Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 12
1.1. Жирные кислоты: свойства, биосинтез 12
1.2. Триацилглицерины 18
1.3. Исследования жирнокислотного состава жира байкальской нерпы 27
1.4. Содержание экотоксикантов в органах и тканях байкальской нерпы 25
1.5. Поверхностно-активные вещества 30
1.6. Микрокапсулированные формы лекарственных препаратов. 34
1.7. Основные факторы, влияющие на процесс получения эмульсий на основе растворов полимеров 38
1.8. Стабилизация эмульсий, используемых для получения микрокапсул 42
2. Результаты и обсуждение 46
2.1. Жирнокислотный состав подкожной жировой ткани байкальской нерпы. 46
2.2. Вертикальная стратификация жирных кислот в подкожной жировой ткани байкальской нерпы. 54
2.3. Состав триацилглицеринов в подкожной жировой ткани байкальской нерпы. 63
2.4. Металлы в органах и тканях байкальской нерпы 74
2.5. Амфифильные полиэфиры на основе жирных кислот природного происхождения 80
2.5.1. Синтез поверхностно-активных соединений на основе полиэтиленоксида и жирных кислот 86
2.5.2. Синтез поверхностно-активных соединений на основе полиглицерина и жирных кислот 93
2.5.3. Исследование поверхностно-активных свойств полученных амфифильных соединений 98
2.5.4. Исследование эмульгирующих свойств полученных эфиров 101
3. Экспериментальная часть 104
3.1. Объекты исследования 104
3.2. Исходные реактивы 104
3.3. Материалы и методы 105
3.3.1. Экстракция общих липидов 105
3.3.2. Получение свободных жирных кислот 105
3.3.3. Получение метиловых эфиров жирных кислот с применением 2 н. хлористого водорода в метиловом спирте 106
3.3.4. Анализ метиловых эфиров жирных кислот 106
3.3.5. Анализ триацилглицеридного состава 107
3.3.6. Определение металлов в органах и тканях байкальской нерпы 107
3.3.7. Обработка данных. 108
3.3.7.1. Метод главных компонент. 108
3.3.7.2. Индекс изменения общего состава. 109
3.3.7.3. Индекс стратификации. 109
3.3.8. Синтез поверхностно-активных соединений 109
3.3.8.1. Синтез поверхностно-активных соединений на основе монометилового эфира полиэтиленоксида и жирных кислот 109
3.3.8.2. Синтез поверхностно-активных соединений на основе полиглицерина и жирных кислот 110
3.3.8.3. Исследование структуры и свойств полученных поверхностно-активных веществ 110
3.3.9. Определение критической концентрации мицеллообразования 111
3.3.10. Получение эмульсий и определение среднего размера частиц 111
Выводы 112
- Триацилглицерины
- Основные факторы, влияющие на процесс получения эмульсий на основе растворов полимеров
- Состав триацилглицеринов в подкожной жировой ткани байкальской нерпы.
- Синтез поверхностно-активных соединений на основе полиэтиленоксида и жирных кислот
Введение к работе
В настоящее время заметно возрос интерес к липидам со стороны многих направлений наук, прежде всего это биологические, медицинские и химические. В первую очередь это связано с теми функциями, которые липиды выполняют в организме растений, животных и человека [1]. Липиды играют важную роль в метаболических процессах водных организмов и являются основным источником энергии для роста и воспроизводства гидробионтов.
Липидные показатели являются важнейшими характеристиками физиологобиохимической индикации состояния организмов и популяций при различных условиях обитания. Физиологические особенности теплокровных гидробионтов, обеспечивающие их высокую адаптационную способность к различным условиям среды обитания являются предметом комплексного изучения многих научных школ. Байкальская нерпа, как замыкающее звено в трофической цепи оз. Байкал и биоиндикатор экосистемы озера, привлекает большое внимание, но исследования, связанные с изучением состава липидов нерпы, единственного вида млекопитающих Байкала в литературе весьма немногочисленны [2]. Определяющую роль в обеспечении существования данного биологического вида играет особенность липидного обмена, меняющегося в зависимости от возраста особи, его пола и условий среды обитания. Эти факторы определяют актуальность исследования жирнокислотного состава липидов подкожной жировой ткани байкальской нерпы и его корреляции с комплексной оценкой физиологических параметров, исследуемых особей.
С другой стороны, устойчивая тенденция к более широкому применению в практическом здравоохранении лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище на основе натурального сырья привлекает внимание к природным липидам, как к источникам полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Так, высокая степень ненасыщенности жирных кислот природных жиров и масел обуславливает их биологическую активность, а амфифильность их структуры позволяет синтезировать полимерные соединения с поверхностно-активными свойствами. Поэтому на основе полиэтиленоксидов (ПЭО) и разветвленных полиглицеринов (ПГ), замещенных биологически активными жирными кислотами возможно получение биоразлагаемых поверхностно-активных полимеров биомедицинского назначения, поскольку и сами полимеры, и продукты их гидролиза не являются токсичными [3-4].
Таким образом, работа, направленная на исследование распределения жирных кислот в подкожной жировой ткани и разработку путей их практического применения актуальна.
Цель работы Исследование особенностей жирнокислотного состава жира, содержания металлов в органах и тканях байкальской нерпы и синтез поверхностноактивных соединений линейного и разветвленного строения на основе жирных кислот, полученных при переработке природного сырья.
Научная новизна
• Впервые проведено послойное исследование жирнокислотного состава подкожной жировой ткани байкальской нерпы различного возраста.
Обнаружены различия в жирнокислотном составе жировой ткани особей следующих возрастных групп: эмбрионы, щенки и взрослые особи байкальской нерпы.
• Впервые определен состав молекулярных видов триацилглицеринов жира байкальской нерпы. Выявлено, что жирные кислоты и образуемые ими молекулы триацилглицеринов распределяются послойно в подкожной жировой ткани нерпы. Выявлены различные слои (внешний, средний и внутренний).
Установлено влияние температуры окружающей среды на состав внешнего
• Впервые исследовано содержание металлов в органах и тканях байкальской нерпы в зависимости от различных факторов (возраста, пола и во временном аспекте) и отмечено снижение в накоплении тяжелых металлов в органах байкальского тюленя за трехлетний период.
• Синтезированы поверхностно-активные соединения на основе жирных кислот с полиэтиленоксидом и полиглицерином, имеющих линейное и разветвленное строение молекул.
• Обнаружена высокая эффективность синтезированных поверхностноактивных соединений в процессах эмульгирования и микрокапсулирования биологически активных компонентов.
Практическая значимость
• Сведения о содержании жирных кислот, триацилглицеринов и металлов в органах и тканях байкальской нерпы представляют большой научный и практический интерес в связи с организацией комплексного мониторинга экологического состояния озера Байкал.
• Предложена схема синтеза поверхностно-активных соединений на основе природных жиров и масел, имеющих перспективы использования в пищевой и фармацевтической промышленности.
Автор защищает • Особенности биохимического распределения жирных кислот и молекулярных видов триацилглицеринов в подкожной жировой ткани байкальской нерпы; • Содержание тяжелых металлов и микроэлементов в органах и тканях байкальской нерпы в зависимости от возраста, пола и временного аспекта; • Синтез и исследование свойств поверхностно-активных соединений на основе жирных кислот, выделенных из природного возобновляемого сырья; Апробация работы: Результаты работы докладывались на 3-ей школе-семинаре молодых ученых России "Проблемы устойчивого развития региона" (Улан-Удэ, 2004 г.), всероссийской конференции с международным участием "Полимеры в XXI веке", (Улан-Удэ, 2005 г.), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», III Международной научнопрактической конференции «Приоритеты и особенности развития Байкальского региона» (2008), всероссийской конференции по макромолекулярной химии (Улан-Удэ, 2008), научной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2008), 4 European Symposium on Plant Lipids (Gottingen, Germany, 2009).
Об актуальности работы свидетельствует поддержка данных исследований грантами:
1. «Выполнение научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических работ молодыми учеными и преподавателями во время проведения стажировок в российских научно-образовательных центрах» (Федеральная целевая научно-техническая программа «Исследования и разработки по приритетным направлениям развития науки и техники», 2005);
2. «Проведение молодыми учеными научных исследований по приоритетным направлениям науки» (Федеральная целевая научно-техническая программа «Исследования и разработки по приритетным направлениям развития науки и техники», 2006);
3. «Научная работа молодых российских ученых в ведущих организациях Российской Федерации "моб_ст"» (Российский фонд фундаментальных исследований, 2008);
4. «Научные основы разработки новых лекарственных препаратов. Перспективы использования возобновляемого природного сырья» (междисциплинарный интеграционный проект СО РАН, 2006-2008);
5. «Проведение экспедиционных исследований эндемиков оз. Байкал» (международный грант Сибирского Отделения РАН, 2002-2008)
Триацилглицерины
Поскольку индивидуальные жирные кислоты образуют молекулы ТАГ, биохимические характеристики жира могут быть охарактеризованы также содержанием молекулярных видов ТАГ. Триацилглицерины (ТАГ) - важнейшие компоненты липидов (-90%) - это сложные эфиры трехатомного спирта глицерина и высших жирных кислот (нейтральные жиры): Триацилглицерины бывают различных типов в зависимости от природы и положения трех остатков жирных кислот, этерифицирующих гидроксильные группы глицерина. Простые ТАГ содержат три кислотных остатка одной и той же жирной кислоты (например, тристеарин, триолеии и др.). Смешанные ТАГ содержат два либо все три разных остатка жирных кислот (например, 1-пальмито-2-олеостеарин). Физические свойства триацилглицеринов зависят от характера высших кислот, входящих в состав их молекул. Чем жир богаче остатками короткоцепочечных и ненасыщенных жирных кислот, тем выше его растворимость и ниже температура плавления. Насыщение и увеличение длины цепей приводит к возрастанию температуры плавления. ТАГ, содержащие остатки только насыщенных жирных кислот, при комнатной температуре имеют твердую консистенцию. Примером может служить тристеарин - основной компонент говяжьего сала. При наличии в составе ТАГ трех остатков ненасыщенных жирных кислот температура плавления снижается. Например, в жире человека, имеющим температуру плавления 15С, содержится 70 % олеиновой кислоты (в физиологических условиях организма он жидкий). Большинство природных жиров включают смеси простых и смешанных ТАГ, в состав которых входят жирные кислоты, различающиеся как по длине цепи, так и по степени ненасыщенности. Например, сливочное масло представляет собой смесь ТАГ, причем в состав некоторых из них входят жирные кислоты с относительно короткими цепями, содержащими от 4 до 10 углеродных атомов. Триацилглицерины - основной компонент жировых депо животных и растительных клеток.
Жиры значительно лучше, чем гликоген, приспособлены для запасания энергии: во-первых, они могут накапливаться в больших количествах в практически чистом, негидратированном виде; во-вторых, в расчете на единицу массы в них запасается в два раза больше энергии, чем в углеводах. Триацилглицерины являются неполярными, гидрофобными соединениями, поскольку не содержат заряженных или сильно полярных функциональных групп. В мембранах клеток они обычно не наблюдаются. Основным местом переваривания и всасывания жиров в организме является тонкий кишечник, где под действием панкреатической липазы с участием желчи ТАГ гидролизуются с образованием моноглицеридов, небольшого количества глицерина и жирных кислот. Принято разделять кислоты, содержащиеся в жирах, на две категории: главные и второстепенные кислоты. Главными считаются кислоты, содержание которых в жире превышает 10 %. Большинство жиров содержат две или три главные кислоты и некоторые другие кислоты в меньшем количестве. Все кислоты распределены таким образом, что образуется по возможности большее число смешанных триацилглицеринов («принцип равномерного распределения»). Иными словами, каждая молекула ТАГ стремится к более гетерогенному составу. Например, масло какао содержащее в качестве основных кислот пальмитиновую, стеариновую и олеиновую в примерно равном молярном соотношении, состоит в большей степени из олеопальмитостеарина, тогда как трипальмитин, тристеарин и триолеин содержатся в незначительных количествах [1,20,21]. В различных организмах биосинтез липидов осуществляется различными, но достаточно близкими путями. Как уже упомянуто, жирная кислота синтезируется самостоятельно и в коферментно связанной форме взаимодействует с глицерином. Но вариант участия собственно глицерина редок, так как процесс с участием трех свободных гидроксилов не обеспечит структурной селективности, если необходимо ввести различные кислотные остатки. Обычно реакция начинается от дигидроксиацетона или от 2,3-дигидроксипропанола - оба они образуются при катаболизме углеводов. Наиболее селективной является биосинтез липидов , который стартует от дигидроксиацетона. На первом этапе дигидроксиацетон фосфорилируется по одной спиртовой функции, образуя соответствующий фосфат. Оставшаяся свободная гидроксильная группа теперь может быть однозначно ацилирована коферментно связанной жирной кислотой. На следующей стадии карбонильная группа с помощью NAD-H восстанавливается до спиртовой, которая в свою очередь может быть этерифицирована уже другой молекулой коферментно связанной жирной кислотой. Таким образом, образуется фосфатидная кислота, которая далее может идти на формирование фосфолипидов, либо при гидролизе высвободить еще одну спиртовую функцию для окончательного ацилирования, образующего триацилглицерины - жиры (масла) [18]. До недавнего времени изучение состава молекулярных видов ТАГ подкожного жира морских млекопитающих не были еще описаны в литературе.
Основной причиной этого являлось отсутствие точных и чувствительных методов, позволяющих определение индивидуальных молекулярных видов липидов. Обычно, анализ ТАГ из биологических образцов основывался на выделении их из липидных экстрактов (например, ТСХ, ВЭЖХ), омылении, метанолизе и разделении метиловых эфиров жирных кислот с помощью газовой хроматографии. Тем не менее, этот подход не идентифицирует молекулярные виды ТАГ, а определяет процентный состав индивидуальных жирных кислот, присутствующих в общей триацилглицеридной фракции. Также, для разделения ТАГ использовали ферментативные методы [22], среди которых наибольшее распространение получил способ определения по Букколо и Дэвиду, в котором ферментативный гидролиз триацилглицеринов под воздействием липопротеиновой липазы сопровождается энзиматическим определением глицерина (образующийся в процессе гидролиза глицерин фосфорилируют, затем окисляют до дигидроацетонфосфата, а образующийся в этой реакции пероксид водорода определяют по классической РАР-реакции с 4 аминоантипирином). Интенсивность окраски производного хинонимина (красный цвет) регистрируется при 546 (500-550) нм и прямо пропорциональна концентрации триацилглицеринов в пробе. Этот метод имеет только одно граничное условие: необходимо точно соблюдать время инкубации и поддерживать стабильную температуру на протяжении всего определения. Хотя оба эти метода точно разделяют общие ТАГ, но они не дают полной информации по составу молекулярных ТАГ. В настоящее время, развитие масс-спектрометрических методов позволяет использовать их в различных областях науки. Хромато-масс-спектрометрия позволяет проводить качественный анализ сотен молекулярных видов липидов, включающих ТАГ, с высокой чувствительностью и скоростью, который превосходит традиционные методы на несколько порядков[23,24]. Электроспрей ионизационная масс-спектрометрия (ESI-MS) используется в анализе липидов недавно, и предлагает новые возможности для количественного анализа молекулярных видов ТАГ извлекаемых напрямую из хлороформных экстрактов биологических образцов [25,26].
Основные факторы, влияющие на процесс получения эмульсий на основе растворов полимеров
Эмульсии - термодинамически неустойчивые системы, их получение есть результат двух конкурирующих процессов: диспергирования всего объема жидкости с образованием отдельных капель и коалесценции этих капель с образованием частиц большего размера, поэтому необходима стабилизация капель по мере их образования. Диспергирование - это "быстрый" процесс, протекающий в течение нескольких секунд, а процесс коалесценции может длиться часами [100]. При получении эмульсии необходимо контролировать некоторые ее характеристики, а именно: а) концентрацию, б) стабильность, в) размер частиц, г) вязкость. Эти свойства являются зависимыми друг от друга. Так, чем меньше размер частиц, тем больше вязкость и стабильность эмульсии. Концентрированные эмульсии обычно очень вязкие, а для достижения высокой стабильности или высокой концентрации иногда требуются противоположные условия. Основной особенностью формирования капель является образование несмешивающейся двухфазной эмульсионной системы. Для совершения работы по созданию поверхности раздела фаз необходимо затратить энергию. Чем больше энергии затрачивается на создание межфазной поверхности, тем больше может быть величина этой поверхности, а, следовательно, и дисперсность эмульсии. Поэтому способ и условия диспергирования оказывают определяющее влияние на размер частиц дисперсной фазы. Основными способами диспергирования являются: механическое перемешивание и ультразвуковое диспергирование. Эти методы различаются как механизмом образования капель, так и аппаратурным оформлением. При механическом перемешивании энергия необходима не только для образования новых поверхностей, но и для преодоления внутреннего трения жидкости и приведения ее в движение. Потребляемая установкой для эмульгирования мощность будет зависеть от целого ряда факторов: скорости прохождения жидкости, ее вязкости, поверхностного натяжения, использованного стабилизатора, размера частиц, концентрации эмульсии, подъема температуры, а так же размера и типа самого аппарата. Принцип работы смесителей достаточно прост
Вращающаяся в цилиндрическом сосуде мешалка приводит жидкость в движение, причем ее поверхность принимает форму, близкую к параболической. Частицы жидкости приобретают круговое движение по горизонтали и лишь в незначительной степени - вертикальное перемещение. На размеры капель в эмульсиях оказывает влияние время перемешивания. Установлено, что продолжение перемешивания сверх оптимального времени мало улучшает качество эмульсий. При нормальных условиях эмульгирования средние размеры капель уменьшаются очень быстро в течение первых нескольких секунд и постепенно достигают предельного значения за 1-5 мин. Стабильность и вязкость эмульсий изменяются аналогично. Таким образом, если время перемешивания больше оптимального, то затраты мощности оказываются невыгодными. Интенсивность перемешивания также оказывает существенное влияние на размер частиц эмульсии. Было установлено, что поверхность капель возрастает при увеличении скорости вращения и диаметра мешалки и при уменьшении диаметра смесителя. Удельная поверхность Sya возрастает пропорционально разности плотностей дисперсионной среды и дисперсной фазы рс - рф. Чем больше отличаются жидкости по плотности, тем больше отличие в скоростях, которые приобретают капли этих жидкостей при прочих равных условиях, а чем больше градиент скорости, тем больше касательные напряжения, которые вызывают диспергирование. Величина Syff также возрастает при уменьшении поверстного натяжения, ибо требуется совершить меньшую работу для образования новых поверхностей. Вязкости дисперсной фазы (тф) и дисперсионной среды (тс) также играют существенную роль. Значение Sy;( уменьшается при увеличении отношения гф/гс. Чем выше вязкость дисперсной фазы, тем большую работу необходимо совершить для создания единицы поверхности раздела фаз вода - раствор полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе. Поэтому чем выше вязкость раствора полимера, тем больше размер частиц дисперсной фазы. Изменение температуры оказывает на эмульсии лишь косвенное воздействие: изменяется поверхностное натяжение и вязкость. Поскольку при возрастании температуры и вязкость, и поверхностное натяжение уменьшаются, то и эмульгирование происходит легче. Нередко температура повышается вследствие энергичного перемешивания жидкости, однако в ряде случаев этого нельзя допускать, например, для предотвращения денатурации белков. Поэтому в .ряде методик по микрокапсулированию на стадии эмульгирования используют охлаждение [101], значительное понижение или повышение температуры также приведет к коагуляции частиц - ухудшению качества эмульсии. Образование эмульсий методом ультразвукового диспергирования достигается путем превращения электрической энергии в механические высокочастотные колебания.
Размер частиц и устойчивость эмульсий, полученных методом ультразвукового диспергирования, зависят от характеристик использованной акустической аппаратуры, а также от времени озвучивания. Ультразвуковое диспергирование дает возможность готовить достаточно концентрированные (до 30%) высокодисперсные эмульсии без использования поверхностно-активных веществ [102], что особенно ценно для получения микрокапсул, содержащих лекарственные вещества. Основными параметрами, которые характеризуют озвучивание, являются интенсивность и частота ультразвука. Когда система из двух жидкостей озвучивается, концентрация эмульсии вначале быстро возрастает и вскоре достигает предельного значения. Если интенсивность звуковой волны возрастает, эмульгирование завершается в более короткий срок. Изменение частоты влияет на производительность эмульгирования. Более низкие частоты оказываются более выгодными для эмульгирования. Чем ниже частота, тем меньшая интенсивность звука требуется. Наиболее эффективной для эмульгирования является область частот 20-50 кгц, а интенсивность порядка 0,2 Вт/см". Кроме параметров звуковой волны на эмульгирование влияют и свойства самих жидкостей, а именно: плотность, поверхностное натяжение, вязкость. Влияние этих факторов в большинстве случаев такое же, как и при механическом перемешивании. Эмульсионная система представляет интерес, только если капли эмульсии имеют определенный размер, который не изменяется в течение 10-30 минут, в зависимости от различных параметров эмульсионной системы. В этом случае эмульсия кинетически стабильна, а распределение частиц по размерам не неизменно, что возможно при выполнении двух условий [103]: 1) постоянная скорость перемешивания; 2) постоянный объем и вязкость дисперсной фазы и дисперсионной среды. Распад больших капель жидкости на малые происходит на последних стадиях эмульгирования. Очевидно, что для деформации и разрушения жидкой капли, в объеме, где она находится, необходимо создать относительно большие сдвиговые и растягивающие напряжения. Величина таких напряжений обуславливается динамическим и вязкостным сопротивлением жидкой среды. С термодинамической точки зрения эмульсии, как и другие дисперсные системы, никогда не являются полностью устойчивыми из-за того, что поверхность раздела между фазами обладает избытком свободной энергии.
Состав триацилглицеринов в подкожной жировой ткани байкальской нерпы.
Поскольку индивидуальные жирные кислоты в организме млекопитающих образуют молекулы ТАГ, биохимические характеристики различных слоев жира более точно могут быть охарактеризованы содержанием молекулярных видов ТАГ. Изучение послойного состава молекулярных видов ТАГ было проведено с помощью электроспрей-ионизационной масс-спектрометрии. Масс-спектры некоторых образцов приведены на рисунках 2.8 - 2.9. Аликвоты общих липидов образцов жира, взятых послойно через 3 мм были экстрагированы по методу Фолча. Непосредственно перед масс-спектрометрическим анализом в образцы добавляли водный раствор аммиака, поскольку молекулярные виды ТАГ детектируются в виде положительно заряженных ионов (ТАГ+гШ4)+. В жире байкальской нерпы было выявлено около 200 различных молекулярных видов ТАГ, из них определены 37 видов молекул ТАГ в количестве более чем 0,1 мол.%, определен жирнокислотный состав ТАГ (табл. 2.3). Из числа идентифицированных видов ТАГ 2% составляли мононенасыщенные и 98% полиненасыщенные виды ТАГ. Что касается длины жирнокислотных цепей, то около 30% идентифицированных ТАГ содержали жирные кислоты со средней длиной цепи (С8-С14) и около 70% имели в составе длинноцепные жирные кислоты (С 16- С22). Главными кислотами, входящими в состав ТАГ являются 14:0, 16:0, 16:1, 18:0, 18:2, 18:3, 20:4, 20:5, 22:5, 22:6 - что согласуется с данными, полученными газо-хромато-масс-спектрометрическим методом (табл. 2.2). Все кислоты распределены таким образом, что образуется по возможности большее число смешанных триацилглицеринов («принцип равномерного распределения»). Из числа простых или однородных ТАГ были замечены только тристеарин и триолеин, которые составляют 0,8% и 3,6% от общего количества идентифицированных ТАГ, соответственно. Таким образом, каждая молекула ТАГ стремится к более гетерогенному составу.
Доминирующими ТАГ являются ТАГ 48:2, 50:3, 50:2, 52:4, 52:3, 52:2, 54:7, 54:6, 56:8, 56:7. Эти ТАГ составляют около 50% от общего количества идентифицированных ТАГ. Большую часть ТАГ составляли мононенасыщенные жирные кислоты (МНЖК), особенно 16:1п-7 и 18:1п-9, как преобладающие составляющие три-МНЖК и МНЖК/МНЖК/ПНЖК молекулярных видов. Во внешнем слое преобладали ТАГ состава НЖК/МНЖК/МНЖК и МНЖК/МНЖК/ПНЖК, тогда как внутренний слой характерен триацилглицеринами состава НЖК/НЖК/МНЖК, НЖК/НЖК/ПНЖК, НЖК/МНЖК/МНЖК и три-МНЖК. Анализ данных методом ГК показывает послойное изменение содержания ТАГ в жировой ткани взрослых особей также, как и для индивидуальных ЖК (рис. 2.10), что говорит о вертикальном распределении молекул ТАГ по всей толщине жировой ткани. Сопоставив на рис. 2.10 а и б, можно заметить преобладание молекул ТАГ с большим количеством ненасыщенных связей в верхних слоях подкожной жировой ткани, тогда как во внутренних слоях имеют тенденцию превалировать молекулы ТАГ с одним - двумя двойными связями. Такое распределение молекул ТАГ также является результатом адаптации к температуре внешней среды. 72 Это подтверждено также графиками ИС ТАГ между внешним и внутренним слоями для особей байкальской нерпы различного возраста (рис. 2.11 - 2.12), где молекулы ТАГ с меньшей степенью ненасыщенности имели отрицательный индекс стратификации, исключение составляют молекулы ТАГ, имеющие в своем составе короткоцепные мононенасыщенные жирные кислоты, которые имеют тенденцию преобладать во внешнем слое жировой ткани. Для изучения линейности степени изменения относительного состава ЖК или ТАГ по всей толщине жира был использован индекс изменения общего состава, который рассчитывается как разница мол. % каждой ЖК или ТАГ между предыдущим слоем (Fip), интересующим слоем (FiX) и следующим слоем (Fin): HHOCx=XXFip-FiX+FXi-Fin)). Поскольку образцы были взяты через фиксированные интервалы, окончательный график представляет собой среднее значение между ИИОС предыдущего и последующего слоев. Таким образом, максимумы в графике вертикального профиля ИИОС говорят о резких изменениях состава между наиболее стабильными слоями. Из рис. 2.13 видно, что относительные количества индивидуальных ТАГ и ЖК различаются по всей толщине жира между разными особями. При толщине жира более 30 мм различима переходная зона, расположенная на глубине в 12-15 мм от шкуры. Это было замечено и на графиках отдельных ВПЖК и на графиках ИИОС. Значения ИИОС были схожи во внешнем слое исследованных особей, что говорит о стабильности в составе ЖК/ТАГ у особей различного возраста и толщины жира в этом слое. Тем не менее, вертикальный профиль ИИОС зависит от толщины жира и в зависимости от значения этого индекса особи можно разделить на две категории. У особей, имеющих толщину жира 30 мм и менее, величина ИИОС мало изменяется по всей толщине жира.
Тогда как у животных имеющих толщину жира более 30 мм кривые ИИОС имеют характерные пики, которые соответствуют переходам к различным зонам (внешний, средний и внутренний слои). Таким образом, вертикальные профили и жирных кислот и ТАГ в подкожном жире байкальских нерп свидетельствуют о различных биохимических слоях, которые количественно и качественно отличаются друг от друга, и вероятно представляют различные функциональные слои по всей толщине жира. Байкальская нерпа - важнейший объект биомониторинга, проводимого на Байкале, поскольку она является замыкающим звеном в трофической цепи водоема. Сведения о содержании металлов в органах и тканях байкальской нерпы представляют большой научный и практический интерес в связи с организацией комплексного мониторинга экологического состояния водоема [59]. Поэтому актуальность этой проблемы не вызывает сомнений. В связи с этим проведено исследование содержания металлов в органах и тканях байкальской нерпы как биоиндикатора экосистемы оз. Байкал. Определение концентраций М в образцах осуществлялось методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии у животных различного возраста и пола в период с 2002 по 2004 гг. Полученные данные приведены в таблице 2.4. Данные также были обработаны с помощью МГК с использованием программного пакета «Sirius 7.0» [112]. График ГК (рис.2.14) выявил явное различие для разных тканей - мышечной, печени и почек. Это связано с тем, что органы, играющие большую роль в процессах секреции, экскреции и депонирования в организме гидробионтов (печень, почки) характеризуются повышенным содержанием М. Концентрации почти всех определяемых металлов выше в печени и почках по сравнению с мышечной тканью, что согласуется с данными, полученными I. Watanabe в 1992 г. [61].В свою очередь, почки и печень также различаются между собой степенью аккумуляции металлов. По степени концентрирования металлов ткани и органы располагаются следующим образом (в порядке возрастания): мышцы - почки -печень.
Синтез поверхностно-активных соединений на основе полиэтиленоксида и жирных кислот
Полиоксиэтиленовые эфиры жирных кислот RCOO(CH2CH20)mH синтезируют прямым оксиэтилированием кислот или этерификацией полиэтиленгликоля предварительно полученными хлорангидридами кислот. В настоящей работе синтезированы эфиры метилполиэтиленоксида (ММ=350) и жирных кислот (стеариновая, линолевая и линоленовая кислоты, а также свободные жирные кислоты, выделенные из жира байкальской нерпы и кедрового масла), согласно следующей схеме (рис.2.19): В ЯМР-Н1 спектрах (рис.2.20 - 2.24) эфиров метилполиэтиленгликоля наблюдаются сигналы протонов алкильных групп (-СН3 и -СН2) жирных кислот в области 0,87-0,96 и 1,07 - 1,40 м.д., соответственно. В области 1,5 - 1,6 м.д. и 2,2 - 2,3 м.д. присутствуют сигналы метиленовых протонов, связанных со сложноэфирными группами (-СН2 -СН2-СОО, -СН2 -СОО), а в областях 2,04 -2,12 м.д., 2,66 - 2,80 м.д.протоны метиленовых групп, связанных с ненасыщенными связями (-СН2 -СН= и =СН СН2-СН=, соответственно). В области 5,33 - 5,46 м.д. располагаются сигналы протонов ненасыщенных связей (-НС=СН-). Область 3,9 - 4,2 соответствует СО-0-СН2- группам. В области 3,0 - 4,0 м.д. присутствуют сигналы протонов молекул полиэтиленгликоля. Как упоминалось ранее, замена линейных гидрофильных блоков на сверхразветвленные позволит существенно расширить области применения таких поверхностно-активных веществ. Наличие каналов и пор в макромолекулах сверхразветвленных полиглицеринов позволяет применить их для капсулирования и иммобилизации гостевых низкомолекулярных соединений, в том числе и физиологически активных. Такие композиции, построенные по типу гость-хозяин, перспективны для применения в биологии, медицине, фармакологии, косметологии. Высокая степень функциональности создает широкие возможности для дальнейших модификаций макромолекул сверхразветвленных полиглицеринов, получая при этом структуры, обладающие ярко выраженными лиофобными или лиофильными свойствами. В этом аспекте особое внимание привлекают возможности модификации полиглицериновых молекул гидрофобными линейными остатками жирных кислот.
Таким образом, было целесообразно синтезировать полиэфиры с разветвленной структурой полиглицерина и с различной степенью замещения гидроксильных групп (от 5 до 20%) ацильными остатками кислот (линолевой и жирных кислот, выделенных из жира байкальской нерпы и кедрового масла) Схема синтеза сверхразветвленных полиэфиров на основе полиглицерина и жирных кислот приведена на рисунке 2.25. Ход реакции образования амфифильных олигомеров контролировали по данным ИК-спектров, снятых с образцов реакционной смеси. В процессе реакции наблюдалось появление и рост пика, соответствующего поглощению при v=1800-1730 см"1, характерного для валентных колебаний карбонильной группы сложного эфира, а также уменьшения пиков, соответствующих поглощению при v=1680-1630 см"1, характерного для валентных колебаний карбонильной группы свободной линолевой кислоты и при v=3600-3000 см"1, характерного для валентных колебаний гидроксильных групп.Полученные полиэфиры представляют собой вязкие, медообразные вещества, цвет которых варьируется от светло-коричневого до темно-коричневого. Растворимость полученных олигомеров в органических растворителях и в воде сильно зависит от их состава, при этом с увеличением количества гидрофобных цепей способность растворяться в полярных растворителях понижается (табл. 2.7). Состав и строение полученных полиэфиров было подтверждено спектрами ИК и ПМР - спектроскопии и данными элементного анализа. При анализе ИК-спектров (рис.2.26) полученных полимеров были выявлены характерные полосы поглощения в области 1800-1730 см"1 -валентные колебания С=0 групп сложноэфирной связи, 1600-1650 см"1 валентные колебания С=С связи, и 1100-1080 - полоса поглощения, характерная для простой эфирной связи -С-0-С-. Кроме того, присутствует сильная полоса поглощения в области 3600-3000 см"1, соответствующая валентным колебаниям свободных ОН-групп. В ЯМР-Н1 спектрах (рис.2.27)эфиров в области 0,87-0,96 и 1,07 - 1,40 м.д. наблюдаются сигналы протонов -СНз и -СН2 групп, соответственно. В области 1,5 - 1,7 м.д. и 2,2 - 2,4 м.д. присутствуют сигналы метиленовых протонов, связанных со сложноэфирными группами (-СН2 -СН2-СОО, -СН2 -СОО), а в областях 2,04 - 2,12 м.д., 2,66 - 2,86 м.д. протоны метиленовых Для оценки поверхностных свойств использовалась величина критической концентрации мицеллообразования (ККМ), определенная методом флуоресцентной пробы, основанный на дифенилгексатриене в качестве флуоресцирующей молекулы [121-123]. По изменению интенсивности флуоресценции растворов определили критическую концентрацию мицелообразования (рис.2.28, табл.2.9). Для полученных эфиров выявлена зависимость критической концентрации мицеллообразования от количества двойных связей в гидрофобном радикале (рис.2.29) в ряду стеариновая кислота - линолевая кислота - линоленовая кислота, где количество углеродных атомов остается постоянным (С=18), а количество двойных связей увеличивается (0 - 2 - 3).
Замечено, что увеличение количества двойных связей в гидрофобной части молекулы приводит к увеличению ККМ. Что касается эфиров на основе природных жирных кислот, то меньшее значение ККМ для эфира на основе жирных кислот, выделенных из жира нерпы, может быть объяснено наличием в смеси кислот с большим числом углеродных атомов (С 18), поскольку было показано [80], что величина ККМ с увеличением числа углеродных атомов уменьшается по лагорифмическому закону. Большая величина ККМ для эфиров на основе жирных кислот, выделенных из кедрового масла может быть объяснена как наличием в смеси кислот с меньшим числом атомов углерода, так и наличием большего количества ненасыщенных связей. Для водных растворов полиэфиров с 20 %-ой степенью замещения гидроксильных групп (при мольном соотношении ПГ:ЖК=1:5,6) была определена величина ККМ водных растворов также по методу гашения флуоресценции растворов. Данные приведены в таблице 2.11. Установлено, что все исследованные полимеры обладают четко выраженной критической концентрацией мицеллообразования. В настоящее время, технологии получения векторов лекарственных средств, белков, ферментов, генетического материала и др., испытывает потребность в эффективных биосовместимых и биоразлагаемых ПАВ, необходимых для получения нано- и микрокапсул с заданными функциональными свойствами. В наиболее распространенном методе микро- и нанокапсулирования, основанном на двойном эмульгировании с последующим испарением (экстракцией) органического растворителя, использование таких ПАВ связано с необходимостью стабилизации первичной и вторичной (двойной) эмульсий, без чего получение нано- или микрокапсул с контролируемым размером частиц невозможно. Поскольку полученные в данной работе полимеры предполагается использовать для получения микрокапсул методом двойного эмульгирования, важными характеристиками являются размер частиц и устойчивость обратных эмульсий, полученных в их присутствии. Для исследования этих параметров нами были получены эмульсии воды в метиленхлориде в присутствии синтезированных полиэфиров (рис. 2.30-2.31) и определены их важнейшие характеристики, такие как размер частиц эмульсии и их устойчивость.
