Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение О-гликозидгидролаз (ЕС 3.2.1.-), ферментов, катализирующих гидролитическое расщепление О-гликозидной связи в углеводах и углеводсодержащих биополимерах, является актуальной задачей.
Эти ферменты наиболее востребованы современной биотехнологией и широко используются для нужд пищевой, фармакологической, легкой промышленности и других областей. Они являются ключевыми ферментами углеводного обмена как в высших организмах, так и в микроорганизмах, поэтому знания об их свойствах, структуре и механизме действия необходимы для понимания многих процессов, происходящих в клетке. Кроме того, индивидуальные гликозидгидролазы с установленной субстратной специфичностью являются точными инструментами структурного анализа соответствующих природных полисахаридов и углеводсодержащих биополимеров.
Большой научный и практический интерес О-гликозидгидролазы представляют при исследовании и модификации антигенной структуры различных биологических объектов. Частным случаем энзиматической модификации антигенов является направленное изменение групповой специфичности эритроцитов крови человека групп А и В в эритроциты группы O, которое нашло применение в биотехнологии создания "универсальной крови" из крови доноров разной групповой принадлежности. Для конверсии эритроцитов необходимы специфические экзо- гликозидазы, способные при нейтральных значениях рН и физиологических температурах эффективно катализировать удаление терминальных а-1,3-связанных иммунодоминантных остатков N-ацетилгалактозамина и галактозы, которые определяют групповую специфичность А- и В-эритроцитов соответственно. На сегодняшний день имеются сведения о двух таких ферментах из клинических бактериальных патогенов. Сообщения о подобных ферментах из морских бактерий в литературе отсутствуют.
Фукоиданы — семейство как гомо- и гетерополисахаридов, основная цепь которых построена из остатков сульфатированной L-фукозы, связаных преимущественно а-1,3- и/или а-1,4-О-гликозидными связями, так и полисахаридов с высоким содержанием глюкуроновой кислоты и низким содержанием фукозы и сульфатов. Остатки галактозы, маннозы, ксилозы, рамнозы также найдены в различных фукоиданах. Фукоиданы обнаружены только в морских организмах. Высоким содержанием этих полисахаридов отличаются бурые водоросли. Подобные полисахариды также выделены из экстрацеллюлярного матрикса тела кукумарии и обнаружены на поверхности оболочки яйцеклеток у различных видов морских ежей.
Фукоиданы проявляют широкий спектр биологического действия на различные системы организма млекопитающих. Известны их антикоагулянтная, антиангиогенная, антивирусная, антиопухолевая, антиоксидантная и другие виды активностей, т.о. они имеют значительный потенциал как терапевтические агенты. В настоящее время возрастает интерес к фукоиданам, как к основе для создания эффективных медицинских препаратов нового поколения. В связи с этим, важной проблемой является определение тонкой химической структуры этих биополимеров для корреляции с их биологической активностью.
Большие надежды в процессе изучения структуры фукоиданов возлагают на метод селективной деградации этих полисахаридов с помощью ферментов — фукоиданаз. Ферментативное расщепление этих полисахаридов также необходимо для трансформации их с целью получения новых соединений, проявляющих биологические свойства.
Фукоиданазы — гликозидгидролазы, катализирующие гидролиз О-гликозидных связей основной цепи фукоиданов, остаются наименее изученным семейством
О-гликозидгидролаз. С невысоким уровнем активности они обнаружены только у обитателей морской среды. Несмотря на многолетние усилия ряда исследовательских коллективов, в настоящее время нет коммерческого препарата данного фермента с охарактеризованными свойствами и субстратной специфичностью.
В качестве источников а-галактозидазы, a-N-ацетилгалактозаминидазы и фукоиданазы наибольший интерес представляют морские бактерии. Бактерии играют ключевую роль в метаболических процессах морских экосистем. Быстрый ответ микроорганизмов на экологические изменения, их важные функции в экосистемах обеспечиваются разнообразными ферментными системами. Гетеротрофные аэробные облигатно морские бактерии привлекают все большее внимание как источники ферментов с оригинальными свойствами и специфичностью, так как они легко культивируются, обладают высокой скоростью размножения и позволяют осуществлять биосинтез веществ в контролируемых условиях. Кроме того, генетический материал уникальных бактерий можно использовать для создания суперпродуцентов рекомбинантных ферментов на основе легко культивируемых известных технологичных штаммов.
Современное развитие генетической инженерии и морской аквакультуры позволяет рассчитывать на создание новых биотехнологических процессов, альтернативных экологически деструктивной крупномасштабной добыче морской биомассы для получения ферментов.
Целью исследования являлось изучение О-гликозидгидролаз из истинно морских гетеротрофных бактерий, имеющих биотехнологический потенциал: a-N-ацетилгалактозаминидаз и а-галактозидаз, пригодных для получения "универсальной крови", а также фукоиданаз, участвующих в биодеградации биологически активных полисахаридов бурых водорослей — фукоиданов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
исследовать особенности распространения a-N-ацетилгалактозаминидаз и а-галактозидаз среди морских бактерий, собранных в различных акваториях Мирового океана;
провести поиск a-N-ацетилгалактозаминидаз и a-галактозидаз, удаляющих иммуннодоминантные моносахариды от углеводных составляющих антигенов эритроцитов крови человека при нейтральных значениях рН,
из перспективных источников выделить a-N-ацетилгалактозаминидазу и а-галактозидазу в гомогенном состоянии, охарактеризовать их основные биохимические свойства и субстратную специфичность;
изучить действие a-N-ацетилгалактозаминидазы и a-галактозидазы на эритроциты крови человека группы А и В, а также действие a-галактозидазы на клетки буккального эпителия и патогенной бактерии Corynebacterium diphtheriae;
установить первичную структуру, пространственную организацию, механизм действия a-галактозидазы и её принадлежность к определённому семейству гликозидгидролаз;
провести поиск ингибиторов a-галактозидазы среди морских природных соединений, а также их синтетических производных;
выполнить иммобилизацию a-галактозидазы в полисахаридсодержащих нанокомпозитных материалах;
получить высокоочищенный образец фукоидана, охарактеризовать элементы его структуры и обусловленные ими биологические свойства;
провести поиск фукоиданаз среди бактерий-эпифитов и ассоциантов морских животных Охотского и Японского морей, исследовать особенности их
распространения среди Y-протеобактерий и бактероидов, используя высокоочищенный субстрат;
изучить особенности деградации фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides под действием ферментов из морских бактерий, принадлежащих к различным таксонам и культивируемых на различных по составу питательных средах;
определить области практического применения ферментов.
На защиту выносятся следующие положения:
-
-
Облигатно морские бактерии, обитающие в Охотском и Японском морях, являются перспективными источниками a-N-ацетилгалактозаминидаз, a-галактозидаз и фукоиданаз.
-
a-N-ацетилгалактозаминидаза из морской бактерии Arenibacter latericius KMM 426T удаляет иммунодоминантные а-1,3-связанные остатки N-ацетилгалактозамина от невосстанавливающего конца углеводной составляющей антигенных детерминант эритроцитов человека группы крови А.
-
a-Галактозидаза из морской Y-протеобактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 удаляет иммунодоминантные а-1,3-связанные остатки галактозы от невосстанавливающего конца углеводной составляющей антигенных детерминант эритроцитов человека группы В. Фермент имеет свободную SH-группу, важную для проявления активности; по биохимическим свойствам, субстратной специфичности, первичной и пространственной структуре он относится к 36-ому семейству О-гликозидгидролаз.
-
Иммобилизация a-галактозидазы в гибридные полисахарид-силикатные нанокомпозитные материалы увеличивает уровень ее активности и стабильность.
-
Влияние полигидрокси-1,4-нафтохинонов на гидролитическую активность тиоловой a-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. KMM 701 зависит от природы заместителей, их числа и положения в структуре соединений: эхинохром А не влияет на активность фермента, ди- и тригалогензамещенные нафтазарины являются необратимыми ингибиторами a-галактозидазы.
-
Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens, освобожденный от полифенольных соединений, сохраняет структурные характеристики и биологические свойства исходного полисахарида. Образец полисахарида пригоден для использования в качестве субстрата при поиске фукоиданаз, изучении их свойств и субстратной специфичности.
-
Фукоиданазы с невысоким уровнем активности широко распространены как среди бактерий-эпифитов бурых водорослей, так и среди изолятов морских иглокожих. Лучшими продуцентами являются бактерии родов Alteromonas и Pseudoalteromonas филума Proteobacteria, а также бактерии семейства Flavobacteriaceae типа Bacteroidetes.
-
Y-Протеобактерия Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T, а также бактероиды семейства Flavobacteriaceae, такие как Mesonia algae КММ 3909Т, Maribacter sp. КММ 6211 и Gramella sp. КММ 6054 содержат ферменты, участвующие в деградации как нейтральных, так и полианионных полисахаридов бурых водорослей, в том числе — фукоиданазы. Уровень активности фукоиданаз в клетках этих бактерий невысок и варьирует в зависимости от состава питательной среды.
-
Фукоиданазы из штаммов бактерии Pseudoalteromonas citrea, которые являются эпифитами бурых водорослей F. evanescens и Chorda filum, а также ассоциантами голотурии Apostichopus japonicus, катализируют гидролиз доступных а-1,3-О-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens по эндо-типу, образуя в качестве продуктов сульфатированные a-L-фукоолигосахариды.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые выполнено крупномасштабное исследование распространенности О-гликозидгидролаз среди бактериальных изолятов различных экотопов Охотского, Японского, ЮжноКитайского, Кораллового морей, литорали Сейшельских о-в, о-в Кука и других акваторий Мирового океана.
Впервые в морских бактериях найдены гликозидгидролазы, модифицирующие эритроциты и гликопротеины крови человека группы А и В: а-галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. КММ 701, a-N-ацетилгалактозаминидаза из Arenibacter latericius КММ 426Т, проведено их выделение и очистка; впервые показано, что а-галактозидаза из морской бактерии нарушает углеводные структуры, экспрессированные на поверхности эпителиоцитов человека и бактерий С. diphteriae.
Установлена полная аминокислотная последовательность а-галактозидазы и принадлежность ее к 36 семейству О-гликозидгидролаз. Впервые методом сравнительного моделирования получены теоретические модели пространственной структуры а-галактозидазы Pseudoalteromonas sp. КММ 701, её каталитического домена и комплекса с конкурентным ингибитором галактозой. На основании результатов этих исследований установлены функционально значимые участки в молекуле фермента и их роль в катализе.
Выполнена иммобилизация а-галактозидазы в гибридных нанокомпозитных материалах, содержащих полисахариды, в результате чего увеличилось время функционирования фермента и его термостабильность.
Среди природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов обнаружены ингибиторы а-галактозидазы; наиболее значительным необратимым ингибирующим действием отличались хлорпроизводные этих соединений.
Из бактерии Pseudoalteromonas citrea выделен фермент, который катализирует гидролиз доступных а-1,3-О-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens и является 1,3-а-Ь-фуканазой (ЕС 3.2.1.-).
Результаты исследований защищены патентами и позволят достичь конечной практической цели — применения ферментов морских бактерий и их рекомбинантных форм в медицине, структурной химии углеводов и генной инженерии.
Апробация результатов. Результаты диссертационной работы были представлены в виде постерных сообщений и устных докладов на следующих Региональных, Всероссийских и Международных конференциях и симпозиумах: 45th Arctic Science Conference "Bridges of the science between North America and the Russian Far East" (Vladivostok, Russia, 1994), PICIES Workshop on the Okhotsk Sea and Adjacent Areas (Vladivostok, Russia, 1995), 2-ом ^езде биохимического общества (Москва, Россия, 1997), Proceedings Conference Oceanology International 97 Pacific Rim (World Trade Center, Singapore, 1997), Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, Россия, 1998), IX Pacific Science Inter-Congress (Taipei, Taiwan, 1998), 2-ом Международном симпозиуме "Химия и химическое образование" (Владивосток, Россия, 2000), Научной конференции "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока" (Владивосток, Россия, 2001), 9th International Symposium on Microbial Ecology (Amsterdam, Holland, 2001), Science Cnference on Marine Biotechnology (Shizuoka, Japan, 2001), 18th European Conference on Biomaterials (Stuttgart, Germany, 2003), Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, Россия, 2004), XVIII International Seaweed Symposium (Bergen, Norway, 2004), "2004 International Meeting of the Federation of Korean Microbiological Societies" (Seoul, Korea, 2004), V Всероссийском научном семинаре и молодежной школе "Химия и медицина" (Уфа, Россия, 2005), PICES XIV (Vladivostok, Russia, 2005), 31st FEBS congress (Turkey, 2006), II Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, Россия, 2006), 1st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences (Vladivostok, Russia, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 26 статей в отечественных и международных журналах и 37 тезисов докладов в сборниках трудов Региональных, Всероссийских и Международных конференций и симпозиумов. Штаммы-продуценты, способы получения ферментов защищены тремя патентами РФ.
Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 596 источников. Работа изложена на 276 страницах, содержит 50 таблиц и 79 рисунков.
Автор искренне благодарен научному руководителю и учителю, д.х.н., проф. Еляковой Л.А. и научному консультанту, зав. лабораторией химии ферментов, д.х.н., проф. Звягинцевой Т.Н. за ценные советы, глубокий и критический анализ и помощь в работе. Автор глубочайше признателен всем сотрудникам лаборатории химии ферментов и других лабораторий и подразделений ТИБОХ ДВО РАН, принимавшим участие в работе: к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Шевченко Н.М., н.с. Киселёвой М.И., к.б.н. Кусайкину М.И., к.б.н. Бурцевой Ю.В., к.х.н. Ермаковой С.П., д.б.н., член.-кор. РАН Михайлову В.В., д.б.н. Недашковской О.И., д.б.н. Ивановой Е.П., к.б.н. Шевченко Л.С., д.б.н. Пивкину М.В., к.б.н. Рассказову В.А., к.б.н. Балабановой Л.А., к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н., к.ф-м.н. Исакову В.В., к.ф-м.н. Глазунову В.П., н.с. Ким Н.Ю., вед. инженеру-электронику Кулешу Ю.Г., д.х.н. Ануфриеву В.Ф., д.х.н. Новикову В.Л., к.х.н. Похило Н.Д., к.х.н. Шестак О.П., к.х.н. Кольцовой Е.А., к.х.н. Чикаловец И.В. Автор также благодарен за плодотворное сотрудничество в работе сотруднику Института химии ДВО РАН д.х.н., член.-кор. РАН Щипунову Ю.А., сотрудникам Института микробиологии и эпидемиологии РАМН, акад. РАМН Беседновой Н.Н., д.б.н. Запорожец Т.С., д.б.н. Кузнецовой Т.А., к.б.н. Макаренковой И.Д., сотрудникам Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, д.х.н., проф. Усову А.И., к.х.н. Лихошерстову Л.М. и к.х.н. Мартыновой М.Д., сотрудникам Гематологического научного центра РАМН к.б.н. Кульману Р.А. (посмертно), д.б.н., проф. Макарову В.А., к.б.н. Дрозд Н.Н., сотруднику Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, д.х.н., проф. Рабиновичу М.Л.
Похожие диссертации на О-Гликозидгидролазы морских бактерий
-
