Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 10
2.1 Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 13
2.1.1 Физические основы ЯМР-спектроскопии 13
2.1.2 Современная спектроскопия ЯМР в исследовании бактериальных углеводов .25
2.2 Масс-спектрометрия . 39
2.2.1 Номенклатура разрывов связей в олигосахаридах 40
2.2.2 Типы анализаторов, используемые в современных масс-спектрометрах 41
2.2.3 Масс-спектрометрия с ионизацией бомбардировкой быстрыми атомами ...42
2.2.4 Масс-спектрометрия с ионизацией лазерной десорбцией из матрицы 47
2.2.5 Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением 54
3. Результаты и обсуждение 61
3.1 Установление строения о-полисахаридов бактерий рода Protevs62
3.1.1 Полисахариды, содержащие гексуроновые и нонулозоновую кислоты 62
3.1.1.1 Proteus mirabilis 09 62:
3.1.1.2 Proteus vulgaris 037 65
3.1.1.3 Proteus mirabilis O50 „ 66
3.1.1.4 Proteus vulgaris 055 67
3.1.1.5 Proteus vulgaris ОЪ9 68
3.1.2 Полисахариды, содержащие фосфатные группы 70
3.1.2.1 ProteuspenneriO\9 71
3.1.2.2 Proteus penneriOeS 72
3.1.2.3 Proteus mirabilis ОАО 73
3.1.2.4 Proteus mirabilis 018 74
3.1.3 Полисахариды, содержащие остатки неуглеводных органических кислот...75
3.1.3.1 Proteus mirabilis 07 76
3.1.3.2 Proteus mirabilis ОАЭ 79
3.1.3.3 Proteus mirabilis 038 81
3.1.3.4 Proteus penneri 031 85
3.1.3.5 Proteus myxocfadens O60 87
3.1.4 Нейтральные полисахариды 88
3.1.4.1 Proteus mirabilis O20 88
3.1.5 Значение данных о строении О-полисахаридов для классификации Proteus..89
3.2 Установление строения коралпс бактерий рода Proteus 97
3.2.1 Подготовка образцов и выбор метода исследования 99
3.2.2 ESI-FT-ICR-масс-спектры с регистрацией катионов и анионов 100
3.2.2 Эксперимент IRMPD MS /MS с регистрацией отрицательно анонов 102
3.2.3 CSD-масс-спектрометрия с регистрацией катионов 104
3.2.4 Установление полной структуры олигосахаридов кора 107
3.2.5 Обсуждение результатов структурного исследования кора Proteus. Ill
4. Экспериментальная часть 116
4.1 Бактериальные штаммы, выращивание бактерий и выделение ЛПС 116
4.2 Деградация липополисахаридов 116
4.2.1 Мягкий кислотный гидролиз
4.2.2 О-Дезацилирование 118
4.2.3 Дезаминирование 118
4.3 Химические модификации и избирательное расщепление 119
4.3.1 О-Дезацетилирование 119
4.3.2 Дефосфорилирование 119
4.3.3 Восстановление карбоксильных групп 119
4.3.4 Сольволиз безводным фтористым водородом 119
4.3.5 Сольволиз трифторметансульфокислотой 120
4.3.6 Парциальный кислотный гидролиз 120
4.3.7 Дезаминирование 120
4.4 опРеделение состава полисахаридов. 120
4.4.1. Ионообменная хроматография 120
4.4.2 Газо-жидкостная хроматография 121
4.5 Определение абсолютных конфигураций компонентов 121
4.6 Анализ методом метилирования. 122
4.7 Инструментальные методы анализа 123
4.7.1 Масс-спектрометрия „123
4.7.3 Спектроскопия ЯМР 124
Выводы 125
Список литературы 126
Приложения 144
Приложение І 144
Приложение II 153
Приложение III 158
- Физические основы ЯМР-спектроскопии
- Масс-спектрометрия с ионизацией бомбардировкой быстрыми атомами
- Полисахариды, содержащие фосфатные группы
- Деградация липополисахаридов
Введение к работе
Серологическая О-специфичность грамотрицательных бактерий определяется строением липополисахарида (ЛПС), расположенного на внешней мембране клеточной оболочки. ЛПС является основным поверхностным антигеном бактерий и против него направлен иммунный ответ инфицированных животных и человека. Именно строение ЛПС определяет результат иммунного ответа — будет ли бактериальная клетка распознана и уничтожена защитной системой организма-хозяина или же фагоцитоз будет предотвращен и будет обеспечено выживание бактерии. Химическая структура, механизмы биосинтеза и функционирования ЛПС вызывают устойчивый интерес исследователей на протяжении многих лет, и их изучению посвящено большое число публикаций (обзоры [1—10]), причем этот интерес неуклонно возрастает, во многом благодаря развитию физико-химических методов анализа, позволяющих получать недоступную ранее структурную информацию. Исследования ЛПС ставят своей целью решение ряда фундаментальных задач, таких как выяснение взаимосвязи между структурой и функцией биополимеров и изучение механизмов специфического иммунного ответа. Они имеют также практическое значение, например, данные о строении ЛПС используются для классификации микроорганизмов, серодиагностики инфекционных заболеваний и создания искусственных вакцин. Таким образом, эта проблема является одной из наиболее актуальных тем в современной биохимии, иммунохимии, иммунологии и микробиологии.
Полные молекулы ЛПС (т.н. S-форма) состоят из трех компонентов, различающихся по структуре и биологическим функциям: полисахаридной цепи (О-антигена, О-полисахарида), липидной части (липида А) и расположенного между ними олигосахарида кора. В молекулах ЛПС R-формы О-полисахарид отсутствует. О-полисахарид является периферийной частью молекулы ЛПС, направленной от клетки в сторону окружающей среды. Как правило, он является регулярным полимером, построенным из олигосахаридных повторяющихся звеньев, но иногда регулярность О-полисахарида может быть замаскирована присутствием боковых гликозильных или неуглеволных заместителей в нестехиометрическом количестве. Кор представляет собой олигосахарид, состоящий из 6—15 моносахаридных остатков и может быть разделен на две области: внутреннюю, примыкающую к липиду А, и внешнюю. Внутренняя область содержит кислые компоненты (фосфатные группы, остатки альдулозоновых и уроновых кислот), которые образуют с катионами двухвалентных металлов ионные мостики, стабилизирующие внешнюю мембрану. Наряду с присутствующими в коре и липиде А аминокомпонентами они участвуют в
Введение
регулировании проницаемости внешней мембраны для низкомолекулярных соединений, включая антибиотики. Липид А является якорем, удерживающим молекулы ЛПС во внешней мембране за счет гидрофобных взаимодействий Друг с другом и с молекулами фосфолипидов. Липид А ответственен за биологическую активность ЛПС, включая способность индуцировать образование провоспалительных цитокинов и вызывать септический шок.
Внутренняя область кора и липид А являются наиболее консервативными по химическому строению участками ЛПС, в то время как структуры О-полисахарида отличаются широким разнообразием даже у штаммов одного вида бактерий. Внешняя область кора обычно более вариабельна по сравнению с внутренней областью, но особенно широким разнообразием ее структур отличаются бактерии Proteus, у которых оно приближается к структурному разнообразию О-полисахаридов. Иммуноспецифичность бактерий, на основе которой осуществляется серологическая классификация бактериальных штаммов, обычно определяется тонкой структурой О-полисахарида, но определенный вклад в сероспецифичность, как, например, в случае бактерий Proteus, может вносить также структура внешней области кора.
Грамотрицательные бактерии рода Proteus, включая виды P. mirabilis, P. vulgaris и P. penneri, являются распространенной причиной заболеваний мочеполовой системы, которые могут приводить к серьезным осложнениям, таким как хронический пиелонефрит и образование камней в почках и мочевом пузыре. Штаммы важных в медицинском отношении видов P. mirabilis и P. vulgaris были первоначально классифицированы в 49 О-серогрупп на основе сероспецифичности О-антигенов [11,12], но обнаружение новых серологически отличимых штаммов этих видов, а также вида P. penneri (всего более 40 штаммов) показало необходимость расширения и уточнения классификационной схемы.
Систематическое структурное и иммунохимических исследование ЛПС с целью создания молекулярной основы для надежной классификации бактерий Proteus проводится в Лаборатории химии углеводов ИОХ РАН совместно с Институтом микробиологии и иммунологии Университета Лодзи (Польша) с конца 1980-х годов. К началу нашего исследования были установлены или находились в процессе изучения структуры 78 О-полисахаридов Proteus и классификационная схема этих бактерий была расширена до 70 серогрупп за счет создания новых серогрупп для ранее неклассифицированных штаммов [13,14].
Основной целью настоящей работы было завершение данного проекта. В ней установлено строение О-полисахаридов всех 15 остававшихся неизученными штаммов Proteus. На основании полученных структурных данных и результатов серологического исследования, проводимого польскими партнерами, уточнена и расширена существующая серологическая классификационная схема Proteus.
Введение
Кроме того, на молекулярном уровне обоснованы серологические взаимосвязи, наблюдающиеся между некоторыми штаммами Proteus Друг с другом и с другими бактериями. В изученных полисахаридах идентифицированы новые производные моносахаридов, которые ранее в природных углеводах обнаружены не были.
Опубликованные данные по изучению кора ЛПС Proteus показали, что для этих бактерий кор, также как и О-полисахарид, отличается высоким структурным разнообразием, и что его вклад в иммуноспецифичность необходимо учитывать при классификации штаммов. Это привлекло наше внимание к этой наиболее сложной по структуре области ЛПС, однако оказалось, что известные методы установления строения кора ЛПС являются слишком трудоемкими и не подходят для исследования больших групп структурно-родственных объектов.
В связи с этим другой важной целью настоящего исследования была разработка нового эффективного подхода к структурному анализу олигосахаридов кора, который позволил бы выявлять как общие структурные фрагменты, так и различия в строении кора ЛПС различных штаммов Proteus. Он заключался в использовании масс-спектрометрии высокого разрешения, включая методики неселективной фрагментации и тандемную масс-спектрометрию с фрагментацией изолированных ионов, что позволило непосредственно идентифицировать более консервативную по структуре внутреннюю область кора и получать предварительную информацию о строении внешней области. Проведенный этим методом скрининг олигосахаридов кора 50 штаммов Proteus позволил получить существенную структурную информацию для коров 39 штаммов Proteus, в том числе выявить не менее 19 новых структур и установить полное строение кора в ЛПС двух штаммов.
Результаты работы опубликованы в 19 статьях [15-33] и 5 тезисах докладов и были представлены автором на XX Международном симпозиуме по углеводам (Гамбург, Германия, 27 августа-1 сентября 2000 г.), I Германо-польско-российской конференции по бактериальным углеводам (Борстель, Германия, 5-6 сентября 2000 г.), XI Европейском симпозиуме по углеводам (Лиссабон, Португалия, 2-7 сентября 2001 г.), II Германо-польско-российской конференции по бактериальным углеводам (Москва, Россия, 9-13 сентября 2002 г.) и XII Европейском симпозиуме по углеводам (Гренобль, Франция, 6-12 июля 2003 г.).
Работа являлась частью проводимого в Лаборатории химии углеводов ИОХ РАН систематического исследования бактериальных полисахаридов. Она была выполнена в рамках проектов, финансируемых грантами государственной поддержки ведущих научных школ РФ (00-15-97373, НШ-1557.2003.3), РФФИ (99-04-48279, 01-04-06599-мас, 02-04-48767, 02-04-06313-мас, 03-04-06431-мае) и ИНТАС (YSF 2001-02/001).
Введение
Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов, а также включает список литературы и приложения (таблицы с данными ЯМР спектров, гзС-ЯМР-спектры полисахаридов и масс-спектры олигосахаридов кора). Литературный обзор посвящен применению ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии к структурному анализу сложных бактериальных углеводов. В первой части главы «Результаты и обсуждение» приведены результаты установления строения О-полисахаридов и обсуждаются использованные в работе методы и значение полученных данных для классификации штаммов Proteus. Во второй части этой главы описаны подходы к установлению строения олигосахаридов кора Proteus с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения. В главе «Экспериментальная часть» собраны методики выделения и селективного расщепления О-полисахаридов и олигосахаридов кора, их химического анализа, проведения ЯМР-спектроскопических и масс-спектрометрических экспериментов.
Выращивание бактерий, выделение ЛПС и серологические исследования О-антигенов проводились В. Кацой, А. Рожальским и 3. Сидорчиком и их сотрудниками в Центре микробиологии и вирусологии Польской академии наук и Институте микробиологии и иммунологии Университета Лодзи (Польша). В структурном исследовании О-полисахарида P. vulgaris 039 и олигосахарида кора P. penneri 97 принимал участие А.В. Перепелов. Часть исследованных образцов олигосахаридов кора Proteus была любезно предоставлена Е.В. Виноградовым. Масс-спектрометрические исследования олигосахаридов кора проводились в Исследовательском центре Борстеля (Германия).
Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Юрию Александровичу Книрелю за постановку задачи, определение основных направлений работы и помощь при обсуждении результатов. Автор благодарит руководителей Лаборатории химии углеводов Николая Константиновича Кочеткова и Владимира Николаевича Шибаева за постоянный интерес к работе, а также директора Исследовательского центра Борстеля Эрнста Ритчела за предоставление возможности проведения исследований в его институте. Автор искренне признателен Александру Степановичу Шашкову и Буко Линднеру за обучение работе на ЯМР- и масс-спектрометрах, а также за помощь в съемке и интерпретации спектров, Софии Николаевне Сенченковой за обучение приемам и помощь в проведении химических анализов, Ольге Витальевне Быстровой за помощь в выделении олигосахаридов кора, Леону Владимировичу Бакиновскому за критическое прочтение статей для печати и диссертационной работы, а также всем биологам и химикам, участвовавшим в совместных проектах, и коллективам Лаборатории химии углеводов И ОХ РАН и Отдела биофизики Исследовательского центра Борстеля за товарищескую поддержку.
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Применение ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии для установления строения бактериальных углеводов
Возможность быстро и надежно устанавливать строение сложных природных углеводов является необходимым условием развития таких областей науки о жизни как биохимия и иммунохимия и представляет значительный интерес для ряда смежных областей, включая иммунобиологию, иммунологию, биофизику, биотехнологию, генетику и другие. Накопление знаний в этих областях существенно расширило наши представления о взаимосвязи свойств углеводов с их строением и позволило на молекулярном уровне объяснить многие процессы, происходящие в живых организмах. Важное место в этих исследованиях занимает изучение строения внеклеточных полисахаридов и гликоконъюгатов клеточной поверхности бактерий, играющих первостепенную роль во взаимодействии бактериальных патогенов с организмом хозяина (растения, животного и человека) и с бактериофагами. Многие из бактериальных полисахаридов имеют промышленное применение.
В последние годы одним из основных факторов, определяющих прогресс в изучении строения сложных биологических объектов, включая углеводы, стало развитие физических и физико-химических методов анализа. Оно является непрерывным процессом, в котором одни, казавшиеся ранее достаточно эффективными методики и приборы, сменяются другими, еще более совершенными, но продолжают сосуществовать какой-то период времени, пока не произойдет полная смена приборного парка. Разнообразие этих методик и объектов их применения не позволяет полностью охватить их в рамках одного небольшого обзора, поэтому данный обзор ограничен рассмотрением современных подходов к установлению строения бактериальных углеводов с использованием двух наиболее важных физических методов: спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии (МС). Обзор ставит своей целью дать представление о наиболее эффективных методиках структурного анализа и об информации, которая может быть получена с их помощью. В начале каждого раздела приводится краткая информация о физических основах этих методов, тогда как для более детального знакомства с ними рекомендуются соответствующие монографии [ЯМР 34—36, МС 37]. Ссылки на оригинальные статьи, посвященные отдельным методикам, приводятся при их первом упоминании.
В приведенной ниже таблице суммированы основные этапы развития этих двух методов исследования.
Литературный
ЯМР-спектроскопия
Масс-спектрометр ия
*М1'&-
1945 Первые опыты по регистрации ядерного магнитного резонанса в жидкостях и твердых телах
1942 Создание первого коммерчески доступного масс-спектрометра для нужд органической химии
Создание времяпролетного (Time Of Flight, TOF) масс-спектрометра
Первый масс-спектрометр с ион-циклотронным резонансом (Ion-Cyclotron Resonance, ICR)
Использование в структурных исследованиях данных о химических сдвигах и КССВ
1956 Объединение масс-спектрометра с газожидкостным хроматографом
Использование накопления сигналов с последующим усреднением для улучшения чувствительности
Создание ЯМР-спектрометра, использующего преобразование Фурье для обработки данных
Использование в структурных исследованиях ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО)
1967 Первые опыты по диссоциации ионов под воздействием столкновений (Collision Induced Dissociation, CID)
L
Начало использования магнитов на сверхпроводниках
1971 Двумерная гомоядерная корреляционная спектроскопия (Correlation Spectroscopy, COSY)
1974 Создание ICR-масс-спектрометра, использующего преобразование Фурье для обработки данных
Гетероядерная корреляционная спектроскопия (Heteronuclear Single-Quantum Coherence, HSQQ
Корреляционная спектроскопия с использованием ЯЭО (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy, NOESY)
1983 Полная гомоядерная корреляционная спектроскопия (Total Correlation Spectroscopy, TOCSY)
1986 Полная гетероядерная корреляционная спектроскопия (HMQC-TOCSY)
1986 Гетероядерная корреляционная спектроскопия через несколько связей (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation, HMBQ
1981 Ионизация быстрыми атомами (Fast Atom Bombardment, FAB)
1987 Ионизация лазерной десорбцией из матрицы (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization, MALE) I)
Объединение масс-спектрометра с капиллярным электрофорезом
Ионизация электрораспылением (ElectroSpray Ionization, ESI)
L
У.ЯІ
Распространение градиентных методик
Создание комбинированных методов (ГЖХ-ЯМР и др.)
1991 Разработка метода постионизационной
фрагментации для MALDI (Post Source Decay,
PSD)
1994 Ионизация наноэлектрораспылением
(nESI)
-И-
Литературный обзор
В общем виде установление строения олигосахаридов или олигосахаридных повторяющихся звеньев регулярных полисахаридов (для простоты в дальнейшем они также будут называться олигосахаридами) сводится к решению следующих задач:
Установление размера олигосахарида.
Определение моносахаридного состава олигосахарида.
Определение конфигураций гликозидных связей.
Определение положений гликозилирования в моносахаридных остатках.
Определение последовательности моносахаридных остатков в олигосахариде.
Локализация неуглеводных заместителей (если таковые имеются).
В большинстве случаев современная ЯМР-спектроскопия позволяет ответить на все эти вопросы, причем при использовании соответствующего оборудования (датчиков и ампул) полное установление структуры возможно при наличии всего одного и менее миллиграмма исследуемого соединения. Однако практические соображения накладывают ряд ограничений на возможности этого метода. Во-первых, сложность ЯМР-спектров существенно возрастает с увеличением числа моносахаридных остатков в олигосахариде, и если расшифровка спектров от ди- до гексасахаридов обычно представляет собой достаточно рутинную задачу, то в случае более сложных олигосахаридов она может натолкнуться на трудности из-за перекрывания сигналов. Во-вторых, ЯМР-спектроскопия, являясь наиболее чувстсвительным к структурным изменениям методом анализа, является при этом наименее чувствительным методом с физической точки зрения, поэтому при небольшом количестве исследуемого вещества многие ЯМР-эксперименты требуют довольно значительного времени. В-третьих, при установлении строения сходных соединений, например, отличающихся положением только одного или нескольких заместителей, часто приходится проводить полный анализ и делать отнесение всех сигналов в спектрах каждого соединения.
Структурная информация, получаемая при применении масс-спектрометрии, более ограничена, однако достоинствами этого метода являются высокая чувствительность, возможность анализа смесей и быстрой идентификации сходных соединений. Области использования МС для структурного анализа углеводов можно разбить на две большие группы: исследование мономеров, получаемых гидролизом или сольволизом олигосахаридов, или их производных, и исследование самих олигосахаридов. ГЖХ-МС летучих производных моносахаридов позволяет идентифицировать сахарные остатки и определять положения гликозилирования. МС олигосахаридов дает информацию о размере олигосахарида, его составе (как правило с точностью
Литературный обзор
до типа моносахаридов, например, гексоза, гептоза, гексозамин, гексуроновая кислота и т.д.), последовательности моносахаридов в олигосахариде и местах присоединения неуглеводных заместителей, что соответствует решению задач 1, 5 и частично 2 и 6 из вышеприведенного списка.
Физические основы ЯМР-спектроскопии
В основе спектроскопии ядерного магнитного резонанса лежит тот факт, что ряд ядер (в частности, Н и 13С) обладают спином х/г, вследствие чего, находясь во внешнем магнитном поле, эти ядра прецессируют вокруг оси, направленной либо параллельно ему (а), либо антипараллельно (р) и могут переходить из одного состояния в другое, поглощая или испуская волны определенной частоты. Эта частота определяется многими факторами, включая химическое окружение данного ядра, что и делает ЯМР-спектроскопию столь удобным методом установления структуры химических соединений.
Поскольку количество а- и р-ядер неодинаково и определяется распределением Больцмана, то группа ядер обладает суммарным магнитным моментом Мо, поведение которого подчиняется законам классической механики. Изменение под действием облучения соотношения ядер с а- и Р-ориентацией приводит к отклонению от положения равновесия. Возвращение системы в первоначальное состояние сопровождается выделением энергии, которое ослабевает по мере приближения к равновесию. Это явление, называемое спадом индуцированного сигнала (СИС или Free Induction Decay, FID), регистрируется датчиком ЯМР-спектрометра. 2.1.1.1 Лабораторная и вращающаяся системы координат Эти два понятия относятся к представлению в виде векторной модели процессов, происходящих в ядре под действием внешнего магнитного поля и радиочастотных импульсов (рис. 2.1.1). Различие между двумя способами представления состоит в положении наблюдателя относительно системы векторов. В лабораторной системе координат наблюдатель находится «вне» системы, в результате чего создается сложная картина, состоящая из множества прецессирующих векторов. Во вращающейся системе координат внешнее магнитное поле Bi,, отвечающее за резонанс спинов, раскладывается на два вектора, вращающиеся в плоскости х—-у в разные стороны с одинаковой скоростью. Система координат принимается вращающейся со скоростью одного из этих векторов, что позволяет существенно упростить модель. При фиксации системы координат на одном из векторов в новой, вращающейся, системе второй вектор, составляющий Bi, оказывается движущимся со скоростью в два раза быстрее остальных, и им можно пренебречь. Поскольку по условиям резонанса скорость прецессии ядерных спинов совпадает с частотой вращения одного из векторов Ві, то во вращающейся системе координат они оказываются «замороженными».
Физическим аналогом этого формального представления является способ регистрации FID в ЯМР-спектрометрах. Частота прецессии магнитного момента протонов может составлять несколько сотен МГц, в то время как разница между этими частотами для разных протонов одной молекулы обычно не превышает нескольких сотен Гц. Для облегчения оцифровки и уменьшения объема данных из измеренных в результате эксперимента частот вычитается рабочая частота спектрометра, т.е. вместо рассмотрения всей совокупности прецессирующих частот используются только данные о разнице между частотами отдельных ядер.
Импульсом в спектроскопии ЯМР называется временное включение радиочастотного поля определенной амплитуды вдоль одной из осей вращающейся системы координат. Под его воздействием вектор Мо начинает смещаться в направлении, перпендикулярном направлению приложения поля, причем величина отклонения от первоначального положения определяется длительностью импульса, которая обычно и измеряется в градусах отклонения.
Наиболее распространенными являются 90- и 180-градусные импульсы (рис. 2.1.2), смещающие вектор Мо от положения, параллельного оси во вращающейся системе координат, в плоскость х—-у (90) или делающие его антипараллельным оси (180). Большинство ЯМР-экспериментов состоит из последовательного приложения этих двух импульсов. При этом 90-градусный импульс, в отличие от 180-градусного, создает намагниченность в плоскости x—j, которую регистрирует ЯМР-спектрометр, что позволяет, варьируя длительность и направление приложения импульсов, влиять на число и вид сигналов в спектре.
Одной из интересных возможностей импульсных последовательностей является так называемое спиновое эхо: рефокусировка магнитных моментов под действием 180-градусного импульса. После начального 90-градусного импульса суммарный магнитный момент может быть не строго параллелен осям х или_у — часть индивидуальных магнитных моментов может двигаться быстрее «усредненного» импульса, выбирающегося в качестве скорости вращения системы координат, а часть медленнее в результате чего с течением времени эти вектора будут расходится все дальше Друг от друга. Однако если после истечения времени Д приложить к этим векторам 180-градусный импульс, а затем позволить им свободно перемещаться в течение того же периода А, то все вектора окажутся на той же оси, с которой они начинали движение. Эта возможность используется в большом числе одномерных и двумерных гомо- и гетероядерных экспериментов.
Будучи выведенной из положения равновесия в результате действия радиочастотного импульса, система спинов стремится вернутся к нему, и этот процесс называется процессом релаксации. Для ЯМР-спектроскопии наибольшее значение имеют вопросы о времени, которое занимает релаксация, и о ее механизмах.
Медленная (по сравнению, например, с возбужденными электронами) релаксация ядер является причиной того, что, в отличие от других видов спектроскопии, спектры ЯМР содержат сравнительно узкие сигналы. Это позволяет влиять на итоговый спектр, варьируя время между приложением импульсов. Теоретически данные о временах релаксации могут использоваться для получения информации о структуре молекул, однако этот метод почти не используется из-за сложности точного измерения этих времен, а также множества побочных факторов, оказывающих влияние на их величину. На практике знание значений времен релаксации необходимо для планирования импульсных последовательностей.
Масс-спектрометрия с ионизацией бомбардировкой быстрыми атомами
Ионизации бомбардировкой быстрыми атомами (Fast Atom Bombardment, FAB) была предложена в 1981 г. [101] и получила такое название потому, что для ионизации на раствор исследуемого вещества в вязкой нелетучей жидкости (матрице) направляют пучок нейтральных атомов высокой энергии. В результате столкновения молекулы исследуемого соединения, а также компоненты матрицы вылетают из раствора и направляются к анализатору. Введение в практику FAB-MC явилось прорывом в технике ионизации нелетучих и термически нестойких биомолекул без их деструкции. Одним из преимуществ данного метода является то, что ионизация происходит непрерывно, что позволяет проводить несколько последовательных экспериментов, включая эксперименты по селективной фрагментации.
При исследовании олигосахаридов в роли матрицы обычно используется глицерин, тиоглицерин и различные смеси на их основе. В условиях одного эксперимента FAB можно наблюдать одновременно псевдомолекулярные ионы (М+Н]+ и [M+Na]+, а также ионы, получаемые в результате разрыва наиболее лабильных связей в молекуле. Наибольшее распространение эта методика получила в анализе метилированных производных олигосахаридов, выделенных из гликопротеинов. Несмотря на то, что в настоящее время происходит быстрая замена FAB-приборов приборами, в которых используются источники MALDI и ESI, мы рассмотрим несколько примеров успешного использования FAB-MC для установления строения бактериальных липополисахаридов и продуктов их селективной деградации.
Объектами FAB-масс-спектрометрического анализа могут быть как перметилированные и перацетилированные производные, так и немодифицированные олигосахариды. В работе по изучению влияния двухкомпонентной регуляторной системы PhoPQ на строение ЛПС чумной бактерии Yersinia pestis [102] этот подход использовался для сравнения ЛПС, продуцируемых диким штаммом и pboP-мутантом. Помимо пиков различных гликоформ и их недо- и переметилированных производных, масс-спектр метилированного олигосахарида кора с регистрацией катионов содержал также пики ряда А-фрагментов, соответствующих потере терминальных моносахаридов, а также фрагментов, образовавшихся в результате одновременного разрыва нескольких связей (рис. 2.2.2).
Серия фрагментов в спектре метилированного олигосахарида кора одного из штаммов Campylobacter jejuni [103] позволила получить информацию о последовательности моносахаридных звеньев. FAB-масс-спектры немодифицированных олигосахаридов кора с регистрацией катионов и анионов использовались для подтверждения структуры кора бактерии Acinetobacter baumannii NCTC 10303 [104], установленной с помощью ЯМР-спектроскопии. В отличие от спектров перметилированных производных в спектрах немодифицированных олигосахаридов фрагментации не наблюдалось.
FAB-масс-спектр с регистрацией катионов олигосахарида кора ЛПС SR-штамма Salmonella enterica sv. Arizonae 062 [105], несущего на себе одно повторяющееся звено О-полисахарида, содержал интенсивные пики аддуктов с ионами щелочных металлов, соответствующие различным гликоформам кора (см. раздел 2.2.3.2) и присутствию различного числа фосфатных групп и остатков фосфоэтаноламина. В масс-спектре с регистрацией отрицательных ионов деионизированного образца наблюдался только один сигнал, соответствующий основной гликоформе, но его интенсивность была невысока.
Возможности метода в анализе соединений, несущих несколько заряженных групп, были продемонстрированы на примере изучения сульфатированных Льюис Х-трисахаридов [106]. В FAB-масс-спектрах с регистрацией анионов наблюдалось отщепление терминального остатка фукозы, замещающего остаток GlcNAc в положение 3. Подобные разрывы связей наблюдались также в FAB-масс-спектрах перметилированных олигосахаридов с регистрацией катионов [Ю7] и немодифицированных разветвленных олигосахаридов с регистрацией анионов [108].
В работе по установлению строения кора R-штамма Salmonella enterica sv. Arizonae 062 [105] модифицированный ЛПС этого штамма исследовали методом FAB-масс-спектрометрии с регистрацией положительных ионов. Для получения растворимого соединения и снижения гетерогенности, связанной с распределением жирных кислот в липиде А, ЛПС дефосфорилировали, восстановили и полностью дезацилировали. В масс-спектре этого продукта (рис. 2.2.3) присутствовали пики различных гликоформ, наиболее интенсивный из которых при т/%\&45 соответствовал олигосахариду состава НехзНерзКсЬгНехЫг, что на остаток HexNAc и Hex меньше, чем описанная в литературе основная гликоформа кора других штаммов этой бактерии. Наблюдающаяся гетерогенность по крайней мере частично объяснялась отщеплением моносахаридов в процессе подготовки образца и ионизации в источнике.
Дальнейшая модификация обработкой 1% уксусной кислотой привела в разрыву связей остатков Kdo и образованию олигосахарида кора, масс-спектр которого содержал только два основных пика состава НехзНерзКсю и НехгНерзКсю. Для улучшения разрешения спектра и отношения сигнал/шум образец полностью О-ацетилировали и исследовали методом CID-фрагментации .
Для оценки гетерогенности препарата АПС R-штамма Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae [109] использовалась FAB-масс-спектрометрия с регистрацией катионов О-дезацилированного ЛПС, содержащего в липидной только два N-связанных остатка 3-гидрокситетрадекановой кислоты. Масс-спектр содержал пики, соответствующие различному составу олигосахаридов кора, причем помимо пиков молекулярных ионов в области т/% 2150-3200, в области т/ 800—1650 присутствовали пики Y-фрагментов, образовавшихся в результате Р-элиминирования во внутреннем коре, а также продуктов отщепления фосфатных групп. Таким образом, FAB-масс-спектр помимо общей информации о составе смеси, содержал также данные о составе внутреннего кора и позволял предварительно оценить положение фосфатных групп, а разница в значениях молекулярных масс фрагментов позволяла объяснить основные причины возникновения гетерогенности. Недостатком метода оказалось отсутствие в спектре пиков, соответствующих наиболее полной гликоформе кора.
Полисахариды, содержащие фосфатные группы
Остатки эфиров ортофосфорной кислоты найдены во многих О-полисахаридах Proteus. Эти фосфорилированные полисахариды можно разделить на три основных класса, в соответствии с чем дается их описание и в настоящей работе: полисахариды с фосфатной группой, присоединяющей к основной цепи неуглеводные заместители (раздел 3.1.2.1), полисахариды с полиол-фосфатом в основной цепи (раздел 3.1.2.2) и полисахариды, построенные из олигосахаридных звеньев, связанных фосфатными группами (раздел 3.1.2.3)
К числу типичных неуглеводных заместителей, вводимых фосфатными группами, относятся глицерин [75], D-рибит [153] и 2-аминоэтанол (этаноламин). Последний является наиболее распространенным из них: он найден во многих полисахаридах,включая изученные нами полисахариды Р.реппепЪХ (раздел 3.1.2.1) и P.penneri 63 (раздел 3.1.2.2). В описанном ниже О-полисахариде P. mirabilis 038 (раздел 3.1.3.3) нами впервые обнаружена N-ацетилированная форма 2-аминоэтилфосфата, а в изученных ранее О-полисахаридах P. mirabilis 014 присутствует фосфат 2-гидроскиэтил-0-аланина [154,155].
Полиол-фосфаты в основной цепи характерны для тейхоевых кислот грам-положительных бактерий, но довольно редко встречаются у полисахаридов грамотрицательных бактерий. Ранее в О-полисахаридах Proteus были обнаружены фосфаты глицерина (P. vulgaris 012 [156]) и D-рибита (P. mirabilis 016 [157], P. mirabilis ОЗІ [158] и Proteuspenneri 073 [159]) 0-полисахариды с олигосахарид-фосфатными повторяющимися звеньями, не содержащими полиолов, ранее были найдены у бактерий P. vulgaris Ol (ОХ19) [160], 021 [161], P. mirabilis 034 [162] и 048 [161]. 3.1.2.1 Proteus penned 019 (штамм 31) [19,28] О-Полисахарид ранее неклассифицированного штамма Proteuspenneri 31 содержит по данным моносахаридного и аминокислотного анализа остатки D-Gal, D-GlcN, D-GalN, I FucN и этаноламина (EtN). Для него была установлена следующая структура: EtNP-i 6 - 3)-a-D-Gal/ -(l- 4)-a-D-Ga NAc-(l -3)-a-L-Fuc/ NAc-(l- 3)-P-D-Glc/ NAc-(l- Спектры !Н- и 13С-ЯМР (рис. П-б в «Приложении II», таблицы 1-11 и 1-12 в «Приложении I») показали, что полисахарид имеет регулярную структуру с тетрасахаридным повторяющимся: звеном и подтвердили присутствие 2-аминоэтанола (характерные сигналы СН20 при 8 62,1 м.д. и CH2N при 41,5 м.д.). Спектр 31Р-ЯМР полисахарида содержал сигнал монофосфатной группы с химическим сдвигом 5 3,2 м.д. Дальнейший анализ с помощью двумерной спектроскопии 13С-ЯМР показал, что О-полисахарид P.penneri 31 имеет такую же структуру углеводной цепи, что и нефосфорилированный полисахарид Proteus vulgaris 019 (его установленная ранее структура [163] приведена ниже), и единственным различием между ними является наличие в составе первого полисахарида 2-аминоэтилфосфата. Положение этого заместителя на остатке GlcNAc было установлено с помощью корреляционного эксперимента lH,31P HMQC, в котором наблюдались корреляционные пики между фосфором и протонами остатка этаноламина при 8 3,2/3,28 м.д. (СНгЫ) и 3,2/4,12 м.д. (СНгО), а также корреляции между фосфором и протоном Н-б остатка GlcNAc (8 3,2/4,17 м.д.). Эти данные показали, что 2-аминоэтилфосфат присоединен к О-б остатка GlcNAc, что дополнительно подтверждалось смещением сигнала С-б этого сахара в слабое поле, по сравнению с его положением в незамещенном моносахариде (от 8 61,9 к 65,5 м.д., a-эффект фосфорилирования 3,6 м.д.). -+3)-a-D-Gal -(l- 4)-a-D-Gal/)NAc-(l- 3)-a-L-Fuc NAc-(l-»3)-p-r Glc/NAc-(l- P. vulgaris Ol9
Серологические исследования ЛПС также подтвердили родство между этими двумя штаммами и выявили взаимосвязь между их О-антигенами типа а/а,Ь , где V — общая антигенная детерминанта (общий эпитоп), а Ъ — эпитоп, характерный только для одного из антигенов, а именно, для О-антигена P.penneri 31. Очевидно, что существование общего эпитопа av обусловлено одинаковым углеводным скелетом Результаты и обсуждение: Строение О-полисахаридов Proteus обоих полисахаридов, а эпитоп Ъ связан с остатком этаноламина, присутствующим только в О-полисахариде P. penneri 31. На основании этих данных нами предложено расширить серогруппу 019 за счет включения в нее штамма P.penneri 31 и разделить ее на две подгруппы: 019а для P. vulgaris 019 и 019а,19Ь для Р.реппеггЪХ.
Остаток 2-аминоэтилфосфата, замещающий в глюкозамин в положение 6, был ранее обнаружен в О-полисахаридах P. mirabilis 016 [157], 017 [19], 027 [164], P. penneri 067 [165] и P. penneri 019 (раздел 3.1.2.1). Однако серологические исследования показали, что присутствия одного этого общего компонента недостаточно для обеспечения выраженного антигенного родства между штаммами. Более того, структуры О-полисахаридов P. penneri 019 (раздел 3.1.2.1) и P. penneri 63 роднит еще один общий фрагмент — дисахарид a-L-FucpNAc-(l— 3)-D-GlcpNAc, который был ранее обнаружен в семи других О-полисахаридах Proteus, включая P. mirabilis Об [151], P. vulgaris 08 [152], 012 [156], 019 [163], 042 [166], P. penneri 067 [165] и 070 [167]). Однако и в этом случае перекрестная реакция ЛПС была недостаточно хорошо выражена для того, чтобы служить основанием для объединения штаммов P. penneri 63 и P. penneri 019 в одну серогруппу. Таким образом, на основания полученных иммунохимических данных нами предложено создать для штамма P. penneri 63 новую серогруппу, получившую номер 068, в которой этот штамм является единственным представителем.
Для определения абсолютной конфигурации глицерина полисахарид был дефосфорилирован 48%-ной HF, и образовавшийся пентасахарид с остатком глицерина на восстанавливающем конце был окислен по гидроксиметильным группам NaOCl в присутствии NaBr и 2,2,6,6-тетраметил-І-пиперидинилокси-радикала (TEMPO). При этом остаток глицерина превратился в D-глицериновую кислоту, которую идентифицировали методом ГЖХ в виде (5)-окт-2-илового эфира. Таким образом, в О-полисахариде P. mirabilis ОАО присутствует D-глицеро-1 -фосфатная групп?., которая ранее была обнаружена также в О-полисахариде P. vulgaris Q\2[\S6]. Н- и 13С ЯМР-спектры полисахарида (рис. II-9 в «Приложении II», таблицы 1-17 и 1-18 в «Приложении I») содержали сигналы холина [8н 3,23 (СНз, 9Н); 8с55,3 (СНз), 61,0 и 67,5 м.д. (оба СНг); лит. данные [172] 5 55,0, 60,3 и 67,0 м.д.], причем сигналы СНг-групп были расщеплены из-за спин-спинового взаимодействия с фосфором. В спектре 31Р-ЯМР содержались сигналы двух фосфатных групп при 5 —1,7 и —2,0 м.д. В Щ,31? HMQC-спектре полисахарида наблюдались корреляции сигнала фосфатной группы при 5 —1,7 м.д. с сигналом Н-1 одного из остатков GlcNAc (5 5,37 мл-) и Н-6а,6Ь одного из остатков Glc (8 4,02 и 4,22 мл). Вторая фосфатная группа (5 —2,0 м.д.) давала корреляционные пики с Н-1 холина (5 4,48 м.д.) и с Н-3 или Н-4 GlcNAc, сигналы которых при 8 4,08 м.д. полностью перекрывались. Эти данные свидетельствовали о том, что одна из фосфатных групп соединяет O-l GlcNAc с О-б Glc, в то время как другая присоединяет остаток холина к О-З или 0-4 GlcNAc.
Деградация липополисахаридов
Штаммы Ptvteus получены из Чешской национальной коллекции типовых культур (CNCTC, Институт эпидемиологии и микробиологии, Прага) и коллекции Института микробиологии и иммунологии (ИМИ, Университет Лодзи, Польша). Выращивание бактерий, выделение ЛПС и серологические исследования О-антигенов проводились В. Кацой, А. Рожальским и 3. Сидорчиком и их сотрудниками в Центре микробиологии и вирусологии Польской академии наук и Институте микробиологии и иммунологии Университета Лодзи (Польша). Бактерии выращивали на плотной агаровой среде, содержащей питательный бульон, в аэробных условиях (37С, рН 7,4—7,6, 11 л кислорода в минуту) [261]. Бактериальную массу отделяли центрифугированием в конце логарифмической фазы роста, промывали водой и высушивали. Липополисахариды выделяли из сухих бактериальных клеток экстракцией горячим водным фенолом по методу Вестфаля [262], экстракт диализовали без разделения водного и фенольного слоев и полученные сырые препараты ЛПС очищали обработкой ДНКазой, РНКазой и Протеиназой К [229] или осаждением нуклеиновых кислот и белков ССЬСОгН [158] с последующим ультрацентрифугированием [262].
Деградацию ЛПС (100 мг) проводили нагреванием с 1% или 2% уксусной кислотой (6 мл) при 100С до выпадения осадка липида (2-4 часа), который отделяли центрифугированием (13000 х g, 20 мин). Супернатант фракционировали хроматографией на колонке (60 х 2,5 см) с гелем Sephadex G-50 (S) (Pharmacia, Швеция) в 0,05 М пиридиний-ацетатном буфере (рН 4,5), контролируя элюцию с помощью дифференциального рефрактометра (Knauer, Германия).
Продуктами кислотной деградации липополисахаридрв являлись О-полисахариды, элюирующиеся непосредственно вслед за холостым объемом колонки, и олигосахариды кора, элюируищиеся позднее. Выходы полисахаридов и условия деградации ЛПС приведены в таблице 4.3. Из-за кислотолабильности О-полисахаридов при мягком кислотном гидролизе ЛПС P. mimbilis Ol 8 и О20 высокомолекулярные фракции получены не были, и для выделения полисахаридов применяли О-дезацилирование и дезаминирование (см. ниже). Выделенные из этих ЛПС смеси олигосахаридов дополнительно фракционировали на колонке (90 х 2.5 см) с гелем TSK HW-40 (S) (Merck, Германия) в 1% АсОН для разделения олигомеров повторяющегося звена О-полисахарида, олигосахаридов кора и общего энтеробактериального антигена.
Олитосахариды кора для масс-спектрометрических исследований были получены мягким кислотным гидролизом ЛПС штаммов Proteus и выделены хроматографией на геле Sephadex G-50 (S), как описано выше, и использовались без дальнейшей отчистки. Из ЛПС P. vulgaris 019, 053,055, P. mirabilis ОАО и P. myxofaciens ОбО выделено по две олигосахаридных фракции, которые исследовались раздельно. Олигосахариды кора из некоторых штаммов не отделялись при хроматографии от общего энтеробактериального антигена, что делало их масс-спектрометрическое исследование невозможным из-за доминирования в спектрах пиков последнего. Олигосахарид кора P. mirabilis 057 в препаративном количестве был получен из ЛПС (150 мг) обработкой 2% АсОН в описанных выше условиях.
ЛПС P. mirabilis 018 и О20 (100 мг каждого) обрабатывали 12% NH4OH (6 мл) при 37С в течение 16 час. Осадок липида удаляли центрифугированием (13000xg, 20 мин), а водорастворимую фракцию разделяли хроматографией геле Sephadex G-50 (S) как описано выше. Выделенный полимер представлял собой О-полисахарид, присоединенный к кору и О-дезацилированному липиду А.
ЛПС P. mirabilis 018 и О20 (100 мг каждого) обрабатывали 1% ЫаЫОг (5 мл) в 10% уксусной кислоте (5 мл) при 25С в течение 3 час, образующийся осадок липида удаляли- центрифугированием (13000xg, 20 мин} и супернатант фракционировали хроматографией на геле Sephadex G-50 (S), как описано выше. Полученный высокомолекулярный продукт образовывался в результате разрыва связи между дезаминированным остатком гексозамина и остатком гексуроновой кислоты в области кора ЛПС.
ЛПС R-штамма P. penneri 97 (116,4 мг) дезаминировали, как описано выше, в течение 3,5 часов, из полученной смеси олигосахаридов хроматографией на колонке геле TSK HW-40 в 1% АсОН выделили тетрасахарид внешнего кора.
Полисахариды P. mirabilis 09 (18,5 мг) и P. vulgaris 037 (19,3 мг) обрабатывали 12% NH4OH (6 мл) при 37С в течение 16 час, О-дезацетилированные полисахариды выделили хроматографией на геле TSK HW-40 в 1% АсОН с последующей лиофилизацией.
Полисахариды P. mirabilis 018 (18 мг) и 038 (10 мг) дефосфорилировали обработкой 48% HF (0,2 мл) при 4С в течение 24 час в пластиковом контейнере. Кислоту удаляли лиофилизацией, улавливая HF с помощью патрона с твердым гидроксидом натрия. Гель-хроматографией продуктов на носителе TSK HW-40 выделили частично дефосфорилированный олигосахарид (10 мг) из P. mirabilis 018 и дефосфорилированный полисахарид (4,5 мг) из P. mirabilis ОЗ8. Олигосахарид из P. mirabilis 018 восстанавливали обработкой ЫаВШ в воде.
Полисахарид P. mirabilis ОЗ8 (7,5 мг) обрабатывали «магическим метанолом» (смесь метанола, хлороформа и концентрированной соляной кислоты, 10:1:1 по объему, 15 мл) в течение 7 дней при 20С с последующим упариванием и удалением остаточных количеств НС1 троекратным упариванием с метанолом (по 1,5 мл). Продукт растворили в 2 мл 1 М имидазольного буфера с рН 7,0, раствор охладили до 0С и восстанавливали ЫаВЩ (400 мг) при 0С в течение 1,5 час при перемешивании. Реакционную смесь нейтрализовали концентрированной уксусной кислотой, и после упаривания метанола восстановленный полисахарид (6,5 мг) выделили хроматографией на геле Sephadex G-50.
Полисахарид P. mirabilis ОЗ8 (27 мг) обрабатывали безводным жидким фтористым водородом в течение 1 часа при 20С, HF удалили в вакууме, поглощая его в ловушке с твердым гидроксидом натрия, продукты растворили в воде и фракционировали хроматографией на геле TSK HW-40 в 1%-ной уксусной кислоте. В результате выделены четыре соединения с выходами 4,0, 5,0 (целевой дисахарид), 1,8, и 0,9 мг в порядке элюирования с колонки.
