Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 8
2.1. Структура и химический синтез катионных амфифилов на основе стероидных соединений 8
2.1.1. Катионные производные на основе холестерина 9
2.1.2. Холестерилсодержащие производные дистамицина 15
2.1.3. Катионные липиды на основе витаминов D2 и D3 17
2.1.4. Углеводсодержащие амфифилы 18
2.1.5. Катионные производные полиаминов и аминокислот 23
2.2. Генная терапия и механизм липофекции 34
3. Обсуждение результатов 45
3.1. Синтез положительно заряженных производных холестерина с различными азотистыми основаниями гетероциклического и алифатического ряда 46
3.1.1. Синтез катионных липидов со спейсерной группой, представленной остатком 5-бромвалериановой кислоты 47
3.1.2. Синтез катионных амфифилов с сукцинильной спейсерной группой 52
3.1.3. Синтез катионного липида с карбамоильной связью 54
3.1.4. Синтез катионных амфифилов с ацетальной связью с использованием метилтиометилового эфира холестерина 56
3.2. Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты 61
4. Экспериментальная часть 69
4.1. Синтез положительно заряженных производных холестерина с различными азотистыми основаниями гетероциклического и алифатического ряда 70
4.1.1. Синтез катионных липидов со спейсерной группой, представленной остатком 5-бромвалериановой кислоты 70
4.1.2. Синтез катионных амфифилов с сукцинильной спейсерной группой 74
4.1.3. Синтез катионного липида с карбамоильной связью 76
4.1.4. Синтез катионных амфифилов с ацетальной связью с использованием метилтиометилового эфира холестерина 78
4.2. Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты 80
5. Выводы 87
Список литературы 88
- Катионные липиды на основе витаминов D2 и D3
- Катионные производные полиаминов и аминокислот
- Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты
- Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты
Введение к работе
В современной медицине известно большое число заболеваний, непосредственно связанных с нарушениями функционирования генов. Для их лечения успешно развивается одна из перспективных областей медицины -генная терапия, которая направлена либо на коррекцию наследственного заболевания, возникшего вследствие генетического дефекта, либо на придание клеткам новых функций, способствующих устранению патологических процессов. Необходимым условием генотерапии является эффективная доставка терапевтического гена (трансфекция) в клетки-мишени и обеспечение его экспрессии и длительного функционирования в этих клетках.
В настоящее время большое внимание уделяется разработке невирусных систем доставки гена. Среди них высоким терапевтическим потенциалом обладает липофекция, в основе которой лежит транспорт генетического материала в клетки с помощью катионных липосом. Положительно заряженные липосомы выступают в качестве компактизирующего средства,.. защищая молекулы ДНК, мРНК и олигонуклеотидов от инактивации под действием клеточных ферментов. Они способны переносить через клеточную мембрану молекулы ДНК больших размеров и инициировать эндоцитоз. Важным преимуществом систем доставки генов на основе липосом является их биодеградируемость, низкая вероятность инициации иммунного ответа или воспалительной реакции. Катионные липосомы можно получить традиционными методами, они коммерчески доступны и стабильны при хранении. Необходимо отметить, что метод трансфекции, использующий в качестве медиаторов положительно заряженные липосомы, может оказаться перспективным в ферментно- и гормоно-заместительной терапии при лечении разных форм таких заболеваний, как сахарный диабет, дефекты роста, заболевания крови, сердечно-сосудистые и онкологические заболевания.
Разнообразие состава липосом и структурных параметров образующих их липидов определяет механизмы, их взаимодействия с биологическими системами. Положительно заряженные , липосомы, сформированные из катионных липидов и липидов-«хелперов» способны образовывать комплексы с плазмидной ДНК (геносомы или липоплексы) за счет электростатического взаимодействия между положительно заряженной гидрофильной частью катионного липида и отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот. Далее происходит проникновение геносомы в клетки-мишени, внутриклеточное распределение комплекса, его диссоциация и последующая экспрессия ДНК в ядре. Для повышения эффективности метода липофекции необходимо оптимизировать такие характеристики как стабильность геносомы, способность эндосомального высвобождения комплекса липосома-ДНК, регулируемость экспрессии.
Для получения катионных липосом наиболее перспективными являются метаболизируемые липиды с минимальной цитотоксичностью. В связи с этим целесообразно проводить их поиск в ряду модифицированных природных липидов.
В настоящее время синтезирован большой набор положительно заряженных глицеролипидов с различными алифатическими и гетероциклическими катионными. головками, которые показали высокую эффективность трансфекции.. Дальнейшее получение и изучение новых катионных липидов, в частности производных холестерина и желчных кислот, может привести к созданию удобных и эффективных систем для введения в клетку различных биологически активных веществ: нуклеозидов, олиго- и полинуклеотидов, гормонов, белков и других природных и синтетических макромолекул с отрицательно заряженными участками молекулы.
Данная работа является продолжением исследований в области катионных амфифилов, предназначенных для трансфекции, и посвящена созданию модификационных рядов катионных липидов с одной или несколькими катионными группами на основе стероидных соединений.
Настоящая работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры ХТТОС МИТХТ им М. В. Ломоносова по теме № 1Б-4-865 «Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины» и при поддержке РФФИ, проекты № 01-03-33234, 00-15-866, 03-03-32482, научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», подраздел «Лекарственные и биологически активные вещества» № 203.05.04.005, гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ России № НШ-2013.2003.3, гранта МНТЦ № 1813р.
На защиту выносятся следующие основные положения:
1. Синтез положительно заряженных производных холестерина с азотистыми основаниями гетероциклического и алифатического ряда.
2. Получение катионных амфифилов на основе холестерина с использованием метилтиометиловых эфиров.
3. Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевои кислоты.
Катионные липиды на основе витаминов D2 и D3
Трансфекционная активность катионных липидов была протестирова/..6+3 на на клеточной линии BL-6 (меланома мыши). Среди исследованных липидов полиамины 21 d и 22d показали высокую эффективность трансфекции в широком ряду соотношений липид/ДНК. Так, эффективность трансфекции с применением катионных амфифилов на основе витамина D2 изменялась в ряду: 21d 21c 21a 21b, аналогичная тенденция наблюдалась и для катионных липидов 22a-22d, полученных на основе витамина D3. Подобные эксперименты по трансфекции проводились и на четырех других клеточных линиях 3LL, NIH3T3, HeLa и 293. Уровень активности при переносе маркерного гена люциферазы, полученный на клетках 293 оказался выше, чем на других типах клеток, поскольку различные типы клеточных линий имеют различную чувствительность к агентам трансфекции. Производные 21, 22 показали уровень трансфекции, соизмеримый с DC-Choi, за исключением 21 b и 22Ь.
Значительно возросший за последние годы интерес к положительно заряженным липидам привел к созданию медицинских препаратов, включающих в свой состав гликолипиды. Введение углеводного звена направлено на решение проблемы адресной доставки терапевтического гена в клетки определенного типа. Углеводная часть может быть представлена остатком глюкозы, галактозы, маннозы.
Выбор объекта для синтеза основывался на свойствах амфифильных компонентов проникать через клеточную мембрану, увеличивать "фьюзогенный потенциал" транспортируемых частиц, способствовать образованию комплекса с ДНК. Исследования в этой области показали, что коньюгаты холевой кислоты с полиаминами 23-25 более эффективны, чем Lipofectin для переноса ДНК в COS-7 клетки [30, 31]. Наиболее эффективными оказались соединения 23с и 24с, которые образовывали стабильные комплексы с плазмидной ДНК.
Одним из наиболее перспективных направлений в применении липидов, содержащих углеводный фрагмент, является трансфекция к гепатоцитам печени. Для клеточно-специфичного попадания в гепатоциты использовали галактозные лиганды, экспонированные на поверхности катионных липосом. Поскольку, рецепторный белок [галактоза (Gal) или N-ацетилгалактозамин (Gal-NAc) - асиалопротеиновый рецептор (AsGPr)] в значительной степени присутствует на паренхимных клетках печени, AsGPr рассматривается как возможный носитель лекарственных средств во многих исследованиях [32-35].
Соединения 26, 27 были использованы в качестве агентов адресной доставки, которые показали высокий уровень трансфекции клеток NIH3T3 [36]. Важным преимуществом рецептор-опосредованных систем с использованием углеводных маркеров является их низкая иммунореактивность.
Продолжая исследования в этой области Kawakami и др. синтезированы производные холестерина: Л/-(3-/?-холестерилоксикарбонил)-(4-((1-имино-2-0-тиогалактозил)этил)амино)-бутилформамид (28Ь) и его этилформамидный и гексилформамидный аналоги 28а и 28с с целью получения положительно заряженных липосомальных агентов переноса ДНК, содержащих в своем составе остатки галактозы (схема 5) [37].
Данные соединения обладают бифункциональными свойствами, поскольку иминогруппа предназначена для связывания с плазмидной ДНК посредством электростатических взаимодействий, а галактозный остаток - для узнавания клеточной поверхности рецепторов гепатоцита. Гидрофильная природа остатков галактозы препятствует агрегации комплексов ДНК-катионная липосома. Так как, асиалогликопротеиновые рецепторы имеют лектиновую природу (узнают молекулу галактозы), замена асиалогликопротеина (лиганда) в составе конъюгата на молекулу галактозы не изменяет способности связывания конъюгата с рецептором.
Катионные производные полиаминов и аминокислот
Интерес к синтетическим носителям генетического материала, содержащим полиамины и аминокислоты появился давно. Для изучения стабильности катионных липосом in vivo было синтезировано производное (DAMC, 33) на основе дезоксихолевой кислоты, модифицированной хитозаном. Хитозан обладает способностью образовывать компактные структуры с ДНК и проявляет низкую токсичность. Имея катионный характер даже при нейтральных рН, он образует комплексы с отрицательно заряженной плазмидной ДНК, инициируя процесс трансфекции [47, 48].
Значение диаметра агрегатов, образуемых соединением 33, зависящее от молекулярной массы хитозана, которая составила 5, 25, 40 и 200 кДа изменялось от 130 до 300 нм. С увеличением молекулярной массы изменялась форма комплексов липосома-ДНК от цилиндрических до "спутанных" структур. Это можно объяснить тем, что молекулы (DAMC, 33) имеют жесткую протяженную цепь, обусловленную структурой хитозана (благодаря 1,4-уЗ-гликозидной связи). Было доказано, что в отсутствие сыворотки крови производное DAMC 40кДа было самым эффективным при преноса ДНК в COS-1 клетки, тогда как DAMC 5кДа показал наименьшую активность, возможно из-за низкой стабильности комплекса липосома-ДНК. В присутствии 80% сыворотки крови DAMC 200 «Да оказалось наиболее эффективным при трансфекции, так как это соединение способно образовывать высококонденсированные комплексы с ДНК [48,49].
Устойчивость геносом зависит от плотности положительного заряда на поверхности липосом, поэтому несомненный интерес представляют липиды, содержащие несколько катионных групп. Плотная упаковка ДНК в геносомах способствует эффективному транспорту ДНК в клетки с высокой степенью защиты от деградации под действием нуклеаз. Повышенная плотность положительного заряда, создаваемая многочисленными аминогруппами таких амфифилов, в значительной мере усиливает их электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженной клеточной мембраной.
Moradpour и др. синтезировали два новых полиаминолипида -холестерилспермидин (34) и холестерилспермин (36) (схема 6) [51-53]. Полиамины участвуют в структурной организации генома посредством связывания с ДНК с высоким сродством и нейтрализации отрицательного заряда [54-56]. Соединения 34 и 35 с устойчивой в биологических средах карбамоильной связью были получены взаимодействием полиаминов со стероидным остовом холестерина. В ходе опытов in vitro было обнаружено, что холестерилспермин (36) был наиболее эффективен в экспериментах по трансфекции СНО клеток (яичник китайского хомяка).
Эффективность трансфекции производных холестерина зависит как от количества положительных зарядов, так и от внутреннего соотношения зарядов распределенных вдоль полиаминовой цепи [57].
Последующие модификации катионных липидов, содержащих в качестве гидрофобной части остаток холестерина, были направлены на изменение природы положительно заряженной части молекулы. Синтезированные соединения 37а-е, отличающиеся полиаминовыми остатками исследовались при переносе ДНК как in vitro, так in vivo. Изменения в расположении метиленовых групп и в количестве атомов азота приводят к различному распределению зарядов в молекуле, которые влияют на способность липидов вызывать конформационные изменения ДНК. Было вычислено суммарное значение катионных зарядов при рН 7.4 с помощью уравнения Хендельсона-Хассельбаха, которое составило для соединения 37а — 2.3, 37Ь — 1.8, 37с — 1.6, 37d — 1.6, 37е — 2.3. Эффективность трансфекции была оценена на клетках СНО и уменьшалась в следующем порядке: 37a 37c 37b=37d 37e.
Рассматривая процесс высвобождения ДНК из комплекса, установлено, что определенные ионные молекулы находятся в высоких концентрациях в клетке (полипептиды, ДНК, спермин, гистоны или анионные липиды) и смещают ионное взаимодействие между плазмидной ДНК и катионной липосомой. Конденсация ДНК с производным, содержащим полиамины зависит от трех характерных свойств природных и синтетических полиаминов: 1) от суммы положительных зарядов, которые влияют на ионную силу; 2) от региохимического распределения этих зарядов, где рКа зависит от их взаиморасположения [57].
Дальнейшая модификация липидов, содержащих в качестве гидрофобного остатка холестерин, была направлена на изменение числа аминогрупп в положительно заряженной части молекулы. Таким образом, были синтезированы новые аналоги холестерина 38, 39 ко валентным связыванием соответствующего полиамина и холестерина [52, 58]. Результаты трансфекции показали, что активность липосом, сформированных на основе производного 39 была приблизительно в 100 раз выше активности DC-Chol/DOPE при in vivo доставке гена, кодирующего хлорамфениколацетилтрансферазу.
Катионный липид 39 (Transfectall, Apollon Inc.) используется без липида-хелпера, может длительное время храниться в замороженном состоянии. Кроме того, существует возможность образования его конъюгатов с соединениями, которые несли бы лиганды, специфичные к клеткам, лиганды эндосомального высвобождения и ядерной локализации, что могло бы облегчить развитие систем генетической доставки. Соединение (39), так называемой «Т-формы» оказалось активнее амфифила с «линейной» формой присоединения полиамина к гидрофобному домену.
Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты
Для структурно-функционального исследования катионных амфифилов синтезируется большое количество соединений, где модификации подвергается гидрофобный домен катионных липидов. Использование в качестве гидрофобного домена такого полифункционального соединения как дезоксихолевая кислота позволит получать катионные амфифилы, содержащие несколько положительно заряженных групп, что может оказать влияние на эффективность трансфекции, поскольку устойчивость геносом зависит от плотности положительного заряда на поверхности липосом.
С этой целью, нами синтезированы катионные производные дезоксихолевой кислоты, отличающиеся природой полярной группировки и способом присоединения ее к стероидной части молекулы (схема 8).
Из литературных данных известно, что увеличение липофильности молекулы желчных кислот посредством введения углеводородного остатка в стероидный остов молекулы способствует повышению стабильности образующихся геносом [67]. В качестве исходных соединений использовали метилдезоксихолат (26а) и октадецилдезоксихолат (26Ь), полученные этерификацией метилового или октадецилового спирта дезоксихолевой кислотой (25), что позволило изменить общую гидрофобность молекулы и обеспечило защиту карбоксильной группы.
При взаимодействии соединений 26а, b с 1,1 -карбонилдиимидазолом в среде дихлорметана в присутствии триэтиламина были получены производные дезоксихолевой кислоты 27а, b с выходами 97 и 93%, соответственно. В спектре ЯМР 1Н сдвиг сигнала протонов при С-3 и С-12 атомах дезоксихолевой кислоты в слабое поле указывает на протекание реакции по двум гидроксильным группам.
Далее взаимодействием соединений 27а, b с N.N-диметилэтилендиамином в среде дихлорметана получили третичные амины 28а, b с выходами 66 и 62%, соответственно. Следует отметить, что продолжительность реакции в случае производного 28Ь была в два раза больше, чем для 28а. Кватернизацией соединений 28а, b метилиодидом при нагревании получили катионные липиды 29а, b с выходами 88 и 70%, соответственно.
При анализе спектров ЯМР 1Н липидов 29а, b наблюдался сдвиг сигналов протонов метильных групп при атоме азота в слабое поле (S = 3.48 м.д. для 29а и 5 = 3.44 м.д. для 29Ь), что подтверждает катионныи характер синтезированных соединений (рис. 5).
Следует отметить, что способ синтеза с использованием 1,1 -карбонилдиимидазола и последующим взаимодействием с различными аминами может быть успешно применен для получения различных катионных липидов с карбамоильной связью.
Синтез катионных липидов 31а, Ь, содержащих в полярной головке NH3+-группу осуществлялся ацилированием исходных эфиров дезоксихолевой кислоты 26а, b /V-Вос-е-аминокапроновой кислотой, полученной ранее взаимодействием эквимолярных количеств кислоты и ди-трет-бутилоксипирокарбоната.
Ацилирование соединений 26а, b проводили двухкратным избытком кислоты в среде безводного пиридина в присутствии DCC и каталитического количества DMAP (схема 9).
После многократной хроматографической очистки выходы целевых продуктов 30а, b составили 64 и 67%, соответственно. В спектре ЯМР 1Н для соединений 30а, b присутствовали сигналы относящиеся к нововведенным элементам: синглет (S= 1.42 м.д.) для Bu -группы и мультиплет (S= 2.10 м.д.) для а-СН2СОО-группы остатков аминокапроновой кислоты (рис. 6).
Последующее удаление Вос-защитной группы осуществляли с помощью трифторуксусной кислоты в хлороформе. Для соединений 31а, b в спектре ЯМР 1Н отсутствовал сигнал Bu -группы при 1.42 м.д. при сохранении остальных, что свидетельствует о снятии Вос-защиты. Конечные продукты 31а, b были выделены после хроматографической очистки с выходами 74 и 90%, соответственно.
Для того, чтобы установить влияние природы катионной головки на эффективность трансфекции, наряду с соединениями, содержащими алифатические катионные головки, синтезирован липид 33, полярная головка которого представлена пиридином (схема 10).
В метилдезоксихолат 26а спейсерную группу вводили ацилированием последнего хлоран гидридом 5-бромвалериановой кислоты. Целевой продукт был выделен с выходом 81%. В спектре ЯМР 1Н обнаружен сдвиг протонов при атомах С-3 и С-12, что подтверждает протекание реакции ацилирования по двум реакционным центрам (рис. 7). Также обнаружены сигналы протонов с интегральной интенсивностью, соответствующей двум СНгВг-группам (S = 3.43 м.д.) и двум сс-СНгСОО-группам остатка 5-бромвалериановой кислоты (S= 2.35 М.Д.).
Кватернизацией пиридина бромидом 32 был получен катионный липид 33 с выходом 90%, структура которого была подтверждена данными ЯМР 1Н и масс-спектров.
Таким образом, синтезирован ряд поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевои кислоты, отличающихся природой полярной группировки (алифатического и гетероциклического ряда) и способом присоединения к гидрофобному домену (сложноэфирная и карбамоильная связь).
Синтез поликатионных амфифилов на основе дезоксихолевой кислоты
Метилдезоксихолат (26а). ....;... . К 0.50 г (1.3 ммоль) .дезоксихолевой кислоты (25) в 6 мл метанола прибавили 0.09 мл конц. H2SO4, и кипятили 3 ч. Реакционную массу нейтрализовали метанольным раствором КОН до рН 6. Упаривали, растворяли в хлороформе, промывали водой (2x15 мл), сушили Na2S04. Остаток хроматографировали на колонке, элюируя хлороформом. Выход 0.47 г (91%), Rf 0.68 (Д). ИК (v, см"1): 3300-3450, 2900, 1740, 1450, 1380, 1165. Спектр ЯМР 1Н (5, м.д., J/Гц): 0.65 (ЗН, с, 18-СН3), 0.86 (ЗН, с, 19-СН3), 0.90 (ЗН, д, J 6.9 Гц, 21-СН3), 0.99-1.89 (24Н, м, стероидные СН, СН2), 2.22 (1Н, ддд, J 6.8, 9.0, 15.4 Гц) и 2.35 (1Н, ддд, J 5.1, 9.8, 15.4 Гц, 23-СН2), 3.59 (1Н, м, 3-СН), 3.63 (ЗН, с, ОСН3), 3.92 (1Н, м, 12-СН). 0.70 г (1.8 ммоль) дезоксихолевой кислоты (25) сплавляли с 0.72 г (2.6 ммоль) октадеканола в присутствии 0.37 г (2.1 ммоль) л-толуолсульфокислоты 3 ч при 100С. Остаток хроматографировали на колонке, элюируя хлороформом. Выход 0.76 г (70%), Rf 0.77 (Б). ИК (v, см"1): 3300-3450, 2900, 1730, 1450, 1375, 1170. Спектр ЯМР 1Н (8, м.д., J/Гц): 0.65 (ЗН, с, 18-СН3), 0.84 (ЗН, т, J 6.8 Гц, (СН2)ібСН3), 0.87 (ЗН, с, 19-СН3), 0.90 (ЗН, д, J 6.7 Гц, 21-СН3), 1.05-1.89 (58Н, м, стероидные СН, СН2, СООСН2(СН2)16СН3), 2.25 (1Н, ддд, J 7.0, 9.3, 15.1 Гц) и 2.38 (1Н, ддд, J 5.2, 9.8, 15.1 Гц, 23-СН2), 3.62 (1Н, м, 3-СН), 3.98 (1Н, м, 12-СН), 4.06 (2Н, т, J 6.9 Гц, СООСН2). Раствор 0.30 г (0.7 ммоль) метилдезоксихолата (26а), 0.48 г (2.9 ммоль) 1,1 -карбонилдиимидазола, 0.2 мл триэтиламина в 2 мл дихлорметана перемешивали 5 ч при 40С, упаривали. Остаток растворяли в 2 мл хлороформа, промывали 3%-ной HCI (2x5 мл), водой, сушили Na2S04, хроматографировали на колонке, элюируя смесью хлороформ-метанол (30:1). Выход 0.43 г (97%), т. пл. 55-56С, Rf 0.56 (Б). ИК (v, см 1): 2850, 1730, 1640, 1580, 1460, 1380, 1230. Спектр ЯМР 1Н (8, м.д., J/Гц): 0.80 (ЗН, с, 18-СН3), 0.84 (ЗН, д, J 6.7 Гц, 21-СНз), 0.95 (ЗН, с, 19-СН3), 1.01-1.99 (26Н, м, стероидные СН, СН2), 2.22 (1Н, ддд, J 6.9, 9.0, 15.4 Гц) и 2.35 (1Н, ддд, J 5.3, 9.8, 15.4 Гц, 23-СН2), 3.63 (ЗН, с, ОСНз), 4.83 (1Н, м, 3-СН), 5.35 (1Н, м, 12-СН), 7.01-7.12 (2Н, м, lm), 7.32-7.46 (2Н, м, lm), 8.05-8.19 (1Н, м, lm). Раствор 0.30 г (0.5 ммоль) октадецилдезоксихолата (26Ь), 0.30 г (1.8 ммоль) 1,1 -карбонилдиимидазола, 0.19 мл триэтиламина в 2 мл дихлорметана перемешивали 3 ч при 40С, упаривали. Остаток растворяли в 15 мл хлороформа, промывали 3%-ной HCI (2x5 мл), водой, сушили Na2S04, хроматографировали на колонке, элюируя смесью хлороформ-метанол (30:1). Выход 0.36 г (93%), Rf 0.81 (В). ИК (v, см"1): 2900, 1730, 1640, 1580, 1460, 1385, 1230. Спектр ЯМР 1Н (8, м.д., J/Гц): 0.79 (ЗН, с, 18-СН3), 0.84 (ЗН, д, J 6.7 Гц, 21-СНз), 0.87 (ЗН, т, J 6.8 Гц, (СН2)ібСН3), 0.90 (ЗН, с, 19-СН3), 1.15-2.00 (58Н, м, СООСН2(СШібСНз, стероидные СН, СН2), 2.15 (1Н, ддд, J 7.3, 9.0, 15.4 Гц) и 2.27 (1Н, ддд, J 5.5, 9.8, 15.1 Гц, 23-СН2), 4.0 (2Н, т, J 6.9 Гц, СООСН2), 4.85 (1Н, м, 3-СН), 5.32 (1Н, м, 12-СН), 7.05-7.12 (2Н, м, lm), 7.32-7.47 (2Н, м, lm), 8.05-8.19 (1Н, м, lm). Смесь 0.40 г (0.7 ммоль) соединения (27а), 0.23 мл (2.0 ммоль) N,N- диметилэтилендиамина в 2.5 мл дихлорметана перемешивали 8 ч при 20С. К реакционной массе добавили б мл дихлорметана, промывали 5%-ным КОН (2x8 мл), сушили Na2S04, упаривали. Остаток хроматографировали на колонке, элюируя последовательно хлороформом, смесью хлороформ-метанол (30:1), (10:1), (5:1).
Выход 0.28 г (66%), Rf 0.28 (Д). Масс-спектр, т/т 634.9 [М+И]\ Спектр ЯМР 1Н (6, м.д., J/Гц): 0.65 (ЗН, с, 18-СН3), 0.84 (ЗН, д, J 6.7 Гц, 21-СН3), 0.88 (ЗН, с, 19-СНз), 0.92-1.99 (26Н, м, стероидные СН, СН2), 2.20 (6Н, с, N(CH3)2 ), 2.24 (6Н, с, N(CH3)2), 2.30-2.48 (6Н, м, 23-СН2, 2 СНгМ(СН3)2), 3.18-3.30 (4Н, м, 2 NHChb). 3.64 (ЗН, с, ОСН3), 4.55 (1Н, м, 3-СН), 4.92 (1Н, м, 12-СН), 5.05-5.20 (2Н, 2м, NH). ..... .;... 24-Гидроксиоктадецил-За,12а-бис(М,М-диметиламиноэтилкарбамоил)-5уЗ-холан (28Ь). Раствор 0.40 г (0.5 ммоль) имидазольного производного (27b), 0.2 мл Л/,Л/-диметилэтилендиамина в 3 мл дихлорметана перемешивали 24 ч при 20С. Реакционную массу растворяли в 15 мл дихлорметана, промывали 5%-ным КОН (2x8 мл), водой (2x15 мл), сушили Na2S04, упаривали. Остаток хроматографировали на колонке, элюируя последовательно смесью хлороформ-метанол (50:1), (25:1), (10:1). Выход 0.27 г (62%), 0.33 (Е). Масс-спектр, т/т 875.2 [М+И]\ Спектр ЯМР 1Н (8, м.д., J/Гц): 0.68 (ЗН, с, 18-СН3), 0.81-2.0 (67Н, м, 19-СН3, 21-СН3, СООСН2(СНг)ібСН3, стероидные СН, СН2), 2.07-2.38 (2Н, м, 23-СН2), 2.58 (12Н, с, 2 N(CH3)2), 2.75-2.88 (4Н, м, 2 CH2N(CH3)2), 3.40-3.52 (4Н, м, 2 NHChh), 4.05 (2Н, т, J 6.9 Гц, СООСН2), 4.6 (1Н, м, 3-СН), 4.95 (1Н, м, 12-СН), 5.85 (1Н, м) и 6.01 (1Н, м, 2 NH). К раствору 0.035 г (0.05 ммоль) третичного амина (28а) в 1 мл метилэтилкетона прибавили 0.08 мл (0.5 ммоль) метилиодида и переме шивали 8 ч при 60С, упаривали. Остаток хроматографировали на колонке, элюируя смесью хлороформ-метанол (10:1), (5:1). Выход 0.045 г (88%), [a]D20 +23.12 (с 0.8, хлороформ), Rf 0.23 (Е). Масс-спектр, m/z: 649.8 [M-CH3-2I]+. Спектр ЯМР 1Н (5, м.д., J/Гц): 0.69 (ЗН, с, 18-СН3), 0.81 (ЗН, д, J 6.7 Гц, 21-СН3), 0.88 (ЗН, с,19-СНз), 0.92-2.00 (24Н, м, стероидные СН, СН2), 2.10-2.35 (2Н, м, 23-СН2), 3.48 (18Н, с, 2 N+(CH3)3), 3.61 (ЗН, с, ОСН3), 3.68-3.90 (8Н, м, 2 NHCH2CH2N), 4.52 (1Н, м, 3-СН), 4.92 (1Н, м, 12-СН), 6.01 (1Н, м, NH), 6.70 (1Н, м, NH). К раствору 0.065 г (0.07 ммоль) третичного амина (28Ь) в 2 мл DMSO прибавили 0.12 мл метилиодида и перемешивали 9 ч при 70С.
К реакционной массе добавляли 15 мл хлороформа и промывали водой (2x15 мл), сушили Na2S04, упаривали. Остаток хроматографировали на колонке, элюируя смесью хлороформ-метанол (10:1), (5:1). Выход 0.06 г (70%), [a]D20 +27.16 (с. 1.0, хлороформ), Rf 0.32 (Е). Масс-спектр, m/z: 903.2 [M-2\f. Спектр ЯМР 1Н (8, м.д., J/Гц): 0.65 (ЗН, с, 18-СН3), 0.68 (ЗН, д, J 6.7 Гц, 21-СН3), 0.85 (ЗН, т, J 6.8 Гц, (СН2)16СНз), 0.89 (ЗН, с, 19-СН3), 0.92-1.95 (56Н, м, СООСН СНгЬСНэ, стероидные СН, СН2), 2.14-2.42 (2Н, м, 23-СН2), 3.44 (18Н, с, 2 N+(CH3)3), 3.65-3.89 (8Н, м, 2 CH2N(CH3)2, 2 ІЧНСШ. 4.01 (2Н, т, J 6.9 Гц, СООСН2), 4.54 (1Н, м, 3-СН), 4.92 (1Н, м, 12-СН), 6.09 (1Н, м, NH), 6.44 (1Н, м, NH).
