Содержание к диссертации
Введение
1. Взаимодействие ионов металлов с некоторыми ферментами фосфорного обмена 8
1.1. Киназы 8
1.1.1. Креатинкиназа 13
1.1.2. Аргининкиназа 17
1.1.3. Аденилаткиназа 20
1.1.4. Гексокиназа 24
1.1.5. Карбаматкиназа 26
1.1.6. З-Фосфоглицераткиназа 29
1.1.7. Пируваткиназа 31
1.2. Неорганическая пирофосфатаза пекарских дрожжей 35
2. Обсуждение результатов. Особенности функционирования неорганической пирофосфатазы из Е ; coli 47
2.1. Изучение субстратной специфичности неорганической пирофосфатазы из Е. coli 47
2.2. Определение числа активных центров неорганической пирофосфатазы ИЗЕ. coli 49
2.3. Изучение кинетики гидролиза пирофосфата магния неорганической пирофосфатазой из Е. coli 50
2.4. Изучение кинетики гидролиза пирофосфата хрома неорганической пирофосфатазой из ЕІ coli 56
2.5. Изучение взаимодействия неорганической пирофосфатазы из Е. coli с ионами двухвалентных металлов 61
2.5.1. Взаимодействие неорганической пирофосфатазы из. ЕІ coli с ионами магния 62
2.5.2. Взаимодействие неорганической пирофосфатазы из E, coli с катионами цинка 70
2.5.3. Взаимодействие неорганической пирофосфатазы из Е# coli с ионами кальпия 73
2.6. Ингибирование неорганической пирофосфатазы из Е# coli ионами фтора 82
2.7. Фосфорилирование неорганической пирофосфатазы из Е. coli ортофосфатом 84
2.8. Взаимодействие неорганической пирофосфатазы из Е# coli с имидодифосфатом и пирофосфатом хрома 89
2.9. Влияние имидодифосфата и пирофосфата на устойчивость неорганической пирофосфатазы из Е. coli к протеолизу субтилизином 93
2.10. Возможный механизм действия неорганической пирофос фатазы из Е'. coli 96
3. Экспериментальная часть 104
Приложение 118
Выводы 119
- Неорганическая пирофосфатаза пекарских дрожжей
- Изучение кинетики гидролиза пирофосфата хрома неорганической пирофосфатазой из ЕІ coli
- Ингибирование неорганической пирофосфатазы из Е# coli ионами фтора
- Возможный механизм действия неорганической пирофос фатазы из Е'. coli
Введение к работе
Объект настоящего исследования - неорганическая пирофосфа-таза иа Е. coli - впервые была выделена в чистом виде Д. Джос-сом с сотрудниками [i] . Фермент относится к классу глобулярных белков и обладает молекулярной массой 120000 [2].
В 5 М гуанидинхлориде пирофосфатаза диссоциирует на 6. субъединиц, определение частичных N- и С-концевых последовательностей которых показало их химическую идентичность [з]. Получение мономерной формы неорганической пирофосфатазы в неденатурирую-щих условиях продемонстрировало, что субъединица обладает каталитической активностью [4], а образование четвертичной структуры обеспечивает большую стабильность нативного фермента по сравнению с мономером [б].
Первичная структура фермента полностью пока не определена, однако в 1984 г. стала известна непрерывная аминокислотная последовательность с I по 86: остатки и структура еще двух пептидов (23-х и 9-ти членного), которые расположены в N-концевой части молекулы и в середине ее [б] .
0 строении активного центра и функциональной роли отдельных аминокислотных остатков имеется очень мало сведений. Показано, что субъединица фермента содержит два остатка цистеина, которые доступны сульфгидрильным реагентам - н-этилмалеимиду и п-оксимер-курбензоату - только после денатурации белка. Состояние сульфгид-рильных групп важно, по-видимому, для образования активного гек-самера и& субъединиц, полученных при обработке фермента 5 М гуа-нидинхлоридом [2,7]. Окисление сульфгидрильных групп или появление дисульфидной связи в субъединицах делает невозможной ренату-рацию и приводит к образованию неактивной структуры. Следует от-. метить, что нативный фермент не содержит остатков цистина. В ак тивный центр пирофосфатазы входит, вероятно, остаток лизина. Такое заключение было сделано на основании того, что реакция фермента с 2,4,6-тринитробензолсульфокислотой (ТНБС) сопровождается полной потерей ферментативной активности. Субстрат - неорганический пирофосфат - защищает его от ингибирующего воздействия ТНБС [в].
Субстратами фермента являются неорганические пиро-, триполи-и тетраполифосфаты [э], однако гидролиз Р±3 и Р±4 протекает на два порядка медленнее, чем РР±. Пирофосфатаза из Е. СОІІ не расщепляет нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфаты, глюкоао-6-фосфат, п-нитрофенилфосфат, циклические три- и тетраметафосфаты [і].
Фермент проявляет активность лишь в присутствии катионов двухвалентных металлов [і]. Активаторами служат ионы Mg , Мл. , О, Ол. zn и Со , причем максимальная активность присуща катионам магния. рН-Оптимум действия фермента равен 9,1 в присутствии Mg + и Мп2+ и 7,5 для zn2+ и Со2+.
Кинетика гидролиза пирофосфата в присутствии ионов магния впервые была изучена Джоссом [в], который предложил кинетическую схему реакции, согласно которой истинным субстратом является пирофосфат магния (MgPP , а свободный пирофосфат и Mg2PPiвыступают конкурентными ингибиторами гидролиза субстрата. По мнению автора, р. катионы Mg необходимы только для образования активного субстрата - MgPPi.
Полученные Джоссом экспериментальные данные были проанализированы Рапопортом с сотрудниками [10] . Авторы пришли к выводу, что ионы металла не только участвуют в образовании истинного субстрата, но и непосредственно взаимодействуют с ферментом, и продуктивный комплекс содержит два иона металла, один из которых связан с ферментом, а другой с пирофосфатом.
Неорганические пирофосфатазы широко распространены в природе и играют важную роль в метаболизме, которая заключается прежде всего в регуляции процессов биосинтеза, протекающих с образованием неорганического пирофосфата.
Наиболее изученным ферментом этого класса является неорганическая пирофосфатаза пекарских дрожжей, для которой установлена первичная структура [II] , сделан рентг єно структурный анализ с о разрешением в 3 А [12] , многое известно о путях регуляции активности катионами двухвалентных металлов [13,14] , строении активного центра и функциональной роли некоторых аминокислотных остатков [Ї5-20] . Кроме активного центра каждая субъединица неорганической пирофосфатазы дрожжей имеет регуляторный центр, способный присоединять полианионы, фосформироваться под действием ортофосфата и АТР, причем взаимодействие фермента с молекулой АТР по регуляторному центру активирует фермент [21-24].
Пирофосфатазы, выделенные из других источников, изучены хуже. Общей чертой этих ферментов является то, что они проявляют ферментативную активность только в присутствии катионов двухвалентных металлов [25-28] . Поэтому понимание механизма действия этого класса ферментов требует детального знания роли катионов металлов в превращении субстратов. Настоящая работа посвящена выявлению особенностей функционирования неорганической пирофосфатазы из Е. coli и, прежде всего, установлению путей регуляции активности этого фермента катионами двухвалентных металлов. Отдельная часть работы направлена на установление факта существования в этом ферменте регуляторного центра и его частичную харак-теризацию.
В обзоре литературы приведены данные о взаимодействии ионов металлов с рядом фосфотрансфераз. (киназ) и представителем класса гидролаз - неорганической пирофосфатазы из дрожжей. Все эти ферменты катализируют однотипную химическую реакцию и функционируют -только в присутствии катионов двухвалентных металлов, обнаруживая общие черты механизма действия.
Неорганическая пирофосфатаза пекарских дрожжей
Неорганическая пирофосфатаза, молекулярная масса которой составляет 64000, состоит из двух одинаковых субъединиц [124]. На основании данных рентгеноструктурного анализа с разрешением в З А предложена пространственная структура субъединицы неорганической пирофосфатазы дрожжей [125] , представленная на рис. 5. Фермент функционирует только в присутствии катионов двухвалентных металлов: %2+, zn2+, Со2+ или Мп2+ [126] . Истинным субстратом неорганической пирофосфатазы является бидентатный комплекс иона металла с пирофосфатом [І27-І29]. Как и в случае рассмотренных выше ферментов, образование такого комплекса существенно уменьшает отрицательные заряды атомов кислорода и увеличивает электрофильность атомов фосфора. Установлено, что в процессе катализа субстрат полностью ионизован [ІЗО], биден-татный комплекс М(Н20)4РР± гидролизуется в монодентатный комплекс МфоО Рі , который и освобождается с фермента [129]. Ион металла в составе этого комплекса контактирует также и с функциональными группами белка. Изучение связывания комплексов состава Сг(Н90)4_п(иНи)пРР± (где n = 0-4) с неорганической пирофосфатазой дрожжей продемонстрировало, что замещение молекул воды в координа- JSHa, ционной сферё фома на молекулы Ш3» образующие более слабые водородные связи, ухудшает сродство комплексов к ферменту. Так, комплекс пирофосфата хрома, содержащий четыре молекулы воды, присоединяется к ферменту в 7 раз прочнее, чем аналогичное соединение, содержащее четыре молекулы аммиака [ІЗІ] . Таким образом, в связывании субстрата важную роль играют водородные связи, образующиеся между молекулами воды, входящими в координационную сферу иона металла, связанного с пирофосфатом, и аминокислотными остатками, расположенными в активном центре фермента. Подобная координация субстрата была отмечена выше для креатинкиназы [60] . Установлено, что кроме РР неорганическая пирофосфатаза гид-ролизует нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфаты [132]. Использование в качестве субстрата неорганической пирофосфа-тазы дрожжей хирального комплекса [ft-I70,I80]ATP( s) и изучение продуктов ферментативного гидролиза PP. под действием [" OjHgO позволили заключить, что реакция, как и в случае фосфотрансфераз, протекает по sN2 механизму и в процессе ее не происходит образования фосфорилированного фермента [133]. Неорганический фосфат - продукт гидролазной реакции и субстрат синтетазной реакции - связывается в двух различающихся по своему сродству центрах фермента, константы диссоциации для которых составили Кх = 0,24 мМ (центр I) и Kg = 18 мМ (центр 2) [134].
Присоединение обоих фосфатов ингибируется аналогом пирофосфата РСНОНР, что указывает на их расположение в активном центре фермента. Заполнение фосфатом центра высокого сродства защищает ibg 77 от модификации фенилглиоксалем [135,136], то есть, можно предположить, что этот остаток расположен вблизи центра I и принимает участие в сорбции субстрата. Фосфат, являющийся центром нуклеофиль-ной атаки, освобождается первым после разрыва фосфоангидридной связи [137]. Скорее всего, это остаток, связанный более слабо, то есть координированный в центре 2. Для неорганической пирофосфатазы установлено, что для проявления ферментативной активности необходимо присоединение к ферменту еще двух ионов двухвалентных металлов. Из данных ферментативной кинетики вытекает, что для ионов магния сродство к двум центрам отличается примерно в 10 раз [138] и их запонение вызывает конформационные перестройки белковой молекулы. Так, заполнение ионами магния центра высокого сродства вызывает тушение флуоресценции [139] и оказывает защитное действие при денатурации фермента додецилсульфатом натрия [140], а насыщение катионами Mg центра низкого сродства приводит к появлению разностных УФ-спект-ров [127,141] и влияет на тепловую инактивацию [142]. Повышение рН и концентрации ионов % дает возможность обнаружить еще один центр связывания ионов магния, заполнение которого также меняет физико-химические характеристики белка, но не оказывает существенного влияния на его активность [із]. Другие катионы-активаторы (Zn2+, Mg2+ и Со2+) также взаимо- .И0Н01/ действуют с пирофосфатазой. Два места присоединения для всех ме-таллов-активаторов, по-видимому, совпадают. Этот вывод следует из того факта, что они конкурируют друг с другом при взаимодействии с пирофосфатазой [141] . Ионы цинка, марганца и кобальта также имеют третий центр связывания на ферменте, но, в отличие от катионов Mg2+, сродство ионов Zn2+, Мп2+ и Co2+ к этому центру велико и его заполнение приводит к ингибированию гидролазной активности пирофосфатазы [128,143]. Для локализации центров связывания катионов металла в молекуле неорганической пирофосфатазы, выяснения их взаимного расположения и оценки расстояний между центрами были использованы различные физико-химические методы.
При рентгенографическом исследовании было изучено производное пирофосфатазы, содержащее ураниль-ные катионы и02 . Последние конкурируют с ионами металлов-активаторов за центры связывания на ферменте [144], поэтому локализация мест их присоединения позволяет делать предположения о расположении ионов природного активатора. Каждая из двух субъединиц фермента содержит три иона уранила, образующих треугольник со сторонами от 6,5 до 9,5 А. Все центры связывания и02 (Mj, Шп и MQ) расположены в глубокой полости, образующей активный центр фермента [145]. Это следует из того факта, что аналог субстрата -СаРР. - связывается в том же участке молекулы белка, что и ионы уранила. Поскольку присоединение катионов металлов-активаторов изменяет пространственную структуру фермента, трудно утверждать, что центры связывания уранильных катионов и центры связывания ио- 2+ нов Mg совпадут. Действительно, в кристаллических комплексах фермента с ионами магния, полученных кристаллизацией белка в при- 2+ сутствии ионов Mg , был найден один центр связывания ионов металла в каждой субъединице (М4), который не совпадал ни с одним из центров связывания катионов уранила [146]. Анализ строения области активного центра показал наличие большого числа полярных аминокислотных остатков с явным преобладанием дикарбоновых аминокислот. В области активного центра собрано около четверти остатков аспарагиновой и глутаминовой кислот, что, по-видимому, и объясняет легкость присоединения положительно заряженных ионов. Часть карбоксильных групп расположена вблизи катионов металла и может непосредственно входить в их координационную сферу [146]. На основании этих данных была предложена схема расположения молекулы пирофосфата , ионов металлов и ряда аминокислотных остатков в области активного центра неорганической пи-рофосфатазы из дрожжей, которая приведена на рис. 6. Две части молекулы пирофосфата (Pj и Р2) попадают в различное окружение и поэтому имеют разное сродство к ферменту. Pg является центром нуклеофильной атаки. Положительный заряд на атоме фосфора увеличивается за счет поляризации фосфоангидридной связи под действием M-J-. Находящаяся рядом карбоксильная группа SIu 58, которая, возможно, является одним из потенциальных лигандов иона Mj, может служить акцептором протона воды, увеличивая ее нуклео-фильность. Геометрия активного центра не препятствует тому, чтобы Mj, наряду с GIu 58, принимал участие в активации молекулы воды. Расщепление фосфоангидридной связи сопровождается присоединением одного или двух протонов к остаткам Pj и Р2. Один из протонов поступает к Р2 вместе с гидроксильной группой. Донором протона для Pj может выступать Туг 191. По мнению авторов, центр связывания ионов металла М , который был определен при исследовании кристаллического комплекса пирофос-фатазы с ионами Mg , является центром наибольшего сродства. Его роль заключается в фиксировании двух фосфатов, появляющихся после гидролиза фосфоангидридной связи. В обратной реакции - синтеза пирофосфата - ион металла М4, связываясь с двумя фосфатами, снижает энтропийный барьер и способствует протеканию реакции Катион металла-активатора Mg привносится вместе с субстратом, а центр М2 заполняется при избытке ионов металла.
Изучение кинетики гидролиза пирофосфата хрома неорганической пирофосфатазой из ЕІ coli
Как было отмечено в обзоре литературы, бидентатный комплекс пирофосфата с трехвалентным хромом является субстратом неорганической пирофосфатазы из дрожжей [l30] . Так как Сг образует с пирофосфатом прочный бидентатный комплекс, в котором ионы хрома не обмениваются на катионы других металлов, изучение гидролиза этого субстрата открывает новые возможности в исследовании механизма действия пирофосфатаз и позволяет изучать роль в катализе только тех ионов металлов, которые непосредственно взаимодействуют с молекулой фермента. В настоящей работе установлено, что СгРР. является субстратом пирофосфатазы из Е. coli . Гидролиз этого комплекса идет в присутствии ионов % и zn , и высокие концентрации субстрата и катионов магния (до 1,5 мМ) не оказывают ингибирующего влияния на ферментативный гидролиз. В то же время увеличение концентрации ионов zn выше 30 мкМ приводит к уменьшению гидролазной активности (рис. II). Как будет показано ниже, факт ингибирования связан с существованием в ферменте из Е. coli , еще одного центра связывания катионов цинка, заполнение которого приводит к ингибирова-нию пирофосфатазной реакции. В связи с этим в последующих экспериментах концентрация ионов zn2+ не превышала 20 мкМ. Изучена кинетика ферментативного гидролиза пирофосфата хрома в присутствии ионов Mg при рН 7,5, так как при более высоких рЕ комплекс СгРР. неустойчив. Концентрацию ионов магния варьировали от 300 до 800 мкМ. Результаты этих исследований представлены на рис. 12 в координатах обратных величин. Линеаризация экспериментальных данных в указанных координатах свидетельствует о подчинении системы уравнению Михаэлиса-Ментен. Для определения числа ионов магния, участвующих в ферментативном акте, данные кинетических исследований были представлены в координатах Хилла. Коэффициент Хилла составил 1,6, что указывает на участие в ферментативном акте по крайней мере двух ионов металла. Для установления кинетической схемы гидролиза СгРР. были построены вторичные графики зависимости наклона прямых мэ ь/ V эф) и отрезков, отсекаемых на оси ординат (I/ Уэф), представай ленных на рис. 12, от величины обратной концентрацйишеталла-акти- Линейный характер зависимости мэфАЭф01Г кваДРата обратной концентрации активатора (рис. 136) указывает на относительно невысокое содержание комплексов ЕМ и EMSM no сравнению с количеством форм ЕМ2 и 213 т0 есть присоединение первого иона металла-активатора облегчает присоединение второго, так что К»/ і Кд". Кинетические параметры гидролиза СгРР. приведены в таблице I. Максимальная скорость гидролиза СгРР. в 82 раза ниже, чем скорость гидролиза М&РЕ при рН 7,5, а константа диссоциации соответствующего комплекса при этом увеличивается лишь в 3 раза.
Таким образом, СгРР. гидролизуется пирофосфатазой из Е. coli гораздо медленнее, чем MgPP.. Возможно, это связано с тем, что, как и для неорганической пирофосфатазы пекарских дрожжей, для фермента из Е. coli лимитирующей стадией реакции является уход продуктов гидролиза из активного центра белка р43]. Первым уходит фосфат, являющийся центром нуклеофильной атаки, а затем про- Линейный характер зависимости мэфАЭф01Г кваДРата обратной концентрации активатора (рис. 136) указывает на относительно невысокое содержание комплексов ЕМ и EMSM no сравнению с количеством форм ЕМ2 и 213 т0 есть присоединение первого иона металла-активатора облегчает присоединение второго, так что К»/ і Кд". Кинетические параметры гидролиза СгРР. приведены в таблице I. Максимальная скорость гидролиза СгРР. в 82 раза ниже, чем скорость гидролиза М&РЕ при рН 7,5, а константа диссоциации соответствующего комплекса при этом увеличивается лишь в 3 раза. Таким образом, СгРР. гидролизуется пирофосфатазой из Е. coli гораздо медленнее, чем MgPP.. Возможно, это связано с тем, что, как и для неорганической пирофосфатазы пекарских дрожжей, для фермента из Е. coli лимитирующей стадией реакции является уход продуктов гидролиза из активного центра белка р43]. Первым уходит фосфат, являющийся центром нуклеофильной атаки, а затем про- исходит отщепление второго остатка. В случае же CrPPi после разрыва фосфоангидридной связи оба фосфата остаются связанными с ионом хрома и уходят с фермента в виде комплекса Cr(Pi)2. По-видимому, скорость отщепления этого комплекса с фермента намного ниже, чем продуктов гидролиза МвРР±. Можно также предположить, что отличия, существующие в пространственной структуре СгРР± и MgPP±, препятствуют связыванию пирофосфата хрома в активном центре фермента в отсутствие катионов металла-активатора, и только добавление последних к неорганической пирофосфатазе приводит к перестройке области активного центра и делает возможным связывание CrPP.. Как будет показано ниже, фермент из Е. coli имеет регуляторный центр, с которым при рН 7,8-7,8 может связываться пирофосфат хрома. Эти результаты требуют осторожности при интерпретации кинетических данных, полученных при изучении гидролиза пирофосфата хрома. Однако использование этого субстрата оказалось полезным при изучении механизма действия фермента из Е. coli. 2.5.
Изучение взаимодействия неорганической пирофосфатазы из Е. coli с ионами двухвалентных металлов Приведенные выше данные по кинетике ферментативного гидролиза РР± и СгРР± в присутствии ионов Mg свидетельствуют о том, что в образовании активного комплекса принимают участие несколько, катионов магния , это потребовало изучения связывания ионов двухвалентных металлов с ферментом в отсутствие субстрата. Непосредственное взаимодействие пирофосфатазы с катионами металлов доказано с помощью методов дифференциальной УФ-спектроскопии, равновесного диализа и протеолиза субтилизином. Взаимодействие неорганической пирофосфатазы из Е. coli с ионами магния Добавление ионов магния к неорганической пирофосфатаае из Е. coli при рН 7,5 и 9,1 вызывает появление разностных УФ-спек-тров (рис. 14, 15). Из рисунков видно, что дифференциальные УФ-спектры, полученные для обоих значений рН, похожи и характеризуются наличием отрицательного максимума при 270-280 нм, что соответствует изменению окружения остатков тирозина и триптофана и объясняется переходом белковых хромофоров в более полярное окружение 70] . В таблице 2 представлены характеристики спектральных изменений, возникающих прирвязывании фермента с ионами металлов при различных рН. Из таблицы следует, что сродство второго центра к ионам Mg со снижением рН уменьшается более чем в три раза?и это может быть связано с тем, что в координационную сферу иона магния входит остаток лизина. Аналогичное предположение было высказано для фермента из дрожжей [і44] . Для характеристики взаимодействия неорганической пирофосфатазы Е. coli с катионами магния использовали также метод протео-лиза фермента субтилизином. Для этого белок инкубировали с субти-лизином в присутствии различных концентраций ионов магния и определяли ферментативную активность через определенные промежутки времени. Под действием протеолитического фермента происходит быстрая деструкция неорганической пирофосфатазы Е. coli , следствием чего является уменьшение ее каталитической активности. В каждом случае определяли константу скорости инактивации; полученные результаты представлены на рис. 17а. Увеличение концентрации ионов магния вплоть до 1,5 мМ не сказывается на инактивации пирофосфатазы под действием субтилизина, дальнейший же рост концентрации ведет к существенной защите фермента от протеолиза. Однако полученная зависимость носит сигмоидный характер, что свидетельствует об участии в этом процессе более одного иона металла. Для определения числа катионов Mg , участвующих в защите пирофосфатазы от действия субтилизина, полученные данные были перестроены в координатах Хилла. Коэффициент Хилла, определяемый как тангенс угла наклона полученной прямой, составил 1,4, что указывает на участие в защите от протеолиза по крайней мере двух ионов магния.
Ингибирование неорганической пирофосфатазы из Е# coli ионами фтора
Ионы фтора являются ингибитором ряда пирофосфатаз, в том числе и фермента из Е. coli [9,26,160,175,176 . В данной работе установлено, что ингибирование пирофосфатазы Е. coli фторидом в присутствии ионов Mg и пирофосфата носит обратимый характер и фермент полностью восстанавливает свою активность при удалении избытка реагентов. Для установления механизма ингибирования была изучена зависимость скорости гидролиза от концентрации пирофосфата магния для нескольких фиксированных концентраций фторид-иона. Полученные результаты представлены на рис. 25а в координатах Лайнуивера-Берка. Семейство параллельных прямых указывает на бесконкурентный тип ингибирования, то есть фторид-ион присоединяется только к фермент-субстратному комплексу [177]. Для определения константы ингибирования данные из рис. 25а были перестроены в координатах Диксона (рис. 256). Константа ингибирования составила (9±I).I0 5 М. Детально механизм ингибирования фторидом изучен только для неорганической пирофосфатазы пекарских дрожжей. Фторид-ион инги-бирует этот фермент в процессе ферментативной реакции, когда в реакционной среде присутствуют пирофосфат и ионы Mg . На первой стадии ингибитор быстро и обратимо присоединяется к катиону магния на ферменте, вызывая уменьшение каталитической активности в 10 раз, после чего происходит медленная изомеризация фермент-субстратного комплекса, приводящая к полной потере активности. Пиро-фосфатаза из дрожжей остается неактивной после удаления избытка реагентов [I78J . По-видимому, для неорганической пирофосфатазы из Е. coli либо не наблюдается изомеризации фермент-субстратного комплекса в неактивное соединение под действием фторида, либо Была исследована также рН-зависимость ингибирования неорганической пирофосфатазы Е. coli ионами фтора, которая представлена на рис-. 26.
Установлено, что рН-зависимость ингибирования фторидом фермента из Е. coli имеет колоколообразный характер и наибольшее ингибирование наблюдается при рН 8,0. В то же время для неорганической пирофосфатазы из дрожжей показано, что со снижением рН наблюдается увеличение скорости ингибирования [Ї75]. 2.7. Фосфорилирование неорганической пирофосфатазы из Е. coli ортофосфатом Для неорганической пирофосфатазы пекарских дрожжей характерна необычная с химической точки зрения реакция - фосфорилирование карбоксильной группы фермента фосфатом с образованием ацилфосфата [17]. Существенной особенностью фосфорилирования является то, что фосфат связывается лишь с одной из двух субъединиц, при этом центр фосфорилирования не совпадает с активным центром [23,24]. Реакция фосфорилирования пирофосфатазы дрожжей АТР приводит к активации гидролиза пирофосфата магния, а обратная реакция синтеза пирофос-фата требует в присутствии АТР более высоких концентраций Р± [22] , и, таким образом, имеет место регуляция активности пирофосфатазы дрожжей при заполнении специфического некаталитического центра. Химическая модификация центра фосфорилирования, существенно не влияя на гидролитическую функцию пирофосфатазы, нарушает взаимодействие между субъединицами [l70]. В данной работе предстояло выяснить, существует ли подобный центр и в неорганической пирофосфатазе из Е. coli . С этой целью было изучено взаимодействие фермента с ортофосфатом. Фермент инкубировали с [ PJ -Р± в виде тетраметиламмониевой соли в присутствии ионов магния или кальция и быстро удаляли избыток реагентов гель-фильтрацией с центрифугированием по методу Пенефского [179]. При этом часть метки оставалась присоединенной к ферменту в виде фосфата. Идентификацию меченого остатка проводили после снятия метки хлорной кислотой с помощью ионообменной хроматографии на Дауэксе 1x4 в С1 -форме. При этом вся радиоактивность выходила в виде ор-тофосфата (рис. 27). Количество связавшегося с белком фосфата зависит от концентрации последнего в среде, а также от природы и концентрации катиона металла. О специфичности реакции пирофосфатазы с фосфатом свидетельствует тот факт, что максимальное включение Р± в фермент, состоящий из шести одинаковых субъединиц, составляет три моля, и эта величина не изменяется с дальнейшим ростом концентрации лиган-да. На рис. 28 представлена зависимость включения фосфата в фермент от его концентрации в инкубационной среде в присутствии ионов Однако процесс дефосфорилирования существенно ускоряется в присутствии пирофосфата и в кислой среде.
Таким образом, как и в случае пирофосфатазы из дрожжей, фермент из Е. coli взаимодействует с фосфатом с образованием фосфорилированного белка. Ряд общих закономерностей, выявленных при этом (характер зависимости фосфорилирования фермента от концентрации фосфата и катионов двухвалентных металлов, включение в фермент, состоящий из шести одинаковых субъединиц, трех молей фосфата, кислотолабильность образующейся связи) позволяет предположить одинаковый характер взаимодействия пирофосфатаз из дрожжей и Е. coli с фосфатом и существование в ферменте из Е. coli специфического некаталитического центра, присоединяющего фосфат. Результаты, полученные при изучении взаимодействия неорганической пирофосфатазы из Е. coli с имидо-дифосфатом и пирофосфатом хрома, подтверждают это предположение. 2.8. Взаимодействие неорганической пирофосфатазы из Е. coli с имидодифосфатом и пирофосфатом хрома В настоящей работе было установлено, что имидодифосфат - не-гидролизуемый аналог пирофосфата - в зависимости от рН по-разному влияет на активность пирофосфатазы из Е. coli . При рН 9,1 были изучены зависимости начальной скорости гидролиза субстрата от его концентрации при фиксированной концентрации свободной формы ионов магния, равной 0,8 мМ, ив присутствии различных концентраций имидодифосфата (8,9-59,5 мкМ). На рис. 30а приведены полученные результаты в координатах Лайнуивера-Берка. Установлено, что при рЕ 9,1 PNP влияет на активность неорганической пирофосфатазы из Е. coli по типу конкурентного ингибирования, что указывает на его связывание в активном центре фермента. На основании полученных данных была рассчитана константа ингибирования (рис. 306), которая составила 26±2 мкМ. Однако при рН 6,5 воздействие PNP на неорганическую пирофос-фатазу из Е. coli коренным образом меняется. Изучение влияния различных концентраций PNP на скорость гидролиза MgPP± при фиксированной концентрации ионов Mg2+, равной I мМ, показало, что имидодифосфат активирует неорганическую пирофосфатазу из Е. coli по неконкурентному типу (рис. 31а). Кинетическая схема неконкурентной активации выглядит следующим образом:
Возможный механизм действия неорганической пирофос фатазы из Е'. coli
Сравнение полученных результатов для неорганической пирофосфатазы из Е. coli с данными для фермента из дрожжей свидетельствует о наличии общих закономерностей в функционировании этих ферментов. В обоих случаях каталитически активен комплекс EMg?PPMg; истинным субстратом является MgPP±; оба фермента имеют по три центра связывания ионов Mg2+ и zn. на субъединицу, при этом насыщение двух из них ионами металла приводит к активации гидролиза субстрата. Кроме этого, ионы кальция и фтора оказывают сильное ингибирующее действие на обе пирофосфатазы, причем ионы фтора присоединяются к фермент-субстратному комплексу. Для фермента из Е. coli , как и для неорганической пирофосфатазы из дрожжей, показано существование регуляторного центра, связывание в котором СгРР± и MgPKP приводит к активации неорганической пирофосфатазы из Е. соіі. Все это указывает на общность механизма действия ферментов из дрожжей И Е. соіі. Это заключение подтверждается анализом данных по аминокислотной последовательности неорганической пирофосфатазы из Е. СОІІ, любезно предоставленных д-ром Хайнриксоном с сотрудниками [б] и приведенных в таблице 9. В настоящее время известна непрерывная последовательность с I по 86 аминокислотные остатки и структура еще двух пептидов (23-х и 9-ти членных). При сравнении структур неорганических пирофосфатаз из дрожжей и Е. СОІІ автор обнаружил, что наилучшее совпадение последовательностей наблюдается, если провести совмещение так, как показано в таблице 9. Обращает на себя внимание тот факт, что большинству аминокислотных остатков, входящих в область активного центра фермента из дрожжей, соответствуют в первичной структуре те же или гомологичные аминокислоты (см. табл. 10). Следует также отметить наличие парных замен: Thr 60 в ферменте из дрожжей соответствует Asp 33 в пирофосфатазе из Е. coli , a Asp 114 - Thr 74. Таблица 10 Аминокислотные остатки, входящие в активный центр неорганической пирофосфатазы из дрожжей, и соответствующие им остатки аминокислот фермента из Е. coli РР±-аза дрожжей: Glu48, Lys56, 01u58, ТІїгбО, Glu70, Arg77, Tyr88, РР±-азаЕ. coli: Glu20, Lys29, Glu31, Asp33, - Arg42, Tyr50, РР±-аза дрожжей: Tyr92, GlulOO, Aspll4, Asnll5, Asnll6, Aspll9, РР±-азаЕ. coli: Tyr54, - Thr74, Pro75, Tyr76, Glu79, Субъединицы ферментов из дрожжей и Е. coli существенно отличаются по своим размерам - 285 и 179 аминокислотных остатков соответственно.
Однако пропуски в аминокислотной последовательности неорганической пирофосфатазы из Е. coli располагаются на периферии молекулы и не касаются области активного центра. Сопоставление аминокислотных последовательностей обоих ферментов также показывает, что в тех участках первичной структуры фермента из Е. coli , которые соответствуют участкам полипептидной цепи пирофосфатазы из дрожжей, вовлеченным в образование -структур, замены, как правило, являются консервативными и не нарушают f -структуры. Хотя нет еще данных об аминокислотной последовательности С-концевой области неорганической пирофосфатазы из Е. coli , можно попытаться предсказать третичную структуру этого фермента. Она изображена на рис. 34. В основу ее положена структура пирофосфатазы из дрожжей [125] , пунктиром отмечены пропуски в аминокислотной последовательности, которые предполагают сближение соответствующих элементов структуры. Поскольку строение активных центров неорганических пирофос-фатаз из Е. coli и дрожжей сходно, можно думать, что и механизм ферментативного гидролиза РР± для ферментов из дрожжей и Е. coli также очень близок. На рис. 35 представлена предполагаемая модель переходного состояния пирофосфата в активном центре неорганической пирофосфатазы из Е. coli , построенная с учетом расстояний между ионами металлов, определенных для неорганической пирофосфатазы из дрожжей. Здесь Мд, Mg и MQ - катионы металлов, занимающие центры А, В и С. Заполнение центров А и В происходит и в отсутствие субстрата и приводит к активации неорганической пирофосфатазы (центр С -место связывания катиона металла, привносимого с субстратом). На рис. 35 рядом с каждым центром перечислены аминокислотные остатки - предполагаемые белковые лиганды ионов металлов. В активном центре фермента превращается депротонированный бидентатный комплекс РР± с ионом металла. Привносимый с субстратом катион металла занимает центр С. Этот ион металла, как отмечалось выше, существенно уменьшает отрицательный заряд атомов кислорода и увеличивает электрофильность атомов фосфора. В сорбции субстрата принимают участие, с одной стороны, молекулы воды, входящие в координационную сферу MV, и образующие водородные связи с функциональными группами активного центра. С другой стороны, субстрат взаимодействует с ионами металлов в центрах А и В. Ион металла, занимающий центр В, непосредственно взаимодействует с левой частью молекулы субстрата, а катион металла в центре А координирован с правой частью пирофосфата. Кроме этого в сорбции субстрата принимает участие гуанидиновая группа аргинина, которая взаимодействует с левой частью молекулы субстрата.
Катион металла Mg помимо связывания субстрата, по-видимому, принимает участие в активации аминокислотного остатка, являющегося донором протона для отщепляющейся фосфатной группы. Основная роль иона металла в центре А связана с генерацией сильного нукле-офила, которым является молекула воды, входящая в его координационную сферу. Превращение субстрата в продукты реакции начинается с атаки активированной катионом металла Мд молекулы воды, расположенной в апикальном положении к уходящей группе. Появление двух остатков фосфата - более слабой кислоты по сравнению с пирофосфатом - требует связывания по крайней мере двух протонов. Протон для правой части субстрата привносится с атакующей молекулой воды. Левая часть связывает протон, переходящий, вероятно, от одного из ли-гандов иона металла в центре В (например, тирозина). Этот протон, скорее всего, присоединяется к мостиковому атому кислорода. Про-тонирование атома кислорода должно увеличивать ? + на соседних атомах фосфора, что способствует нуклеофильной атаке молекулой воды. Следует отметить, что превращение пирофосфата в фосфат в процессе ферментативного гидролиза должно привести и к ослаблению связи с ионами металла, поскольку фосфат с магнием образует значительно менее прочные комплексы, нежели пирофосфат. Несомненно, что роль ионов металла и функциональных групп белка велика и в стабилизации переходного состояния субстрата на пути превращения в продукты реакции - тригональной бипирамиды, в центре которой находится атом фосфора правой части, а в вершинах лежат мостиковый атом кислорода и атакующая молекула воды. При этом появляется дополнительный отрицательный заряд у кислородных атомов, находящихся в экваториальном положении, который стабилизируется либо путем образования водородной связи с молекулой воды, входящей в координационную сферу иона металла в центре В, либо взаимодействием с лизиновой группой белка. Доказательство предложенной схемы требует установления полной аминокислотной последовательности неорганической пирофосфата-зы из Е. coli , рентгеноструктурного анализа молекулы фермента и ее комплексов с субстратами, а также идентификации и локализации аминокислотных остатков, входящих в активный центр неорганической пирофосфатазы из Е. coli. Неорганическую пирофосфатазу выделяли иа штамма МНЕ -600 подетоду Джосса [i] . Выделенный фермент имел 98%-ную чистоту по данным электрофореза в полиакриламидном геле и обладал удельной активностью 600-650 Е/мг при 25. Фермент хранили в виде суспензии в растворе сульфата аммония (90% насыщения) с I мМ Na PgOrj, при температуре -10. Перед употреблением фермент осаждали центрифугированием и отделяли избыток сульфата аммония и пирофосфата гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 тонкий.
