у млекопитающих показал, что кодируемые им белки у млекопитающих имеют высокую степень гомологии: 100% идентичности первичной структуры между белками человека и шимпанзе и 95% идентичности между белками человека и мыши. В то же время, анализ баз данных маркеров экспрессируемых последовательностей указывал на также существование альтернативного сплайсинга первичного транскрипта данного гена. Функция этого нового белка, названного нами «хампином», была неизвестной. Единственной работой, в которой выдвигались предположения о возможной функции хампина, была работа Марина Q, в которой он показал, что хампин является отдаленным
гомологом хорошо изученного белка дрозофилы, белка MSL1. Последний является компонентом рибонуклеопротеидного комплекса MSL (синонимы — «компенсасома», «комплекс компенсации дозы гена» DCC), участвующего в реорганизации структуры хроматина у самцов мух рода Drosophila, и избирательно повышающего его активность в 2 раза, по сравнению с Х-хромосомами самок 0. Современные данные о механизме работы компенсасомы дрозофил позволяют утверждать, что белок MSL1 является структурным компонентом комплекса, важным для корректной ассоциации компенсасомы со специфическими участками хроматина. С другой стороны, млекопитающие не используют компенсасомы для компенсации дозы гена (} Поэтому гомология между хампином и белком MSL1 может быть причиной их общих функций, сохранившихся в процессе эволюции и, по-видимому, связанных с консервативными механизмами реорганизации структуры хроматина применительно к регуляции экспрессии генов.
Учитывая интерес, который вызывают в настоящее время исследования в области механизмов регуляции экспрессии генов, мы решили сфокусировать свое внимание на изучении структуры и функции нового белка хампина. Данная работа представляется актуальной как с точки зрения изучения свойств данного белка, так и с точки зрения? развития методологии изучения новых, неохарактеризованных белков протеома млекопитающих.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы было изучение свойств и> особенностей хампина млекопитающих применительно к его роли в глобальном интерактоме млекопитающих.. Поэтому в ходе настоящей работы предполагалось решить следующие задачи:
Изучить первичную структуру изоформ хампина в модельном организме мыши, а также характер их распределения в различных тканях.
провести сравнение первичных структур гомологов хампина у других организмов и выяснить, какие из участков его первичной структуры подверглись наибольшим изменениями, а какие являются наиболее консервативными.
определить внутриклеточную локализацию изоформ хампина в организме мыши и выяснить, какими участками его структуры она обеспечивается.
с помощью дрожжевой двугибридной системы провести поиск белок-белковых взаимодействий хампина в организме мыши.
подтвердить взаимодействия, идентифицированные в дрожжевой двугибридной системе, с помощью альтернативных методов - связывания in vitro, ко-локализации или функционально.
Научная новизна и практическая ценность работы
В ходе работы нами было впервые изучено разнообразие изоформ хампина в организме мыши, образующееся в результате альтернативного сплайсинга кодирующей мРНК. Интересной особенностью оказалось, что разные изоформы белка являются результатом использования разных комбинаций экзонов.
На основании сравнения первичных структур хампина и его гомологов в организмах животных мы показали, что гены, кодирующие белки данного семейства, присутствуют у членистоногих и позвоночных животных, отсутствуя у круглых червей и представителей других царств эукариот - растений и грибов. С помощью обратной транскрипции — ПЦР мы показали, что отдельные изоформы хампина содержатся виртуально во всех тканях, тогда как по крайней мере две из его изоформ специфичны для семенников.
Мы также изучили внутриклеточную локализацию всех изоформ хампина в организме мыши. Оказалось, что все они имеют ядерную локализацию. Сравнительный анализ структуры изоформ показал, что в молекуле хампина имеет место существование по крайней мере двух сигналов ядерной локализации - одного, неизвестного ранее и? присущего всем изоформам хампина, и другого, который содержится в последовательности высоконсервативного домена РЕНЕ и, вероятно, функционирует как добавочный.
Независимо от зарубежных групп исследователей, мы показали, что, как и MSL1 дрозофилы, хампин млекопитающих способен взаимодействовать с ацетилтрансферазой. гистонов семейства MYST1 через свой высоко консервативный домен РЕНЕ. Таким' образом, одной из его консервативных функций является взаимодействие с ацетилтрансферазой гистонов MYST1, важной для ацетилирования гистона Н4 по остатку К16 как у млекопитающих, так и дрозофилы.
С помощью дрожжевой двугибридной системы мы открыли ряд новых взаимодействий хампина, неизвестных для его гомолога MSL1, и связывающих его функцию с регуляцией активности ДНК-полимеразы альфа (р180) и некоторых белков-супрессоров опухолей. Большинство открытых взаимодействий было подтверждено с помощью методов аффинной хроматографии. В ходе проведения данных экспериментов была разработана новая система гибридных белков, позволяющая изучать белок-белковые взаимодействия in vitro.
Дополнительно, в ходе работы был проведен структурно-функциональный.анализ некоторых малоизученных белков-партнеров хампина и MYST1: ТТС4, NELF-C, ТТС35 и его партнера RASSF 1С.
В целом полученные результаты позволяют реконструировать фрагмент интерактома млекопитающих, содержащий в своем центре белок хампин и указывают на то, что он является важным компонентом некоторых сигнальных путей, происходящих в клеточном ядре. В то же время, сложность структуры узла интерактома применительно к отдельно взятому белку показывает, насколько мало изучены в наше время такие процессы как регуляция транскрипции РНК-полимеразой II или ацетилирование гистонов. Безусловно, данные результаты являются дополнительным стимулом в изучении интерактома млекопитающих.
Стоит отметить, что выполненная работа представляет не только теоретический, но и практический интерес: полученные данные проливают свет на аспекты функционирования жизненно важных систем клетки, имеющих нарушенную функцию в ходе злокачественной трансформации. Так, недавно было обнаружена взаимосвязь между функцией белка MYST1 и трансформацией клеток 0> запуском АТМ-зависимых сигнальных каскадов в ответ на повреждение структуры геномной ДНК Q, а также его роль в регуляции супрессорной активности широко известного белка р53 О- С другой стороны, функция белков RASSF1C и ТТС4 в механизмах супрессии опухолей остается, малоизученной в наши дни. Очевидно, что открытие новых функциональных взаимосвязей для всех этих белков является важной вехой в изучении их функции и, как следствие, в разработке новых средств терапии рака.
Структура и функция компенсасомы - комплекса, включающего в себя белки MSL1 и MOF у Drosophila
Ген, кодирующий MSL1 дрозофилы был клонирован в 1993 [16]. Авторами было показано, что продуктом гена является белок, состоящий из 1039 а.о., не имеющий какой-либо значительной гомологии с известными белками. Особенностью его первичной структуры является наличие двух достаточно кислых кластеров в N-концевой части белка, почти полностью состоящих из остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот. Иммунофлуоресцентное мечение политенньгх хромосом дрозофилы показало, что MSL1 локализуется преимущественно на Х-хромосоме самцов. В то же время, в гораздо меньших количествах этот белок обнаруживается и у самок.
Исследования, проведенные в последующие годы разными группами ученых, позволили детально охарактеризовать структуру и функцию белка MSL1. Было установлено, что MSL1 является одним из главных компонентов компенсасомы, который взаимодействует с белками MSL2, MSL3, MOF и эти взаимодействия необходимы для сборки компенсасомы. При этом «главными» участками молекулы MSL1 являются его N-и С-концевые части - за взаимодействие с MSL2 отвечает N-концевая часть [17], а за взаимодействие с MSL3 и MOF - С-концевой домен [18].
С помощью экспериментов по связыванию in vitro Моралес с соавторами [18] было показано, что с MOF взаимодействует фрагмент MSL1 766-939 а.а., содержащий консервативный РЕНЕ-домен [18, 19], тогда как за взаимодействие с MSL3 отвечает фрагмент 973-1039 а.а [18].
Первичная структура белка MSL1 дрозофилы. Показаны координаты всех идентифицированных к настоящему времени «доменов» белка - «основного», Gly-богатого, Leu-молния-подобного, Coiled Coil региона, участка, богатого Asp и Glu, а также — РЕНЕ -домена. Также показаны координаты участков в молекуле белка, ответственных за взаимодействие с белками MSL2, MOF и MSL3.
В недавней работе Ли с соавт. [17] была подробно изучена структура аминоконцевого фрагмента MSL1: Последовательность N-концевого фрагмента MSL1 содержит 3 последовательно расположенных участка с разными мотивами структуры -«основный», «богатый Gly» и «подобный лейциновой молнии». «Основный» мотив отвечает за связывание MSL1 с т.н. «высокоаффинными» сайтами на Х-хромосоме самцов. Этот участок последовательности консервативен среди всех представителей рода Drosophila [17]. «лейциновая молния-подобный мотив» также необходим для взаимодействия с Х-хромосомой самцов, но уже через взаимодействие с MSL2. В то же время «богатый Gly» мотив способствует димеризации молекул MSL1 как in vitro, так и in vivo. Частично изучен также механизм внутриклеточной сортировки белка MSL1 в ядро (см. ниже).
Белок MSL2, идентифицированный в 1995 г., присутствует только у самцов дрозофил [20]. Он состоит из 769 а.о. и имеет массу 84 кДа. Из-за низкого значения pi (около 4,7) он имеет аномальную электрофоретическую подвижность — около 135 кДа [20].
Его ген экспрессирован у обоих полов дрозофилы, но трансляции подвергается только мРНК самцов. В норме трансляция кодирующей его мРНК, находится под контролем белка SXL (Sex-lethal), присутствующего только у самок дрозофил. РНК-связывающий белок SXL взаимодействует с 5 - и З -нетранслируемьши участками мРНК MSL2, ингибируя его трансляцию [21]. Показано, что это ингибирование осуществляется двумя путями: связывание SXL с З -нетраслируемым участком нарушает взаимодействие мРНК с 43S рибосомными преинициационными комплексами, a SXL, связанный с 5 -нетраслируемым участком, не дает этим комплексам найти сайт инициации трансляции мРНК MSL2 [21]. Недавно был идентифицирован дополнительный кофактор, важный для связывания SXL с З -нетранслируемым участком мРНК MSL2 - белок UNR, присутствующий как у самцов, так и у самок [22]. Эктопическая экспрессия MSL2 в самках дрозофилы вызывает ряд дефектов в развитии и понижает их жизнеспособность [23].
По своей структуре MSL2 принадлежит к суперсемейству RING-finger домен -содержащих белков. Домен RING-finger (от английского «Really Interesting New Gene») представляет собой специализированный тип домена «цинковых пальцев", имеющий два участка связывания ионов Zn2+ и вовлеченный преимущественно в белок-белковые взаимодействия. Белки с этим доменом участвуют в таких процессах, как репликация вирусов, сигнальная трансдукция, или убиквитинилирование белков [24].
В составе компенсасомы MSL2 взаимодействует с MSL1 через свой RING-finger домен. С помощью дрожжевой двугибридной системы было показано, что за это взаимодействие ответственен первый сайт связывания ионов Zn2+. Предполагается, что второй Zn -связывающий участок в составе RING-finger-домена MSL2 участвует во взаимодействиях с другими белками, поскольку мутации в этом регионе молекулы белка не оказывают влияния на его связывание с MSL1 [25].
Мечение политенных хромосом антителами к MSL1 и MSL2 показало, что оба белка имеют практически сходную локализацию на Х-хромосоме самцов. Интересно, что при удалении белков MSL3 и MLE - других компонентов компенсасомы, MSL2 и MSL1 сохраняют свою локализацию на X хромосоме [26]. Однако MSL2 не имеет каких-либо известных ДНК- или хроматин-связывающих участков, а только MSL1-связывающий участок в составе своего RING-finger-домена. Таким образом, можно предполагать, что с хроматином MSL2 ассоциируется через взаимодействие с MSL1. В то же время, было показано, что удаление MSL2 с помощью РНК-интерференции в культуре клеток SL2 нарушает ацетилирование гистона Н4 по остатку Lysl6 белком MOF и последующее двукратное повышение уровня транскрипции- генов Х-хромосомы [27]. Но это не вызывает нарушения в их жизнеспособности [27]. Таким образом, модификация гистона Н4 АсКІб не является жизненно необходимой для общей жизнедеятельности клеток, а важна лишь для развития самцов.
Белок MSL3 был идентифицирован в 1995 г [28]. Как и в случае с MSL1, экспрессия его гена обнаруживается у самцов и самок, но выше у самцов. Отличительной чертой этого белка с массой 57 кДа (512 а.о.) является наличие двух доменов - N-концевого CRD (Chromo-Related Domain), домена и MRG-домена (от англ. MORF4-Related Gene) [29]. Ранее предполагалось, что именно CRD-домен, гомологичный хромодомену многих ДНК-связывающих белков ответственен за связывание MSL3 с Х-хромосомой, но экспериментальные факты показывают, что MSL3 способен ассоциироваться с хроматином только через взаимодействие с MSL1 [ЗО]. Мутантная форма MSL3 с делетированным N-концевым фрагментом, включающим CRD-домен, не приводит к нарушению функциональной активности компенсасомы [30]. Все же MSL3 обладает способностью связывать одноцепочечные нуклеиновые кислоты - преимущественно РНК, например, гоХ2. Использование делеционных мутантов показало, что для связывание РНК нужна практически вся N-концевая половина MSL3, включающая как CRD, так и часть MRG-домена [30].
MRG-домен, обнаруженный в белках практически всех эукариот - от дрожжей до млекопитающих, не имеет известной функции [29]. MRG домен MSL3 важен для ассоциации с MSL1 и модуляции ацетилтрансферазной активности MOF. Ассоциация MSL3 с MSL1 в комплексе с MOF приводит к повышению ацетилтрансферазной активности белка MOF. При этом MSL3 и MOF не взаимодействуют между собой или взаимодействуют с очень слабой аффинностью. Более того, ацетилтрансфераза MOF способна ацетилировать MSL3 (по остатку Lysll6) и, в гораздо меньшей степени, MSL1. Ацетилирование MSL3 уменьшает его способность к связыванию с гоХ2 [31]. Было показано, что MSL3 способен также взаимодействовать с деацетилазой гистонов RPD-3. При этом RPD-3 может деацетилировать также ацетилированный MSL3 [31].
Эволюционные аспекты, связанные с функционированием комплексов на основе ацетилтрансфераз.МУЗТІ
Таким образом, рассмотрение гомологов MYST1 и хампина позволяет представить общий ход эволюции важнейших комплексов, принимающих участие в регуляции структуры хроматина высокого порядка. Логично предположить, что наиболее близким к примитивным (древним) структурам, включающим в себя гомологи MYST1 и осуществляющим ацетилирование гистона Н4, можно считать комплекс NuA4 дрожжей, поскольку в данном случае мы имеем дело с одноклеточным организмом.
Схема фрагмента интерактома клетки человека, включающая в себя гомологи белков - компонентов комплекса MSL дрозофилы. Схема построена на основе результатов работ [12, 61, 62] и на основе информации, взятой из баз данных DIP, BioGrid и др. Сплошными линиями показаны взаимодействия, подтвержденные с помощью нескольких (2 и более) независимых подходов, тогда как пунктирными линиями показаны те взаимодействия, полученные в результате «высокопоточных» экспериментов или являющиеся гипотетическими.
В то же время, в процессе эволюции животным понадобились дополнительные компоненты в данном комплексе, такие как хампин и NSL1. В результате, у отдельных видов, таких как Drosophila, один из комплексов приобрел специфические функции и стал участвовать в компенсации дозы гена. В то же время, вполне возможно и наличие неканонических функций у MOF, например, в составе комплекса "NSL", а также участие в апоптозе и супрессии развитии опухолей - через взаимодействие с белком р53. Таким образом, образовалось как минимум два комплекса, участвующих в ацетилировании гистона Н4 К16 и, возможно, других модификациях хроматина, в частности, метилировании гистонов. У высокоорганизованных животных произошла дальнейшая дивергенция компонентов этих комплексов, что проявилось в повьппении разнообразия белков при помощи альтернативного сплайсинга отдельных компонентов (хампин, MSL3 и проч.). В процессе эволюции комплексы изменились и функционально (поскольку изменилось значение модификации гистона Н4 К16), и структурно. По-видимому, основной движущей силой таких изменений стала адаптация компонентов данных комплексов к новым белковым взаимодействиям. Интересной чертой эволюции этих компонентов является относительно высокая вариабельность первичной структуры при сохранении отдельных доменов, важных для сохранения четвертичной структуры комплексов.
Современные представления о механизме функционирования хроматина согласно парадигме «сканирования хроматина» Заканчивая рассмотрение структуры и функции компонентов комплексов, участвующих в реорганизации структуры хроматина, представляется целесообразным уделить внимание изложению современных представлений о том, как же работает хроматин?
В последнее время наибольшее распространение получило две концепции: «гистонового кода» [64] и «реорганизации структуры хроматина» [65]. Согласно модели гистонового кода, характер ковалентных модификаций N-концевых фрагментов гистонов каким-то образом кодирует информацию, позволяющую сайт-специфическую сборку ДЫК-белковых комплексов, что ведет к активации определенных генов. Такие комплексы могут включать в свой состав не только компоненты, участвующие в собственно инициации транскрипции, ш и также факторы реорганизации структуры хроматина, способные, в свою очередь, перемещать нуклеосомы вдоль геномной ДНК, или делать ДНК более доступной для каких-либо третьих факторов. Общность и существенное разнообразие модификаций гистонов (см. выше), а также широкое распространение-факторов реорганизации структуры хроматина, ясно свидетельствуют об их важности в процессах регуляции экспрессии генов. В то же время, то, насколько этот «код» специфичен, может вызывать сомнения. В любом случае, представляется, что хроматин в общем является пассивной субстанцией, «ожидающей» того момента, пока он не будет соответственным образом «помечен» или изменен пространственно, чтобы уже после этого подвергаться таким процессам как репликация, транскрипция или репарация.
Однако, если хроматин действительно пассивен, то возникает серьезный вопрос о том, как могут распознаваться при этом его специфические участки для последующего мечения или изменения пространственной организации. Многие промоторы, будучи неактивными, содержат сайты связывания факторами транскрипции «спрятанными» внутри нуклеосом. Общепринятая теория гласит, что факторы реорганизации хроматина, ориентируясь по специфическим модификациям гистонов, модифицируют структуру нуклеосомы, делая «закрытые» сайты связывания «открытыми». Главный вопрос о том, как скрытое место узнается первоначально, остается открытым. Недавно возникла новая теория о поведении хроматина, позволяющая взглянуть на этот вопрос в несколько новом свете [66]. Предполагается, что хроматин является высоко подвижной структурой, в которой сайты связывания постоянно «сканируются» ядерными белками случайным образом. С такой точки зрения, активация и выбор того или иного гена зависит от последовательности динамических событий, протекающих с определенной вероятностью. Для того, чтобы данная теория была верной, требуется выполнение двух условий: во-первых, белки должны свободно перемещаться внутри ядра и, во-вторых, должен существовать механизм, разрешающий случайное экспонирование сайтов связывания факторами транскрипции на всех или в большинстве нуклеосом.
Развитие двух новых методов, восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания,(FRAP) и- детекцииtфлуоресценции единичных молекул, позволило продемонстрировать динамику подвижности белков в ядре. В настоящее время большинство экспериментов предусматривает использование технологии FRAP, использующей белки, генетическими методами слитые с зеленым флуоресцентным белком (GFP) и экспрессированные в живой клетке [69]. Однако, уже сейчас возможна детекция флуоресценции единичных молекул и это обещает получение еще более подробной информации, касающейся поведения того или иного белка in situ [70].
С использованием технологии FRAP была наглядно продемонстрирована подвижность гистона HI, - оказалось, что, в вопреки представлению о статической локализации на хроматине, большая его часть быстро обменивается между отдельными, участками хроматина, со средним временем пребывания в несколько минут [71]. Впоследствии, было также показано, что такая подвижность присуща многим ядерным белкам, слитым с GFP: PCAF, HMGB1, NF1, Jun, Fos и др. В частности, оказалось, что большинство из таких белков обладают би-экспоненциальным типом обмена, что предполагает наличие двух классов их сайтов связывания [72].
Бактериальная продукция фрагментов хампина и получение специфических антител
Следующей задачей данной работы стало получение антител к хампину - как поли-так и моноклональных, с целью детекции интактного белка в образцах тканей мыши и, возможно, других млекопитающих. Было решено использовать в качестве антигена препараты белка, полученные с помощью продукции в бактериях. Для этого, первоначально планировалось получить полноразмерный хампин А, однако попытки амплифицировать его полноразмерную открытую рамку считывания с помощью ПЦР давали отрицательные результаты (данная проблема была решена в дальнейшем с помощью применения температуры денатурации матрицы +98 С). В то же время успешным оказалось получение рекомбинантных фрагментов белка хампина - РНАМ (фрагмент Е266-К616 хампина А) и UHAM (фрагмент L259-A463 хампина С); открытые рамки считывания этих полипептидов были успешно амплифицированы с помощью ПЦР и затем клонированы в плазмидные ДНК pQE30, позволяющие осуществлять бактериальную продукцию интересующего полипептида с N-концевой гексагистидиновой последовательностью. По своим свойствам полипептид РНАМ (42 кДа, pi 9.3) оказался неудобным для применения в качестве антигена - он имел достаточно низкий уровень экспрессии в бактериях и подвергался при этом интенсивному внутриклеточному протеолизу (данный феномен можно уменьшить, используя более низкую температуру выращивания клеток - комнатную), а также оказался нерастворимым в водных растворах. В то же время полипептид UHAM (25 кДа, pi 9.4), имел гораздо более высокую стабильность при экспрессии в бактериях и был растворимым. По этим причинам было решено использовать для иммунизации именно этот полипептид. Стоит заметить, что последовательность данного полипептида содержится во всех изоформах хампина (за исключением С-концевого трипептида SKA, присущего только изоформам хампина С и Е у мыши). масс, 2-лизат клеток Exoli до начала экспрессии белка, 3-лизат клеток E.coli сверхпродуцировавіних полипептид UHAM, 4-фракция белков, не сорбировавшихся на Ni-NTA-агарозу («проскок»), 5 - препарат очищенного полипептида UHAM, элюированного с Ni-NTA-агарозы.
В результате иммунизации кроликов полипептидом UHAM нами были получены специфические поликлональные антитела к хампину (ко всем его изоформам) мыши, способные детектировать препараты белка с помощью методов иммуноблотинга и иммуноцитохимии (см. ниже). Мы также предприняли попытку получения моноклональных антител к хампину мыши. В результате слияния клеток миеломы со спленоцитами мыши было получено несколько гибридомных клонов, два из которых секретировали специфические антитела к антигену UHAM - клоны ХВ7 и ZB2. Гибридомная линия ZB2 вызвала наибольший интерес с нашей стороны, поскольку антитела, секретируемые ею, были способны распознавать антиген в условиях иммуноблотинга. Эпитоп данного антитела был позднее картирован нами благодаря использованию укороченных фрагментов молекулы хампина, - оказалось, что за связывание антитела ZB2 ответственен регион L259-K332 хампина.
Используя полученные антитела, мы предприняли попытку детекции хампина в препаратах субклеточных фракций из различных тканей мыши и крысы с помощью метода иммуноблотинга. Предполагалось таким образом подтвердить характер тканевой специфичности, выявленный ранее с помощью ОТ-ПЦР и, возможно, определить внутриклеточную локализацию белка. Однако оказалось, что эндогенный хампин обладает довольно высокой чувствительностью к протеазам клетки и на блотингах различных образцов тканей доминирующей полоской является полоска с подвижностью около 30 кДа.
Было показано, что хампин содержится в грубом ядерном осадке данных типов клеток, практически полностью отсутствуя в надосадочнои жидкости, что может указывать на его ядерную локализацию. В представленных на рис. 12 результатах иммуноблотинга можно, помимо основной полоски (68 кДа) можно видеть и полоску с подвижность около 58 кДа, являющуюся, по-видимому, результатом протеолитической деградации этой изоформы. Отсутствие полосы, соответствующей хампину С, на блотинге препаратов клеток линии фибробластов можно объяснить или меньшим его содержанием в клетке (данном типе клеток) или большей его лабильностью.
Изучение внутриклеточной локализации изоформ хампина и картирование участков, содержащих сигналы ядерной локализации Для выяснения внутриклеточной локализации белка хампина было решено использовать такие подходы как применение химер с флуоресцентными белками или иммунофлуоресценцию. Поскольку получение антител, специфичных ко всем пяти известным изоформам хампина представляется невозможным (например, антитело, специфичное к изоформе D, но не распознающее изоформы А-С, будет взаимодействовать и с изоформой Е и т.д.), то метод использования химер изоформ хампина с флуоресцентными белками является достаточно привлекательным для изучения внутриклеточной локализации в клеточных линиях. Интересно, что изоформы хампина, имеющие в своей структуре домен IVpehe, обладают сигналом ядерной локализации NLS ВР, в то время как изоформы С и Е не имеют таких сигналов в своей последовательности и поэтому они могут локализоваться в иных внутриклеточных компартментах. Для выяснения внутриклеточной локализации изоформ хампина мы амплифицировали полноразмерные (с небольшой частью 5 -нетранслируемых участков) открытые рамки считывания изоформ хампина мыши А, С, D и Е с помощью ПЦР и клонировали их в вектор для экспрессии химерного белка с С-концевым зеленым флуоресцентным белком (pEGFP-N3). Полученными плазмидными ДНК трансформировали фибробласты мыши линии ЗТЗ. В результате было обнаружено, что изоформы хампина, независимо от наличия или отсутствия в своем составе домена IVpehe, локализуются исключительно в клеточном ядре:
Интересно, что ядерная локализация наблюдается также в случае изоформ D и Е, специфичных для семенников, как показано с помощью ОТ-ПЦР, - т.е. в случае их эктопической экспрессии. Чтобы проверить, сохраняется ли внутриклеточная локализация у данных изоформ и в других линиях клеток, мы провели подобные эксперименты по трансфекции с рядом других линий клеток - миобластов мыши С2С12, YPEN-1 (опухоль простаты крысы) и НЕК293Т (трансформированная линия эмбриональных почек человека). Было обнаружено, что и в других линиях клеток изоформы хампина сохраняют свою ядерную локализацию (см. рис. 14).
Этот результат позволяет предполагать, что центральная часть молекул хампина (домен III и/или С-концевая часть домена Пес, координаты L259-A460 хампинов А-С) должна содержать неизвестные, но вполне универсальные для клеток млекопитающих сигналы ядерной локализации. Вполне возможно, что именно этот регион, а не только домен IVpehe, важен для корректной внутриклеточной сортировки белка - в клеточное ядро. На основании полного отсутствия гомологии доменов II хампина и MSL1 можно также предположить, что механизмы их транспорта в ядро существенно различаются из-за использования различных наборов сигналов ядерной локализации. Нельзя также исключать, что пока неизвестные участки последовательности этого региона в молекуле белка, распознаваемые как сигналы ядерной локализации, были приобретены в процессе эволюции одновременно с появлением новых функций, уникальных для укороченных вариантов хампина.
Для подтверждения этой гипотезы мы сконструировали плазмидную ДНК, кодирующую фрагмент хампина L259-A460 (нумерация справедлива для изоформ А-С), слитую с N-концевым зеленым флуоресцентным белком (используя вектор pEGFP-C3); полученной ДНК осуществили трансфекцию фибробластов линии ЗТЗ. В результате была также обнаружена ядерная локализация для химерного белка (рис. 16). Столкнувшись с таким интересным феноменом, мы решили сузить регион в молекуле хампина, важный для его внутриклеточного сортинга.
Олигонуклеотидные праймеры для ПНР, использованные в работе
Фрагмент кДНК, кодирующий эктодомен .(Зм; амплифицировали, используя кДНК новорожденной мыши в качестве матрицы. Продукт ПЦР клонировали в вектор рВТ - для, бактериальной системы «BacterioMatch II» и в вектор pGBKT7, кодирующий; ДНК-связывающий домен GAL4 - для дрожжевой системы MatchMaker GAL4 Two-Hybrid System 3. Поиск возможных белок-белковых взаимодействий эктодомена субъединйцы Рм мыши В: бактериальной двугибридной системе проводили, используя библиотеку кДНК скелетной мышцы крысы в векторе pTRG (Stratagene, США), в среде LB с карбенициллином в концентрации 250 мг/л («селективная среда») согласно рекомендациям производителя. Из полученных колоний выделяли плазмиды и проводили их тестирование с целью исключения ложноположительных реакций. Для этого получали котрансформанты выделенных плазмид с рВТ-рм и с рВТ без вставки, а затем сравнивали скорость их роста на селективной среде. Последовательность хампина мыши (фрагмент 266-616 а.о. хампина А) клонировали в вектор pGAD, который кодирует ДНК-активирующий домен GAL4. Проводили трансформацию дрожжевых клеток штамма АН109 и сравнивали скорость роста котрансформантов pGBK-pM/pGAD-хампин, pGBK/pGAD-хампин и pGBK-pM/pGAD на селективных средах, дефицитных по гистидину или гистидину и аденину. Для поиска белковых взаимодействий молекулы хампина мыши его фрагмент Е216-К616 (хампин А) клонировали с помощью ПЦР в вектор pGBKT7 по участкам узнавания рестриктазами Ndel/ Smal. Клетки АН 109, трансформированные данной плазмидной ДНК, росли совместно с клетками Y187, предварительно трансформированными библиотекой кДНК 17-дневного эмбриона мыши (BD Biosciences) в векторе pGADrec (или pGADT7) на высокоселективной среде, дефицитной по гистидину, аденину, лейцину и триптофану. Первичные колонии пересевались несколько раз на селективной среде с X-a-Gal для включения индукции всех трех доступных репортерных генов (HIS, ADE, MEL1). Извлечение плазмид с положительных клонов проводили с помощью трансформации Е.соїі я дальнейшей повторной проверки для исключения ложнопозитивных сигналов - с помощью ко-трансформации клеток АН 109 совместно с вектором рОВКТ7-хампин или просто pGBKT7. Плазмидные ДНК, прошедшие все эти тесты, подвергались дальнейшей характеризации — секвенированию ДНК и т.д.
Аналогичные подходы применялись для поиска белок-белковых взаимодействий партнеров хампина (см. таб.). Мышей убивали с помощью цервикальной- дислокации [140]. Органы быстро извлекали, отрезали небольшой кусочек (около 30-50 мг), обрабатывали протектором RNALater (Ambion, США), замораживали в жидком азоте и хранили при -70 . Альтернативно, извлеченные органы использовали сразу для выделения РНК.:. РНК из образцов выделяли с помощью набора «SV Total RNA isolation system» (Promega, США). Вкратце: образец ткани гомогенизировали в 200 мкл лизирующего буфера (4М гуанидинтиоцианат, 0,01М Трис-HCl, рН 7,5, 0,87% 2-меркаптоэтанол) с помощью гомогенизатора Ultraurrax Т25 (Janke & Kunkel, Германия) при 24000 об/мин 10 сек, добавляли 400 мкл буфера для разбавления "SV RNA Dilution", перемешивали, инкубировали при +70 в течение 3 мин, центрифугировали 12000 об/мин 10 мин (настольная центрифуга). Надосадочную жидкость (супернатант) переносили в чистую пробирку, добавляли 200 мкл 95% спирта, перемешивали пипетированием, переносили в колонку Spin Basket; центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин, добавляли 40 мкл «желтого буфера» (0,0225М Трис-HCl, рН 7,5, 1,125М NaCl, 0,0025% желтого красителя), 5 мкл 0,09 М MnCk и 5 мкл ДНКазы I, инкубировали 15 мин, затем добавляли 200 мкл раствора, ингибирующего ДНКазу (2М гуанидинтиоцианат, 4 мМ Трис-HCl; рН 7,5, 57% этанол), центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин; Аналогично промывали колонку 600 мкл, а затем 250 мкл раствором для промывки (60 мМ ацетат калия, Трис-HCl, рН 7,5,60% этанол). Для элюции РІЖ помещали колонку Spin Basket в чистую пробирку, добавляли 100 мкл воды, не содержащей нуклеаз, инкубировали 1 мин, затем центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин. Элюированную РНК хранили при -70.
В случае выделения тотальной РНК из культивируемых клеток использовали рекомендованную процедуру снятия с помощью 0,25% раствора трипсина - 1 мМ ЭДТА в ФСБ, клетки промывали, и ресуспендировали в SV Total RNA Lysis buffer (200 мкл на 1 лунку 6 луночного планшета). Далее - согласно описанному выше протоколу.
Для синтеза первых цепей кДНК к 2 мкг полученной РНК добавляли 500 нг (dT)i2-18, денатурировали при 70 С в течение 3 мин. Смесь помещали в лед, добавляли 40 ед. акт/ ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека (iRNAsin, Promega), буфер для обратной транскриптазы M-MLV, dNTP до концентрации каждого 0.4 мМ, 200 ед. акт. обратной транскриптазы M-MLV (Promega). После инкубации в течение 2 ч при 37 С нуклеиновые кислоты последовательно очищали от белков с помощью последовательной экстракции смесью фенол-хлороформ (1 : 1), хлороформом и осаждали этанолом. Полученный осадок ресуспендировали в 50 мкл воды.
Олигонуклеотиды растворяли в 500 мкл воды (Milli-Q), хорошо перемешивали, центрифугировали 2 мин при 7000 об/мин на настольной центрифуге, надосадочную жидкость переносили в чистую пробирку, добавляли 300 мкл изобутилового спирта, перемешивали, центрифугировали до расслоения фаз, удаляли верхнюю. Повторяли еще два раза, затем добавляли ацетат аммония до концентрации 2М, осаждали этанолом. Полученный осадок ресуспендировали в 100-200 мкл буфера ТЕ.
К водному раствору, содержащему ДНК, добавляли половину объема «фенола» (фенол, содержащий 0,1% 8-гидроксихинолин, 0,2% 2-меркаптоэтанола и насыщенный (1:1) буфером (1 М Трис-HCl, рН 8,0), хорошо перемешивали, добавляли половину объема (от первоначального) «хлороформа» (хлороформ:изоамиловый спирт, 24:1), перемешивали, центрифугировали до расслоения фаз, отбирали верхнюю водную фазу и добавляли к ней такой же объем хлороформа, перемешивали, центрифугировали, отбирали верхнюю фазу. К водной фазе добавляли одну десятую (по объему) ЗМ раствора ацетата натрия (рН 5,2), 1 мкг тРНК (или 1,25 мкг гликогена) и 2 объема 95% этанола (или 1 объем 2-пропанола). Перемешивали, выдерживали не меньше получаса при -20о, центрифугировали (12000g, 10 мин), осадок промывали 70% спиртом, высушивали на воздухе и сухой осадок ресуспендировали в воде (Milli-Q).
Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции Смешивали раствор ДНК с буфером для-проведения реакции, добавляли фермент (из расчета одна единица на 1 мкг ДНК), аккуратно перемешивали. Реакцию проводили в объеме 10-50 мкл в течение 2-3 часов при 37. продукты расщепления анализировали электрофорезом в агарозном геле.
Очистка продуктов рестрикции и выделение ДНК из агарозного геля Проводили электрофорез реакционной смеси после рестрикции и при свете УФ-лампы (трансиллюминатора) вырезали кусочек геля, содержащий рестрицированную ДНК. ДНК извлекали из геля при помощи наборов "Concert" (Gibco BRL), Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System (Promega) или с помощью фильтров "Ultrafree-DA" (Amicon-Millipore, США). В последнем случае помещали кусочек геля в пробирку с фильтром, центрифугировали (12000g, 15 мин), фильтрат подвергали экстракции фенолом и хлороформом, после чего переосаждали этанолом. Альтернативно, продукты ПЦР очищали с помощью системы Montage PCR (Millipore, США). Реакция лигирования
Для сшивания фрагментов ДНК с помощью ДНК-лигазы фага Т4 смешивали рестрицированные и очищенные продукт ПНР (половина от выделенного из геля количества) и плазмидную ДНК (50-200 нг), добавляли буфер для ДНК-лигазы и фермент (Promega) в количестве 1-3 ед. Вейсса. Реакцию проводили в объеме 10-50 мкл в течение ночи при 16. после проведения реакции доводили объем реакционной смеси до 100 мкл, экстрагировали фенолом и хлороформом, переосаждали этанолом. Осадок ресуспендировали в 20 мкл воды (Milli-Q) и использовали для электропорации.
