Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ 1. Природные а-конотоксины и их синтетические аналоги в исследовании никотиновых ацетил-холиновых рецепторов. (Литературный обзор).
Глава 1. Химическое строение, пространственная организация и специфичность действия а-конотоксинов 15
Глава 2. Области взаимодействия а-конотоксинов и нАХР
12 1 Синтетические аналоги а-конотоксинов 20
1 2 2 Мутации в нАХР и парные мутации в а-конотоксинах и нАХР 24
1.2 3 Модели комплексов а-конотоксинов с нАХР, построенные на основе пространственной структуры ацетилхолин-связывающего белка 24
РАЗДЕЛ 2. Исследование лиганд-связывающих участков рецепторов нейротрансмиттеров с помощью природных и химически модифицированных нейропептидов и нейротоксинов. (Результагы работы и их обсуждение).
Глава 1. Получение биотинилированных и фотоактивируемых аналогов вещества Р и изучение их взаимодействия с нейрокининовыми и никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами ..29
2.1 1 Метод обнаружения рецептора вещества Р на основе биотин-стрептавидиновой системы 29
2 1 2 Исследование взаимодействия рецептора вещества Р с антителами к его синтетическим фрагментам и к веществу Р .32
2 1 3 Тестирование рецептора вещества Р с использованием радиоактивной формы его низкомолекулярного антагониста 34
2 1 4 Анализ взаимодействия рецептора вещества Р с токсическими компонентами ядов змей. 36
2 1 5 Получение и характеристика фотоактивируемых производных вещества Р с метками в iV-концевой части молекулы 37
2 1 6 Заключение. 40
Глава 2 Синтез новых фотоактивируемых производных а-неиротоксинов из ядов кобр 41
22 1 Получение и характеристикабензофеноновых производных ШII 41
2 2 2 Изучение зависимости параметров мечения нАХР Т cahfornica фотопроиз водными нейротоксина от химической природы введенной фотогруппы 44
2 2 3 Заключение 46
Глава 3 Получение природных и модифицированных а-конотоксинов и изучение их связывания с нАХР Т cahfornica . 49
2 3 1 Твердофазный пептидный синтез а-конотоксинов 49
23 2 Получение и характеристика радиоактивных производных а-конотоксинов 51
2 3 3 Получение фотоактивируемых аналогов а-конотоксинов GI и Ml и их взаимодействие с нАХР Т cahfornica 55
2 3 4 Локализация фрагментов нАХР Т cahfornica, взаимодействующих с радиоактивным фотоактивируемым аналогом а-конотоксина GI 74
2 3 5 Изучение влияния заряженных аминокислотных остатков в а-конотоксинах мышечного типа на сродство к нАХР Т cahfornica . ... 83
Глава 4 Синтез природных и модифицированных а-конотоксинов, взаимодействующих с нейрональными а7 нинотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами 89
2 4 1 Получение гетерологически экспрессированных в Е coh внеклеточных доменов а7 нАХР крысы и характеристика их физико-химических и связывающих свойств 92
2 4 2 Оценка роли отдельных элементов а-конотоксинов GI и Iml, определяющих их специфичность . 97
2 4 3 Синтез аналогов а-конотоксина PnIA и характеристика их действия на
полноразмерных а7 холинорецептора 100
Глава 5 Взаимодействие а-конотоксинов с ацетилхолин-связывающими белками. 103 Глава 6 Рентгеноструктурный анализ комплекса а-конотоксина [A10L,D14K]PnIA с АХСБ A cahformca с разрешением 2 4 А . „108
Глава 7 Моделирование пространственных структур комплексов а конотоксинов и а-нейротоксинов с различными типами холинорецепторов 111
РАЗДЕЛ 3. Экспериментальная часть 118
3.1. Материалы 118
3 1 1 Реактивы 118
3 12 Пептиды, токсины, ферменты 118
313 Биологические материалы 119
3 14 Расходные материалы .119
3.2. Методы 119
32 1 Твердофазный синтез пептидов .119
3 2 2 Получение аналогов вещества Р, а-нейротоксинов из яда змей и а-конотоксинов 122
323 Получение радиоактивных соединений 124
3 24 Получение конъюгатов на основе полимерной пероксидазы 126
3 2 5 Тестирование рецептора вещества Р крысы на основе биотин стрептавидиновой системы .126
3 26 Получение поликлональных антител и их очистка 127
32 7 Взаимодействие антител с рецептором вещества Р крысы 128
3 28 Синтез аффинных сорбентов 129
3 2 9 Аффинная очистка рецептора вещества Р крысы 129
3 2 10 Очистка токсических компонентов ядов змеи и их взаимодействие с рецептором вещества Р крысы 130
3 2 11 Вьщеление, характеристика и ренатурация субъединиц нАХР Т cahformca 130
3 2 12 Получение внеклеточных доменов а7 нАХР крысы и их характеристтика 131
3 2 13 Радиолигандный анализ . 133
3 214 Метод изотермической титрующей калориметрии 136
3 2 15 Электрофизиологические эксперименты 136
3 2 16 Подбор условий фотоактивации для различных фотоактивируемых лшандов . 136
3 2 17 Эксперименты по фотомечению 137
3 2 18 Локализация фрагментов субъединиц нАХР, меченных [ I]rGI(Bpa12),
методами ферментативного протеолиза 139
3 2 19 N-концевое сиквенирование . 139
3 2 20 Кристаллография и рентгеноструктурный анализ 140
3 2 21 Компьюіерное моделирование 141
Выводы 143
Благодарности 145
Список литературы 146
- Области взаимодействия а-конотоксинов и нАХР
- Синтез новых фотоактивируемых производных а-неиротоксинов из ядов кобр
- Синтез природных и модифицированных а-конотоксинов, взаимодействующих с нейрональными а7 нинотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами
- Моделирование пространственных структур комплексов а конотоксинов и а-нейротоксинов с различными типами холинорецепторов
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Изучение на молекулярном уровне функционирования центральной нервной системы млекопитающих и механизмов протекающих в ней разнообразных процессов, среди которых передача нервного импульса один из важнейших, является основной задачей неирохимии и нейробиологии Главную роль в этих процессах играют неирорецепторы, нарушение работы которых приводит к различного рода тяжелым нейродегенеративньш заболеваниям.
Ключом к пониманию механизмов функционирования природных нейрорецепторов является знание их пространственной организации и в первую очередь структуры лиганд-связывающих доменов Из-за сложной организации (большие размеры, много-субъединичность), а также лабильности этих мембранных белков, использование современных высокоразрешающих методов структурных исследований (ЯМР, кристаллография) являеіся крайне трудным и приходится искать иные пути
Один из таких подходов - поиск или синтез новых высокоэффективных и селективных лигандов нейрорецепторов, с помощью которых (вводя в них модифицирующие группы - радиоактивные, фотоактивируемые) можно не только идентифицировать фармакологически различающиеся подтипы нейрорецепторов, но и проводить картирование их лиганд-связывающих участков
Второй подход заключается в получении или поиске «упрощенных» вариантов нейрорецепторов, сохраняющих тем не менее основные функциональные характеристики полноразмерных природных белков Речь здесь может идти как об отдельных субъединицах или гетерологически экспрессированных доменах нейрорецепторов, так и о поиске их природных гомологов, для которых уже сегодня возможно применение современных методов ЯМР или кристаллографии
Оба этих направления в полной мере применимы к присутствующим в ЦНС нейрокининовой и холинергической рецепторным системам. Последняя характеризуется наличием большого количества подтипов нейрональных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) и вызывает в последнее время особый интерес Этот интерес обусловлен обнаруженной связью некоторых нейродегенеративных расстройств и психических патологий (болезни
Паркинсона, Альцгеймера, ишзофрения) с тем или иным нарушением в функционировании разных подтипов нАХР, что вызывает в свою очередь необходимость надежной детекции этих подтипов в мозге.
Существование большого количества соединений самой разной природы (от низкомолекулярных веществ до белковых токсинов), взаимодействующих с нАХР, делает весьма перспективным поиск и синтез на их основе нового поколения холинергических лшандов Среди них особое место в последнее время занимают а-конотоксины - короткие нейротоксические пептиды морских моллюсков, удобные для синтеза и изначально обладающие повышенной специфичностью к разным подтипам холинорсцепторов Поэтому получение и характеристика новых аналогов этих пептидов представляется важной научной задачей
Мощным стимулом в выяснении структурно-функциональной организации холинорецепторов стало выделение и установление кристаллической структуры одного из ацетилхолин-связывающих белков (АХСБ), пространственных гомологов экстрацеллюлярных доменов всех нАХР Использование этих водорастворимых белков вместе с набором новых синтезированных холинергических лигандов для получения кристаллических структур их комплексов является исключительно актуальной не только научной, но и практической задачей На основе таких данных методами компьютерного моделирования можно с высокой достоверностью реконструировать детальную структуру лиганд-связывающих участков природных нАХР и создавать их новые более эффективные и селективные лиганды.
Цель и задачи исследования.
Целью работы была структурно-функциональная характеристика лиганд-связывающих участков нейротрансмиттерных рецепторов с использованием их природных и модифицированных лигандов. Объектами исследования служили рецептор вещества Р и никотиновые холинорецепторы
В ходе данной работы решались четыре основные задачи 1 Синтез разнообразных производных и аналогов на базе вещества Р, а-нейротоксинов и а-конотоксинов и их развернутая структурная и биохимическая характеристика для выявления наиболее эффективных и перспективных лигандов
Получение и определение лиганд-связывающих характеристик различных вариантов и форм исследуемых рецепторов, включающих нативные и солюбилизированные формы природных рецепторов, а также отдельных субъединиц, гетерологически экспрессированных лиганд-связывающих доменов субъединиц холинорецепторов и их природных гомологов -ацетилхолин-связывающих белков (АХСБ)
Разработка, оптимизация условий и применение методов установления структурной организации лиганд-связывающих участков нейрорецепторов -фотоаффинной модификации для природного холинорецептора и кристаллографии для АХСБ
Применение, на базе полученных рентгеноструктурных данных комплекса АХСБ с аналогом а-конотоксина, методов компьютерного анализа для создания моделей лиганд-связывающих доменов природных холинорецепторов разных типов и подтверждение их соответствия экспериментальным данным, полученным в других исследованиях
Научная новизна и практическая ценность работы.
В процессе выполнения работы был впервые разработан новый нерадиоактивный метод тестирования рецептора вещества Р в мозге млекопитающих Синтезировано и охарактеризовано большое количество новых соединений - радиоактивных, фотоактивируемых и иных аналогов вещества Р, а-нейротоксинов и а-конотоксинов С использованием ряда аналогов впервые показано, что участки связывания на природном нАХР электрического органа ската Torpedo cahformca для а-нейротоксинов и а-конотоксинов перекрываются, но не идентичны Введением дополнительного положительного заряда в С-концевую часть а-конотоксинов мышечного типа получены аналої и, обладающие более высоким сродством, чем природные пептиды, к обоим участкам связывания на рецепторе С использованием фотоактивируемых лигандов показано участие Л^-концевого фрагмента вещества Р в связывании со своим рецептором Подтверждено связывание а-нейротоксинов и а-конотоксинов на участках контакта а/у и а/8 субъединиц природного нАХР Т cahformca и впервые проведена методом фотоаффиннои модификации локализация фрагментов а- и у-субъединиц этою рецептора, участвующих в связывании фотоаналога а-конотоксина Получены генно-инженерные конструкции для различных вариантов экстрацеллюлярных доменов холинорецепюров, проведена бактериальная экспрессия и получены белки, сохранившие ряд фармакологических свойств полноразмерных нАХР. Впервые исследовано взаимодействие ряда а-конотоксинов и их новых аналогов с двумя видами АХСБ Впервые получен новый высокоэффективный аналог сс-конотоксина нейронального типа, обладающий высоким сродством к АХСБ и а7 нАХР, который также различал подтипы сс7-подобных холинорецепторов на идентифицированных нейронах прудовика Впервые получена кристаллическая структура высокого разрешения для комплекса этого аналога с АХСБ и таким образом установлена пространственная организация лиганд-связывающих участков в комплексе с антагонистом
Практический аспект данной работы связан с получением и биохимической характеристикой новых соединений, которые моїут претендовать на роль высокоэффективных и селективных лигандов разных подтипов холинорецепторов, некоторые из которых связаны с рядом нейрональных заболеваний Цели создания лекарств нового поколения на базе холинергических лигандов может служить и установление в данной работе детальной организации лиганд-связывающих участков ацетилхолин-связывагащего белка
Апробация полученных результатов.
Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях II и Ш-м Съездах биохимического общества РАН (Москва, 1997, С -Петербург, 2002), IV, V и VI-x чтениях, посвященных памяти академика Ю А Овчинникова (Москва - Пущино, 1998, 2000, 2002), 12 и 13-й конференциях Европейского общества нейрохимии (С-Петербург, 1998, Берлин, Германия, 1999), X и XIV-й зимних Международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 1998, 2002), 2-м Съезде биофизиков России (Москва, 1999), ХП-й Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005); I и И-м Российском симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; С -Петербург, 2005), 8-м Швейцарском семинаре по методологии в рецепторних исследованиях (Моршах, Швейцария, 1998), ХШ-м и XV-м Международных съездах по животным, растительным и микробным токсинам (Париж, 2000, Глазго, Шотландия, 2006), 27-м Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002); XI и ХП-м Международных симпозиумах по холинергическим механизмам (С.-Мориц, Швейцария, 2002, Аликанте, Испания, 2005), 7-м Международном симпозиуме по биомолекулярной химии (Шеффилд, Великобритания, 2004), 30-м Съезде FEBS (Будапешт, Венгрия, 2005), 7-й зимней конференции по нейрохимии (Сольден, Австрия, 2005); на конференции «Нейрохимия фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), Гумбольдтовской конференции «Биомедицинские науки 2001» (Москва, 2001) и симпозиумах «Нейрональные никотиновые рецепторы от структуры к терапии» (Венеция, Италия, 1999), «Центральная и периферическая синаптическая передача» (Варна, Болгария, 2005)
Публикации по теме работы.
По материалам диссертации опубликовано 25 статей в отечественных и зарубежных журналах и сборниках
Личный вклад автора.
Автору принадлежит основная роль в выборе направления исследований, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, а также в интерпретации полученных результатов и оформлении их в виде публикаций Весь обсуждаемый в диссертации экспериментальный материал был получен лично автором или руководимыми им студентами и аспирантами, за исключением опытов на идентифицированных нейронах прудовика, выполненных группой в н с Е А Вульфиус (Институт биофизики клетки РАН, Пущино) В работах, выполненных в соавторстве с сотрудниками лабораторий ИБХ РАН (спектрального анализа) и других институтов РАН (Молекулярной генетики), а также с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался либо в прямом проведении экспериментальных исследований, либо в обсуждении и литературном оформлении полученных результатов
С груктура и объем диссертации.
Работа изложена на 169 стр машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, результатов работы и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 264 ссылки Диссертация содержит 41 рисунок и 15 таблиц
Области взаимодействия а-конотоксинов и нАХР
В Табл 2 приведены синтетические аналоги а-конотоксинов, действующих на нАХР мышечного и нейронального типов В ранних работах аналоги получали для традиционных структурно-функциональных исследований [59, 61, 104-114] Так, в частности, была показана роль Arg9 а-конотоксина GI в проявлении им биологической активности [30, 108] В свете установленных пространственных структур а-конотоксинов полученная с помощью синтетических аналогов информация позволяла понять, какие участки поверхности молекулы а-конотоксинов вовлечены во взаимодействие с различными типами нАХР. Для этих же целей проводились и немногочисленные синтезы и исследования изомеров с замыканием S-S-связей, отличным от природного, а также аналогов а-конотоксинов с нарушенным расположением остатков Cys в аминокислотной последовательности или их модификации [82, 85,117-122, данная работа] Полезная информации была получена с помощью фотоактивируемых производных а-конотоксинов Такие производные получали либо модификацией фотоактивируемой группой синтетических а-конотоксинов с природной структурой [42, 111, 126, данная работа], либо включением фотоактивируемой аминокислоты (и-бензоилфенилаланина) в ходе пептидного синтеза [125, 126, данная работа] С использованием фотоактивируемых производных а-конотоксинов было показано, что во взаимодействии с нАХР Т californica принимают участие остатки N- и С-концевых фрагментов молекулы а-конотоксина, а само связывание происходит в областях контакта субъединиц [42, 126, данная работа] В различных лабораториях были получены радиоактивные производные а-конотоксинов для радиолигандного анализа (в тритированной или [1251]йодированной формах) [37, 42, 125-129, данная работа]
В последнем случае это достигалось введением изотопа йода по остаткам Туг и His [37, 125-127, данная работа] Интересно, что введение второго атома йода по остатку Тугі 2 в а-конотоксине Ml приводило к тому, что полученный аналог приобретал способность связываться с участком а/б в нАХР Т californica практически необратимо [112] Различия в эффективности образования фотоиндуцированных сшивок по а/у- и а/б-участкам наблюдалось и между моно- и ди-йодированными фотоактивируемыми производными а-конотоксинов GI и Ml [126, данная работа] Необходимое для радиолигандного анализа производное а-конотоксина МП было получено с помощью введения остатка Туг перед Glyl и его последующего йодирования [128] В случае а-конотоксина Iml с этой же целью была произведена замена W10Y, полученный затем йодированный аналог согласно данным электрофизиологических опытов имел то же сродство к а7-нАХР, что и природный Iml [111] Введение по Л -концу а-конотоксина МП остатка жирной кислоты не повлияло на его активность, тогда как аналогичное замещение остатка Asn5 привело к утрате активности [135] Задача этой работы [135] состояла в том, чтобы получить производное, для которого выше вероятность проникновения через гематоэнцефалический барьер Следует отметить, что конотоксины и конопептиды, хотя это и кажется парадоксальным, представляют собой потенциальные лекарства Блокатор Са -каналов ю-конотоксин (торговое название «зиконитид») уже используется в клинике против хронической боли. Ожидается использование в качестве антиэпилептических средств конантокинов, линейных пептидов из улиток Conus, являющихся блокаторами NMDA-рецепторов Имеются указания на то, что и некоторые а-конотоксины моїут найти применение в качестве анальгетиков [138] В конце Табл 2 приведены также два аналога, цель синтеза которых состояла в том, чтобы оценить, в какой мере существенны размеры первой и второй петли между остатками цистеина в молекулах а-конотоксинов GI и Iml для проявления ими мышечной и нейрональной активности, соответственно [115, данная работа] С этой же целью была синтезирована и химера этих а-конотоксинов Как уже отмечалось, исследования синтетических аналогов показали важную роль положительных зарядов а-конотоксинов мышечного действия [30, 108, 113] С учетом этого была получена серия аналогов, в которые дополнительно включали положительно заряженные остатки лизина или аргинина Было установлено, что введение положительного заряда в С-концевую область значительно увеличивает сродство а-конотоксинов к нАХР Т cahfornica Этот эффект наиболее ярок для а-конотоксина SIA, в котором на остаток Lys был заменен остаток Aspl2 [116, данная работа] Аналогичная замена Aspl4Lys увеличила и сродство "двойного мутанта" [A10L,D14K]PnlA к сс7-нАХР [18, данная работа] 1.2.2. Мутации в нАХР и парные мутации в а-конотоксинах и нАХР. Первые представления о том, где связываются мышечные и нейрональные а-конотоксины, были получены с использованием набора мутантных нАХР как мышечного [36, 37], так и нейронального типа [53, 55, 63, 70], выявившие, в частности, аминокислотные остатки нАХР, обуславливающие повышение сродства мышечных а-конотоксинов к а/у- или а/5-участкам [36] В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что связанные а-конотоксины должны располаї аться в пределах лиганд-связывающих центров, сформированных фрагментами А, В и С а-субъединиц, а также D, Е и F соседних не-а-субъединиц (см локализацию A-F в работе [139]). Подтверждением этому служат данные по связыванию природных а-конотоксинов и их аналогов с нАХР дикого типа и мутантами (так называемый анализ парных взаимодействий)
Например, по данным анализа парных взаимодействий, в связывании а7-нАХР с а-конотоксином PnIB определяющую роль играет взаимодействие гидрофобных остатков LeulO а-конотоксина и Тгр149 рецептора [131], в случае связывания а-конотоксина Iml с тем же а7-рецептором основной вклад обусловлен взаимодействием пары Arg7 - Туг 195 [132] Подобные исследования были проведены также с использованием аналогов мышечных конотоксинов на мышечном нАХР человека [133] и Т cahfornica [134] 1.2.3. Модели комплексов а-конотоксипов с нАХР, построенные на основе пространственной структуры ацетилхолин-связывающего белка (АХСБ). Хотя АХСБ [140] имееет не более 25% гомологии с экстрацеллюлярными доменами субъединиц нАХР, в нем содержатся практически все аминокислотные остатки, необходимые для взаимодействия с агонистами и антагонистами нАХР В частности, АХСБ из Lymnaea stagnahs с высоким сродством связывает а-бунгаротоксин [141] Так, моделируя экстрацеллюлярный домен а7-нАХР по кристаллической структуре АХСБ и учитывая данные по мутагенезу и кросс-сшивкам, была предложена модель комплекса а7-нАХР с а-кобратоксином [142] Аналогичные модели были предложены и для комплексов других длинных а-неиротоксинов с а7-нАХР и мышечными нАХР [143-146] Дополнительной информацией для построения моделей холинорецепторов служили установленные с помощью Н-ЯМР или рентгеноструктурного анализа пространственные структуры комплексов сс-нейротоксинов с фрагментами из области 180-200 а 1-субъединицы мышечных нАХР или а7-субъединицы нейронального нАХР, кроме того, использовалась кристаллическая структура комплекса а-бунгаротоксина с синтетическим пептидом, имеющим гомологию с указанным выше фрагментом нАХР [145].
Что касается а-конотоксинов, имеются данные о способности а-конотоксина Iml связываться с гетерологически экспрессированным экстрацеллюлярным доменом а7-нАХР крысы [147], однако сведения о взаимодействии а-конотоксинов с изолированными субъединицами нАХР или их синтетическими фрагментами отсутствуют Следует отметить, что до самого последнего времени не имелось сведений о способности а-конотоксинов связываться с АХСБ - этому вопросу посвящено целое исследование данной работы (см соответствующую главу в Результатах и их обсуждении) Поэтому предложенные модели комплексов а-конотоксинов с нАХР были основаны на пространственной структуре АХСБ из L stagnahs, методах докинга и с учетом известных парных взаимодействий В этих моделях, как и следовало ожидать, молекулы а-конотоксинов располагаются в районе участка связывания аюнистов Локализация таких центров связывания агонистов в области контакта соседних субъединиц (или протомеров) АХСБ, примерно на половине высоты молекулы АХСБ, была предположена на основании структуры АХСБ [140] и недавно доказана рентгеноструктурным анализом комплексов АХСБ с агонистами - никотином и карбамоилхолином [148] В работе [149] был сделан вывод о том, что участки связывания а-конотоксинов РпТВ и Iml на а7-нАХР перекрываются, но не идентичны То же, по-видимому, справедливо и для участков связывания а-конотоксинов PnIA и МП на аЗр2-нАХР [149]. В недавно опубликованной работе [55] был проведен ряд мутаций в лиганд-связывающем участке а7-нАХР и показано, что они влияют на взаимодействие рецептора с а-конотоксином 1ml, но не Imll (последний, как предполагалось ранее [88], очевидно, связывается в каком-то ином участке а7
Синтез новых фотоактивируемых производных а-неиротоксинов из ядов кобр
Нейротоксины из ядов змей являются хорошо известными инструментами изучения нАХР [10, 178] Так, с помощью а-бунгаротоксина около 30 лет тому назад впервые был выделен в индивидуальном виде нАХР из электрического органа ската [179]. Этот рецептор всесторонне исследован во многих лабораториях мира и служит моделью структурной организации всех типов нАХР (более подробно о классификации никотиновых холинорецепторов и их структуре см начало литературного обзора данной работы) В продолжение работ, проводившихся ранее в лаборатории рецепции неиропептидов Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН, были синтезированы серии новых фотоактивируемых производных сс-нейротоксинов короткого и длинного типа В частности, были получены и исследованы фотоаналоги а-нейротоксина II (НТП) короткого типа из яда N охшпа, содержащие арилазидные и нитродиазириновые группы По сравнению с ними бензофеноновые метки обладают рядом преимуществ, основные из которых, - фотоактивация в щадящих условиях (длинноволновой УФ с Х 350-365 нм), отсутствие образования в процессе облучения множественных продуктов сшивки, а также упоминавшиеся выше (см стр 37) данные о высоких процентах пришивки для некоторых лигандов, содержащих фотометки этого типа Реакцией нейротоксина II с BzBz-ONSu (см стр 37) был получен набор монозамещенных модифицированных соединении, разделенных на первом этапе ионообменной ВЭЖХ. Хроматографический профиль продуктов оказался идентичным тем, которые были получены нами ранее при использовании двух других типов фотометок с тем же а-нейротоксином [180, 181]. Тогда же были выделены в индивидуальном виде 6 монозамещенных производных и проведены опыты по локализации фотогрупп в молекулах. Основываясь на этих данных, были идентифицированы 6 новых BzBz-аналогов НТП, четыре из которых (несущих фотогруппы на Lysl5, Lys26, Lys44 и Lys46) были выделены в достаточных для дальнейшей работы количествах. Для разделения двух последних аналогов была использована дополнительная стадия ионообменной ВЭЖХ.
Расположение соответствующих а. о. лизинов в пространственной структуре НТП представлено на Рис. 6. Полученные на следующем этапе [ 1]йодированные производные этих аналогов были исполыованы для фотомечения мембрано-связанного нАХР Т califormca Для всех соединений было показано образование специфических (подавляемых избытком немодифицированного НГП) кросс-сшивок со всеми субъединицами рецептора, однако их выходы оказались крайне низкими (Табл 5) Наиболее эффективным фотолигандом было К (В/В/)-производное, но даже детектирование 6% его количества от связавшегося с рецептором, встроенного в одну из субъединиц, весьма далеко от 50-ти - 70-ти процентных ковалентных сшивок, сообщаемых рядом авторов для некоторых бензофенон-содержащих лигандов [170, 183] В целом, данные Таблицы 5 подтверждают выводы о многоточечном характере взаимодействия а-нейротоксинов с нАХР, что возможно только в случае, если участки связывания располагаются в областях контактов субъединиц рецептора Следствием этого является и очевидная зависимость картины и особенно эффективности мечения разных субъединиц от расположения фотометки на различных участках аминокислотной последовательности токсина Поскольку нам не удалось при использовании бензофеноновых аналогов а-нейротоксина II добиться высоких процентов ковалентного встраивания в рецептор, было проведено отдельное исследование роли химической природы модифицирующей фотогруппы на картину и эффективность мечения субъединиц рецептора Для этой цели был использован а-нейротоксин длинного типа из яда N kauothia - а-кобратоксин (СТХ) В отличие от токсинов короткого типа, представители этой подгруппы змеиных ос-токсинов обладают высоким сродством к никотиновым рецепторам не только мышечного, но и нейронального типа [10, 11] Были использованы 4 вида фотометок - я-азидобензоильная (AzBz), n-азидо-тетрафторбензоильная (A/FBz), w-бензоилбенюильная (BzBz) и п-[3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил]бензоильная (DzBz) Ионообменная ВЭЖХ продуктов реакций ос-кобратоксина с эфирами соответствующих бензоильных кислот выявила практически одинаковые хроматографические профили во всех четырех случаях
Особенностью реакций химической модификации СГХ (в сравнении с НТП) явилось образование преимущественно одного монозамещенного производного Локализация фотогруппы в этом производном была проведена с помощью трипсинолиза для азидобензоильного соединения. Масс-спектрометрический анализ его ВЭЖХ-очищенных триптических фрагментов (в контроле был использован немодифицированный СТХ) показал расположение фотогруппы на Lys23 Для каждого из полученных фотоаналогов подбирались оптимальные условия фотоактивации, при этом были использованы два источника УФ света с максимумом эмиссии при 254 и 365 нм Варьировались времена облучения, температура (0 или 25С), условия (наличие или отсутствие инертного газа над облучаемым раствором), а полнота прохождения фотолиза отслеживалась анализом на офВЭЖХ Оказалось, что для полной фотоактивации DzBz-аналога достаточно 15-ти минутного облучения длинноволновым УФ, в то время как для азидобензоильных аналогов для полного фотолиза требуется больше времени При этом, существенное уширение пика свидетельствовало об образовании множественных продуктов Однако даже 30-ти минутное облучение при ктах 365 нм BzBz-производного СТХ не вызывало никаких изменений в хроматографической картине, что вероятнее всего может быть объяснено легкой обратимостью перехода фотоиндуцированного бирадикального триплета в исходную бензофеноновую структуру Исходя из полученных результатов, опыты
Синтез природных и модифицированных а-конотоксинов, взаимодействующих с нейрональными а7 нинотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами
Исследование второй группы а-конотоксинов, действующих на холинорецепторы нейронального типа, представляет сегодня особый интерес Уже упоминалось, что нарушения нормального функционирования некоторых подтипов нейрональных нАХР, вызванных мутациями или изменением уровня их экспрессии, приводит к разнообразным нейродегенеративным расстройствам и ряду других заболеваний. В частности, к настоящему времени показано, что болезнь Альцгеймера сопровождается низкой экспрессией в мозге холинорецептора а7 типа [2], а его избыточная экспрессия наблюдается в малых клетках легочной карциномы у курильщиков [202] Также выявлено участие этого типа холинорецептора в ангиогенезе и регуляции иммунных реакций [203, 204] сс-Конотоксин Iml был первым, для которого показано высокое сродство к а 7 нАХР [51] Позднее выяснилось, что он не столь специфичен, действуя и на другие подтипы нейрональных холинорецепторов, и, кроме того, обладает заметной видоспецифичностыо [55, 56] (стр 18) Поэтому и сегодня, весьма актуален поиск более селективных и эффективных лигандов нейрональных нАХР среди конотоксинов и их аналогов
На этом пути есть, однако, дополнительное препятствие Пока еще не выявлены природные источники (подобные электрическому органу ската, содержащему в высоких концентрациях исключительно один тип холинорецептора), которые могли бы служить основой фармакологического тестирования лигандов на их специфичность к конкретному подтипу нейрональных нАХР Одним из решений этой проблемы является гетерологическая экспрессия полноразмерных нАХР в различных линиях клеток или ооцитах (см , например, [205, 206]) Второе направление - это получение и использование вместо полноразмерных рецепторов гетерологически экспрессированных лиганд-связывающих доменов В случае успеха такой подход дает хороший шанс использовать полученные белки в структурных исследованиях (ЯМР, рентгеноструктурный анализ) для изучения пространственной организации лиганд-связывающих участков холинорецепторов Несмотря на то, что проблема получения таких «укороченных» продуктов, не содержащих «мембранной» части, но обладающих при этом способностью сохранять свою биологическую активность и фармаколоіическую специфичность кажется весьма серьезной, такого типа исследовательские работы проводятся несколькими научными лабораториями [207-209]. Принципиальная возможность узнавания холинергическими лигандами не только полноразмерных природных или гетерологически экспрессированных рецепторов, но и их составляющих была продемонстрирована нами ранее на примере очищенных и затем ренатурированных отдельных субъединиц нАХР Т cahfornica После выделения в денатурирующих условиях препаративної о SDS-ПААГ солюбилизированных субъединиц рецептора проводилась их доочистка офВЭЖХ на колонке Waters Delta Рак С4 (3 9 х 150 мм) (Рис 26). Этот способ позволил выделить в индивидуальном виде все 4 субъединицы холинорцептора, полностью отделив, в частности, рапсин (см стр. 40 и 76) от а-субъединицы нАХР (Рис. 26а; пики AI и AII(a,b), соответственно) и Р-субъединицу АТФазы [210] от 8-субъединицы нАХР (Рис 26г, пики DI/DII и DIII(a,b), соответственно), элюирующихся в геле рядом Чистота хроматографически очищенных продуктов проверялась аналитическими электрофорезами, а структурное соответствие -MALDI масс-спектрометрией и JV-концевым сиквенированием (Табл 11) Была проведена ренатурация выделенных таким образом а- (пик АИЬ), у-(пик CII+CIH) и 8- (пик DUIa) субъединиц нАХР Т. cahfornica в водный 1% октил-p-D-глюкопиранозид При этом а-субъединица рецептора специфически взаимодействовала с [251]йодированным а-бунгаротоксином с K j = 28 + 8 нМ [211] Однако связывания с у- и 8- субъединицами, образующими в природном рецепторе два лиганд-связывающих участка с двумя а-субъединицами, обнаружено не было
Это обстоятельство указывает на важность формирования (в отношении у- и 8-) сочленения двух смежных субъединиц (или их экстрацеллюлярных доменов) нАХР мышечного типа для взаимодействия с конкурентными антагонистами Нами были проведены работы по получению в препаративных количествах гетерологически экспрессированного в Е coli внеклеточного домена а7 нАХР крысы Учитывая вероятные сложности получения этого рекомбинантного продукта в виде водорастворимого и неагрегированного белка [212, 213], мы проводили его экспрессию также и в составе различных гибридных белков В качестве белков-носителей использовали мальтозу-связывающий белок (МВР) или глутатион-Б-трансферазу (GST) [214-216] Кроме того, в качестве дополнительного шага, который мог бы привести к снижению степени аїрегированности конечною продукта, в последовательность ос 7 домена вводилась мутация C116S по единственному а о Cys, не образующему дисульфидной связи. Схематические структуры использованных рекомбинантных белков представлены на Рисунке 27.
Моделирование пространственных структур комплексов а конотоксинов и а-нейротоксинов с различными типами холинорецепторов
Установление вышеописанной кристаллической структуры, а также появление в 2005 году данных рентгеноструктурного анализа с разрешением 4.2 А для АХСБ L. stagnalis в комплексе с а-кобратоксином [224] и электронно микроскопической структуры (4 А) для нАХР Т. marmorata [223] сделали возможным моделирование комплексов как а-нейротоксинов, так и а-конотоксинов с различными типами нАХР. Первым этапом было моделирование (с использованием различных программ докинга) комплексов ос-конотоксинов [A10L]PnIA и [A10L,D14K]PnIA с АХСБ L. stagnalis и A. califomica. Эта работа подтвердила адекватность использования подхода и позволила выявить те остатки АХСБ L. stagnalis, которые ответственны за более эффективное взаимодействие с этим белком аналога, имеющего замену D14K. Согласно рассчитанной модели, в комплексе с АХСБ L. stagnalis аминокислотный остаток Lysl4 аналога [A10L,D14K]PnIA образует солевую связь с GlullO белка, тогда как в комплексе с АХСБ А. califomica боковая цепь Lysl4 экспонирована в растворитель (Рис. 38а). Поскольку оба аналога а-конотоксина PnIA, как показано в электрофизиологических экспериментах, являются эффективными антагонистами а7 нАХР, следующим этапом был докинг этих молекул на модели а7 нАХР, построенной с учетом рентгеноструктурных данных для комплекса АХСБ с [A10L,D14K]PnIA (Рис 386) Полученные результаты создают основу для дизайна новых ос-конотоксинов, имеющих более высокое сродство и избирательность к этому рецептору.
На заключительном этапе на основании данных электронной микроскопии для нАХР Т marmorata нами была построена модель экстрацеллюлярного домена нАХР Т cahformca (на котором в настоящей работе выполнены все исследования связывания а-нейротоксинов и а-конотоксинов), где положение С-петли бралось из пространственной структуры комплекса АХСБ A cahformca с [A10L,D14K]PnIA Докинг в этой модели а-конотоксина [D12KJSIA показал, что наиболее вероятной причиной резкого возрастания сродства к рецептору при введении замены D12K (см Табл 10 и Рис. 25) является образование ионной пары с остатком GIu57, принадлежащем у-субъединице (Рис. 39) Проведенный аналогичным образом докинг фотоактивируемых Вра-аналогов а-конотоксина GI, исходя из имеющихся для них данных П-ЯМР (Рис 14), выявил причины, по которым GI(Bpa4)-aHajior не связывается с нАХР Т cahformca Для эффективно взаимодействующего с этим рецептором аналога GI(Bpa12) была установлена возможность двух ориентации а-конотоксина в связывающем центре (Рис 40), что хорошо согласуется с выявленными в эксперименте фотоиндуцированными кросс-сшивками с С-петлей а-субъединицы, а также с D- и F-сегментами у-субъединицы (стр. 78-83) Хотя имеющаяся в литературе кристаллическая структура (сравнительно невысокого разрешения в 4 2 А) комплекса АХСБ L stagnahs с а-кобратоксином [224] позволяет моделировать комплексы а-нейротоксинов длинного типа с а7 нАХР и нАХР мышечного типа, моделей связывания а-нейротоксинов короткого типа с нАХР Torpedo, которые учитывали бы упомянутые выше данные рентгеноструктурного анализа и крио-электронной микроскопии, в литературе не было
Построение модели комплекса такого токсина, а-нейротоксина II, проводилось с учетом в процессе докинга массива накопленных в нашей лаборатории данных о контактах фотоактивируемых меток (находящихся на идентифицированных остатках молекулы НТО) с субъединицами нАХР Т. californica [27, 180, 181, 225-228], а также литературных данных о влиянии мутаций в гомологичных коротких а-нейротоксинах на связывание с рецептором [229-231]. Результаты анализа отобранных комплексов методами молекулярной динамики сопоставляли с имеющимися данными о доступности и подвижности спиновых и флуоресцентных меток в производных НТО в свободном виде и в комплексе с рецептором [232, 233]. Было установлено, что, как и следовало из представленных
