Введение к работе
Актуальность проблемы.
Функционирование нервной системы определяется высоко организованным взаимодействием нервных клеток, образующих развитую сеть межклеточных синаптических контактов. Синапсы служат для направленной, тонко регулируемой передачи сигналов от одной клетки к другой. Направленность передачи сигнала обеспечивается существованием специальных надмолекулярных структур в месте сипаптического контакта -пресиналтического аппарата, обеспечивающего выброс яейромедиатора путем экзоцитоза синаптических пузырьков, на одной клетке и постсинаптических рецепторних комплексов на другой клетке. Образоваїше и исчезновение синаптических контактов является регулируемым процессом, обеспечивающим организацию сложных сетей передача и обработки сигналов в мозгу.
Детальное понимание механизмов синаптической передачи и синаптогенеза требует идентификации и характеристики молекулярных компонентов синапса. Несмотря на достигнутый прогресс в этой области в течение последних лет, многие молекулы, важные для функционирования синапсов, остаются неизвестными, либо мало изучсішьіми. В наибольшей степени данное относится к пресинаптическому аппарату, который осуществляет сложные процессы регулируемого транспорта синаптических пузырьков и их слияние с клеточной мембраной.
Методические сложности изучения молекулярных механизмов выброса нейромедиаторов определяются тем, что в отличие от других биологических процессов таких как, например, ферментативные реакции или трансмембранпый транспорт ионов, реконструкция функционального прссинаптичсского аппарата in vitro остается крайне сложной и в настоящее время неосуществлешюй задачей. Выделение белковых компонентов нресшшпеа на основе легко определяемой биохимической характеристики не представляется возможным. В связи с этим, исследователями синаптической передачи были использовшгы непрямые подходы для идентификации пресинаптических белков, такие как анализ случайных и направленных мутаций в различных организмах, выделите и систематический анализ белковых компонентов синаптических пузырьков, использование пресинаптических нейротокешюв и пр.
'- ' чі'Оі-і;а
На сегодня, наше знание о структуре нресинаитинеского аппарата ограничивается коротким и, очевидно, неполным списком белков, которые предположительно участвуют в процессе выброса нейромедиаторов. Вышеизложенное позволяет заключить, что идентификация и структурно-функциональное исследование пресинаптических белков является актуальной проблемой современной физико-химической биологии. Цель и задача исследования.
Основной целью настоящей работы явилась идентификация, структурная и биохимическая характеристика ранее неизвестных белковых компонентов нресинаптического аппарата.
В качестве ключевого методического подхода к решению данной задачи было выбрано использование природного нейротоксина альфа-латротокешга (далее - латротоксина) в качестве инструмента исследования. Латротоксин, белковый компонент яда паука каракурта, является одним из наиболее мощных стимуляторов синаптическои передачи, увеличивающим частоту спонтанного экзоцитоза синаптических пузырьков. Действие латротоксина определяется высокоспецифичным взаимодействием с поверхностными белковыми рецепторами, расположенными на поверхности нервных клеток.
На первом этапе работы была поставлена задача выделения данных рецепторов и их первичная характеристика белковым электрофорезом. При этом учитывалось, что возможно также со-выделение белков, не являющихся непосредственно рецепторами токсина, но специфически взаимодействующих с ними, а также примесных белков, не имеющих отношения к рецепторам.
В связи с этим, на втором этапе работы планировалось идентифицировать выделенные белки по их аминокислотной последовательности, получить антитела к ним и определить их роль в рецепции латротоксина. Ключевой задачей на этом этапе стало клонирование структурных генов ранее неизпестных белков, определение их нуклеотидной последовательности, и функциональная экспрессия в эукариотических клетках.
Целью следующего этапа исследования стало определение мембранной топологии и доменной структуры найденных рецепторов путем компьютерного анализа их аминокислотной последовательности в сочетании с иммунохимическим анализом. Также была
поставлена задача определения участков связывания латротокснна в полппептидных цепях рецепторов.
В ходе данной работы был открыт рецептор, являющийся представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии. Было показано, что данный рецептор, кодируемый одним геном, состоит из двух субъедщщц. В связи с этим, была поставлена отдельная задача по детальному изучению механизмов эндогенного протсолиза данного рецептора с целью определения участка расщепления и локализации клеточного отдела данного процессинга. Научная новизна работы.
В процессе исследования разработана оригинальная методика и осуществлено выделение рецепторов латротокснна и ассоциированных белков аффинной хроматографией. Впервые установлено, что латротокенн имеет три белковых рецептора в нервных тканях: нейрексин или кальций-зависимый рецептор, CIRL (C_alcium-Independent Receptor of Latrotoxin - кальций-независимый рецептор латротокснна), являющиеся ранее неописанными белками, и тирозин-фосфатазу сигма РТРа. Интересно, что данные рецепторы не имеют между собой заметной структурной гомологии и принадлежат к трем различным классам рецепторов поверхности клетки. Нейрексин является белком клеточной адгезии с одним трансмембранным сегментом, CIRL - G белок-сопряженным рецептором, а РТРа -мембршшой тирозин-фосфатазой.
На основе информации о частичной аминокислотной последовательности осуществлено клонирование полноразмерной кДНК рецептора CIRL. По определенной нуклеотидной последовательности выведена аминокислотная последовательность состоящая из 1471 остатка. Клошірованьї также два близких гомолога CIRL - CIRL-2 и CIRL-3. Показано, что CIRL-1 и CIRL-3 экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как CIRL-2 встречается практически во всех тканях. Установлено, что рецепторы CIRL принадлежат семейству 11(B) G-белок-сопряжснных рецепторов. В составе большой внеклеточной части CIRL идентифицированы домены характерные для белков клеточной адгезии: лектнновый, олфактомедшювый и муциновый. Таким образом, CIRL является представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии.
Экспрессией CIRL и РТРа в эукариотических клеточных линиях и хромафшшых клетках доказано, что клонированные CIRL и РТРа являются функционально-активными рецепторами латротоксина. Направленным мутагенезом определено расположите основных участков связывания латротоксина в CIRL и РТРа.
Впервые установлено, что CIRL, кодируемый одним геном, состоит из двух различных нековалентно связанных субъединиц - р120 и р85, что необычно для G-белок-сопряженных рецепторов. Обнаружена растворимая форма CIRL представляющая собой комплекс внеклеточной субъедшпщы р120 и короткого пептидного N-концевого фрагмента р85. Показано, что двухсубъединичная структура CIRL является следствием эпдогенного внутриклеточного протеолиза и определен сайт расщепления рецептора.
Установлено, что сайт протеолиза находится внутри цистеин- и триптофан-богатого домена с ранее неописашшш структурным моятом, присутствующим в семействе природных гибридов G белок-сопряжешплх рецепторов и белков клеточной адгезии. Поскольку мутации в этом домене приводят к устойчивости CIRL к расщеплению, предложено присвоить данному мотиву наименование GPS (G protein-coupled receptor Proteolysis Site). Практическая ценность работы.
Полученные результаты имеют не только научное, но и прикладное значение. Основная масса широко используемых в настоящее время лекарств, в качестве мишеней, используют G белок-сопряженных рецепторы. Поэтому, каждый вновь открытый G белок-сопряженный рецептор представляет собой потенциальный объект для создания новых лекарств. Структурный и предварительный функциональный анализ CIRL позволяет предположить, что химические соединешга, являющиеся его агонистами либо антагогаютами, могут быть использованы для лечения неврологических и психических заболеваний сопровождающиеся нарушениями нейросекреции. Также возможно, что модуляция активности членов семейства рецепторов CIRL позволит контролировать рост злокачествешгых опухолей. В связи с потенциальной практической важностью рецептора CIRL, на его открытие был получен патент. Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на 17 Съезде нейробиологов США (Лос-Анжелес, 1998), Совещании по механизмам передачи сигналов с участием G белков (Ныо-
Йорк, 2000), Конференции «Яды животных» (Гамбург, 2000), 19 Съезде нейробиологов США (Новый Орлеан, 2000), Гордоновской конверенции «Молекулярная Фармакология» (Вентура, 2003), 6 Международной Энгельгардтовской конференции (Санкт-Петербург-Москва, 2003), Конференции по G-белок связанным рецепторам (Торонто, 2003). Публикации.
Диссертация обобщает данные 25 основных публикаций. Личный вклад автора.
Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке и проверке предложенных в работе экспериментальных подходов, обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. Весь экспериментальный материал получен автором и непосредственно руководимыми им сотрудниками его лаборатории, за исключением экспериментов по функциональной экспрессии рецепторов латротокспна в хромафшшых клетках, вьшолиеных Проф. Р. Хольцом и Д-ром М. Биттнср (University of Michigan School of Medicine, Ann Arbor, MI), а также поиска клонов кДНК нейрекешюв, вьшолнетшіх Проф. Т. Зюдофом и Д-ром 10. Ушкаревым (UT Southwerstern Medical Center, Dallas TX). Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемрй литературы, содержащего наименования. Диссертация содержит 41 рисунок и 1 таблицу.
