Введение к работе
Актуальность проблемы. Синтетические фрагменты нуклеиновых кислот (НК), содержащие модифицированные звенья с группировками различной химической природы, широко применяются для изучения закономерностей НК-НК и НК-белкового узнавания, структурной топографии активных центров белков и сложных рибонуклеопротсидных комплексов, таких как рибосома, в антисмысловой биотехнологии, а также для создания на их основе диагностических систем и потенциальных терапевтических препаратов с улучшенными фармакокипетическими и фармакодинамическими свойствами. Особый интерес среди аналогов НК вызывают их производные, содержащие активные группировки, способные к образованию ковалентиых связей с реакционноспособными группами биополимеров. Разработка методов направленного введения таких группировок в НК является актуальным направлением исследований в современной биоорганической химии.
Одним из основных требований при конструировании и применении аналогов НК, содержащих активные группировки, является минимальное искажение структуры НК и их комплексов с белками и нуклеиновыми кислотами в процессе взаимодействия. Весьма удобным вариантом модификации олигонуклеотидов является модификация гетероциклических оснований. Активная группировка, присоединенная к гетероциклическому основанию посредством линкера, может быть пространственно приближенной к комплементарной цепи ПК-мишени или определенному центру в белке и, в силу этого, может оказывать четко локализованное воздействие. Химические методы синтеза олигонуклеотидов, модифицированных по гетероциклическому основанию, позволяют регламентировать количество введенных модифицированных нуклеозидов, их тип и расположение в цепи.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлась разработка метода синтеза олигорибонуклеотидов с алифатическими аминолинкерами в гетероциклических основаниях и создание на их основе новых фотоактивирусмых реагентов для аффинной модификации биополимеров. В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:
разработать методы синтеза модифицированных рибонуклеозид-З'-Н-фосфонатов, содержащих в гетероциклических основаниях функциональные группы-предшественники;
разработать метод твердофазного Н-фосфонатного синтеза олигорибонуклеотидов-предшественников;
разработать метод получения олигорибонуклеотидов с алифатическими аминолинкерами в гетероциклических основаниях, исходя из олигомеров-предшественников;
синтезировать фотоактивируемые производные олигорибонуклеотидов, содержащих 4-азидотетрафторбепзамидную группировку в гетсроцикле, и изучить свойства полученных конъюгатов.
Научная новизна и практическая ценность работы. С использованием впервые синтезированных модифицированных рибонуклеозид-З'-Н-фосфонатов, содержащих атом брома или 4-хлорфенильную группировку в гетероциклическом основании, получены олигорибопуклеотиды-предшественники, содержащие эти функциональные группы. Разработан метод получения на их основе олигорибонуклеотидов с алифатическими аминолинкерами в гетероциклических основаниях уридина, аденозина и цитидина. Впервые
1 (
получены производные олигорибонуклеотидов с 4-азидотстрафторбензамидной группировкой в С5-ПОЛОЖЄНИИ уридина, С8-положении аденозипа и Ш-положепии цитидина, являющиеся перспективными фотоактивируемыми реагентами для изучения РНК-РНК и РНК-белковых взаимодействий. Проведено сравнительное исследование термической стабильности дуплексов новых конъюгатов с ДНК и РНК и их способности к комплементарно-адресованной фотомодификации модельных РНК- и ДНК-мишеней. Показано, что введение аминолинкеров различной длины в гетероциклические основания рибонук-леозидов, расположенных внутри цепи, практически не влияет на Т„л дуплексов, в то время как функционализация концевых рибонуклеозидов приводит к некоторой дестабилизации дуплекса. Введение 4-азидотетрафторбензамидной группы в С5-, С8- и N4-положения рибонуклеозидов понижает Тпл дуплексов. Показано, что степень фотомодификации РНК и ДНК зависит от длины линкера и расположения модифицированного нуклеотида в цепи. Определена позиционная направленность модификации ДНК и показано, что основным сайтом модификации, приводящей к образованию ковалентных ад-дуктов, является остаток гуанина, расположенный рядом с фотоактивной группой и находящийся в дуплексе. Ряд синтезированных фотоактивируемых аналогов мРНК был успешно использован для определения нуклеотидов рРНК и рибосомных белков, формирующих мРНК-связывающий центр рибосом человека (Карпова Г.Г. с соавт., 2000-2008 г.г.).
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Результаты работы были представлены на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, Россия, 1998г), па XV международном круглом столе «Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids» (Левсн, Бельгия, 2002г), на ІІІ-ем съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2002г), на международной конференции «Targeting RNA: artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference» (Новосибирск, Россия, 2003г), на международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию академика Д.Г.Кнорре (Новосибирск, Россия, 2006г) и др.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена па 149 страницах, содержит 15 рисунков, 10 схем и 13 таблиц. Библиография включает 327 литературных источников.
