Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Микрофлюидные системы, или системы микроанализа на основе химических микрочипов 13
1.1 Производство химических микрочипов 16
1.2 Методы реализации 19
1.2.1 Смешивание и реакция в потоке 21
1.2.2 Массоперенос в системах «жидкость-жидкость» 22
1.2.3 Электрофоретическое разделение компонентов пробы 31
1.3 Системы детектирования аналитического сигнала в химических микрочипах 35
1.3.1 Лазерно-индуцируемая флуоресценция
1.3.2 Хемилюминесценция 36
1.3.3 Термолинзовая микроскопия 38
1.3.4 Электрохимическое детектирование 38
1.3.5 Масс-спектрометрия 39
1.3.6 Перспективы развития — интегрированная оптика 40
1.4 Заключение к главе 1 43
ГЛАВА 2 Термооптическое детектирование в микрофлюидных системах 44
2.1 Термолинзовая микроскопия 45
2.2 Математический аппарат 48
2.3 Области применения 49
2.4 Аналитические приложения в микрофлюидных системах 50
2.5 Заключение к главе 2 54
2.6 Основные этапы работы 55
ГЛАВА 3 Аппаратура, методики и техника эксперимента 56
3.1 Аппаратура 56
3.1.1 Термолинзовый спектрометр 56
3.1.2 Термолинзовый микроскоп 60
3.1.3 Настольный термолинзовый микроскоп 65
3.1.4 Другие приборы, использованные в работе 66
3.2 Проточные системы 67
3.2.1 Изготовление химических микрочипов 67
3.2.2 Подготовка химических микрочипов к работе 73
3.2.3 Обеспечение потоков в микроканалах 74
3.3 Реагенты и растворители 79
3.4 Обработка результатов измерений 80
3.5 Методики 82
3.5.1 Варьирование мощности 82
3.5.2 Влияние состава среды на термооптические измерения 82
3.5.3 Исследования экстракционного массопереноса на примере кобальта с 2-нитрозо-1-нафтолом методом термолинзовой спектрометрии 83
3.5.4 Определение меди с дитиокарбаминатом в экстракционно-термолинзовом варианте 83
3.5.5 Исследования экстракционного массопереноса на примере меди с дитиокарбаминатом методом термолинзовой спектрометрии 84
3.5.6 Исследования экстракционного массопереноса на примере кобальта с 2-нитрозо-1-нафтолом методом термолинзовой микроскопии 85
3.5.7 Определение пестицида карбарила в микро-экстракционном варианте методом термолинзовой микроскопии 85
3.5.8 Определение пестицидов карбаматного ряда в микро-экстракционном варианте методом термолинзовой микроскопии 87
3.5.9 Мицеллярная электрокинетическая хроматография 88
3.5.10 Электрокинетическое разделение продуктов азосочетания пестицидов карбаматного ряда в микрочиповом варианте с гидродинамическим вводом пробы 88
ГЛАВА 4 Инструментальные особенности термооптических измерений в двухфазных системах 90
4.1 Метрологические характеристики 90
4.1.1 Нормальное распределение 90
4.1.2 Определение коэффициента А:'синхронного усилителя 92
4.1.3 Инструментальная погрешность приборов (погрешность сигнала от сигнала) и их сравнение 92
4.2 Варьирование мощности 94
4.2.1 Термолинзовая спектрометрия 94
4.2.2 Термолинзовая микроскопия 95
4.3 Частота прерывателя и размеры термолинзы в термооптической спектроскопии 95
4.3.1 Частота прерывателя 95
4.3.2 Размер термолинзы 98
4.3.3 Эффект стенок 98
4.3.4 Влияние границы раздела фаз 99
4.4 Конвекция в термооптических методах 101
4.4.1 Расчеты чисел Грассхофа 102
4.4.2 Управление параметрами колебаний 103
4.5 Заключение к главе 4 106
ГЛАВА 5 Влияние характеристик систем на термооптические измерения 108
5.1 Влияние состава среды на термооптические измерения 108
5.1.1 Воспроизводимость термолинзовых измерений 109
5.1.2 Определение несмешивающихся неокрашенных растворителей 110
5.2 Влияние скорости потока на чувствительность измерений при использовании термолинзового микроскопа
5.2.1 Состав среды 111
5.2.2 Мощность индуцирующего лазерного излучения 112
5.3 Заключение к главе 5 114
ГЛАВА 6 Перенос вещества через границу раздела фаз и реакции на границе раздела фаз жидкость-жидкость 115
6.1 Экстракционные процессы в макро-пространстве на примере модельных систем трис-{2-
нитрозо-1-нафтолата) кобальта(Ш) и бис-диэтилдитиокарбамината меди(П) 115
6.1.1 Выбор систем 115
6.1.2 Оптимизация проведения фототермических реакций 116
6.1.3 Исследование процессов массопереноса через границу раздела фаз жидкость-жидкость 118
6.2 Проточная экстракция в химическом микрочипе на примере модельной системы трис-(2-нитрозо-1-нафтолата) кобальта(Ш) 125
6.2.1 Модельные исследования предварительно синтезированного комплекса 125
6.2.2 Стабилизация поверхности раздела фаз жидкость-жидкость в микроканалс 126
6.2.3 Оптимизация измерений экстракционных процессов в химическом микрочипе 127
6.2.4 Влияние скоростей потоков фаз на экстракционные процессы в микроканале 132
6.2.5 Исследование процесса массопереноса /я/?ис-(2-нитрозо-1-нафтолата) кобальта 135
6.2.6 Метрологические характеристики экстракционного определения кобальта 137
6.3 Экстракционное определение карбарила с 2,4,6-триметиланилином в двухфазном микропотоке в химическом микрочипе 137
6.3.1 Выбор систем 137
6.3.2 Оптимизация проведения фотометрической реакции 138
6.3.3 Модельные исследования предварительно синтезированного комплекса 139
6.3.4 Подбор условий экстракции в химическом микрочипе 139
6.3.5 Метрологические характеристики экстракционного определения карбарила 142
6.3.6 Заключение 144
6.4 Экстракционное микрочиповое определение пестицидов карбаматного ряда с ионом нитробензолдиазония в двухфазном микропотоке 144
6.4.1 Оптимизация проведения фотометрической реакции 145
6.4.2 Определение оптимальных экстракционных условий в химическом микрочипе 146
6.4.3 Экстракционное определение пестицидов карбаматного ряда 149
6.5 Заключение к главе 6 151
ГЛАВА 7 Сочетание экстракции и разделения при помощи капиллярного электрофореза в химическом микрочипе с термолинзовым микроскопическим детектированием 153
7.1 Оптимизация условий разделения в макро-пространстве 153
7.2 Особенности электрокинетического разделения в химическом микрочипе с гидродинамическим вводом пробы 157
7.3 Оптимизация условий разделения в химическом микрочипе 158
7.4 Разделение азо производных пестицидов карбаматного ряда в химическом микрочипе с термолинзовым детектированием 160
7.4.1 Влияние времени инжекции на разделение 160
7.4.2 Влияние скорости потока пробы на разделение 161
7.5 Заключение к главе 7 166
Заключение 167
Выводы из работы 169
Благодарности 171
Список литературы 172
- Системы детектирования аналитического сигнала в химических микрочипах
- Определение меди с дитиокарбаминатом в экстракционно-термолинзовом варианте
- Инструментальная погрешность приборов (погрешность сигнала от сигнала) и их сравнение
- Исследование процессов массопереноса через границу раздела фаз жидкость-жидкость
Введение к работе
За последние двадцать лет масштаб анализируемых объектов стремительно снижается от сантиметровых и миллиметровых объемов к микро- и нано-пространству. Основной мотивацией такого перехода является неослабевающий интерес к химическим и физическим характеристикам микропространства, а также к поиску новых платформ и приложений для их изучения. Все это диктует необходимость исследования современных возможностей анализа, возникающих при миниатюризации.
Одним из решений в этой области являются микрофлюидные системы (МФС) или химические микрочипы, представляющие собой систему микроканалов, выполненных в пластинах малого размера, в которых проводят различные аналитические операции (смешивание, реакции, экстракционное или хроматографическое разделение, и т. п.). При переходе к МФС первоопределяющую роль играет выбор подходящего метода детектирования, поскольку малый объем объектов исследования и низкие определяемые концентрации предъявляют определенные требования как к чувствительности, так и к аппаратурным возможностям методов. В настоящее время для оптического детектирования в МФС наиболее часто используют лазерно-индуцированную флуоресценцию, однако этот метод может быть применен исключительно к флуоресцирующим молекулам.
Методы лазерной термооптической (фототермической) спектроскопии относятся к молекулярной спектроскопии поглощения, что позволяет в качестве объектов исследования брать широкий круг соединений. Они основаны на регистрации изменений показателя преломления, вызванных нагревом среды вследствие поглощения электромагнитного излучения и давно применяются в аналитической химии. Их высокая чувствительность позволяет исследовать объекты с оптической плотностью до 10 и концентрациями до 10 -=- 10~10 М. Важной характеристикой термооптических эффектов является их локальность: они охватывают не весь объем исследуемого объекта, а только микропространство вокруг луча индуцирующего лазера, что позволяет не только проводить определения в малых объемах, но и сканирование исследуемых объектов.
Современное состояние термооптической спектроскопии в МФС можно охарактеризовать следующими основными направлениями развития: аналитическая химия (иммуноферментные методы, капиллярный электрофорез, проточно-инжекционный анализ, экстракционные процессы, ферментативный катализ); синтетическая химия, исследования биохимии клетки. В области инструментальных подходов здесь доминируют спектроскопия
фототермического отклонения, термолинзовая микроскопия, а основные достижения связаны с детектированием единичных молекул, исследованиями нанопространства. Однако спектроскопия поверхности раздела фаз жидкость-жидкость в микропространстве остается той областью, в которой еще много открытых вопросов. Достоинства шкалы микропространства позволяют с успехом переносить жидкость-жидкостную экстракцию в химические микрочипы. За счет большой специфической поверхности границы раздела фаз, а также высокого соотношения площади границы раздела к объему фаз, обеспечивается уменьшение расстояния при диффузионном переносе и сокращение времени диффузии. Проведение высокоэффективной жидкостной экстракции в МФС становится возможным без использования дополнительных механических операций.
Системы детектирования аналитического сигнала в химических микрочипах
Одним из основных современных направлений развития аналитической химии является миниатюризация приборов и средств химического анализа в сочетании с интегрированием всех стадий анализа (пробоотбор, пробоподготовка, разделение, концентрирования, проведение аналитической реакции и измерение аналитического сигнала) в одном малом сверхкомпактном устройстве (рис. 1.1). Данные устройства, для них используют термины «микроаналитическая система» (microotal Analysis System, uTAS) или «лаборатория-на-чипе» (Lab-on-a-Chip), в настоящее время находят использование при решении разнообразных задач аналитической химии, биохимии, синтетической химии и биотехнологии [1-3].
В этой и последующей главах мы покажем в целом, что представляют из себя химические микрофлюидные системы, их возможности и преимущества использования в аналитической химии, раскроем особенности детектирования, а именно, что нового дает сочетание микрочиповых технологий с термооптическом детектированием.
Химические микрочипы изготавливают при помощи современных микротехнологий, использующихся в микроэлектронике, часто они имеют планарную геометрию — отсюда и их название по аналогии с электронными микросхемами. В качестве материала для изготовления химических микрочипов используют стекла, кварц, широкий спектр пластмасс, а также кремний или реже металлы. Схема химического микрочипа часто включает емкости для реагентов, реакционные спирали или микрососуды, микроколонки или капилляры и коммуникации для их соединения с линейными размерами 10"9 - 1СГ4 м [3-5]. Помимо этого в химический микрочип уже могут быть интегрированы микронасосы, источники напряжения, электроды [3,6]. В ряде случаев в микрочип интегрируется и детектор, хотя чаще на самом микрочипе имеется только зона детектирования (обычно оптического) и интерфейс со внешним детектором [7].
Миниатюризация систем аналитического определения и их интегрирование в одном устройстве приводит к снижению объёмов пробы (до Ю-10 л), реагентов, растворителей и отходов (до КГ6- Ю-7 л), а также времени анализа по сравнению с традиционными аналитическими приборами. Принципиальными особенностями химических микрочипов являются совершенно другие условия массопереноса теплопереноса и разделения в микроканалах [8] (табл. 1.1).
Так, при улучшении тепловой диффузии в микропространстве, могут быть достигнуты более короткие времена охлаждения и нагревания. Это также означает, что, например, в случае электрофоретического разделения, более высокий градиент напряжения может быть использован без нагрева джоулевым теплом, вследствие эффективного рассеяния энергии в микроструктурах, что также обеспечивает более высокие скорости разделения веществ по сравнению с традиционными электрофоретическими методами. Размеры каналов (1(Г9 - КГ4 м) и скорости потоков (0.01-100 мкл/мин), обычно используемые в микрофлюидных системах, обуславливают протекание исключительно ламинарных потоков. В результате не происходит уширения линий и возрастания давления как в случае турбулентных потоков. В хроматографических и электрофоретических методах эффективность разделения оценивается числом теоретических тарелок, которое пропорционально отношению длины разделительного канала к его диаметру. А значит, уменьшение размеров может быть успешно достигнуто без потери в числе теоретических тарелок.
Устройства на основе химических микрочипов применимы для транспорта вещества в большинстве бесклапанных систем, таких, в которых управляемые потоки создаются под воздействием гидродинамических (давление), электроосмотических или электрохимических сил [9].
Спараллеливание микроаналитических систем позволяет интегрировать (объединить) множество химических микрочипов или множество устройств в один микрочип, потенциально повышая пропускную способность образца, что немаловажно для проведения биохимических исследований (анализ белков и генов) [11].
На сегодняшний момент, микрочиповой тематике посвящены десятки книг и обзоров [1-3,7,11-15]. Работы в области микроаналитических систем появляются в большом числе журналов, наиболее часто статьи по данной тематике можно найти в Lab on Chip, Analytical Chemistry, Electrophoresis, Sensors & Actuators и других. Появляется много публикаций по сенсорам и встроенным устройствам «arrays» (так называемые «биочипы») [16], химическому синтезу на микрочипах, а также публикации по технической тематике, которые в этой работе не будут рассмотрены, поскольку они выходят за рамки тематики работы. Практически невозможно на 100% охватить весь материал посвященный микрочиповым технологиям. Основной целью этой главы является обзор микрофлюидных систем для аналитического определения.
В рамках поставленной в этой работе цели мы ограничиваемся следующими аспектами: остановимся на наиболее выгодных технологиях изготовления химических микрочипов, рассмотрим реализацию основных аналитических стадий в микрофлюидных микрочипах (в частности таких как, смешение жидкостей в потоке, создание двухфазных систем жидкость-жидкость и электрофоретическое разделение определяемых соединений), рассмотрим уникальные методики селективного и чувствительного определения, возможные только в микрофлюидных чипах, а также аналитические системы детектирования, применимые для регистрации сигнала в микроканалах.
Технологические процессы производства химических микрочипов заимствованы из налаженных технологий изготовления микроэлектронных устройств и микроэлектромеханических систем. Для изготовления микрофлюидных чипов и их отдельных элементов используют как неорганические материалы (стекло, кварц, кремний, керамика), так и из различные виды полимеров.
Определение меди с дитиокарбаминатом в экстракционно-термолинзовом варианте
Однако, при использовании обычного профиля микроканала (в виде желоба), диапазон скоростей подачи водной и органической фаз ограничен: как правило, величины скоростей потоков равны, а значительное изменение их соотношения приводит к потере стабильности границы раздела жидкость-жидкость двухфазового потока и образованию капель в канале. Отмечено, что условия работы в микрофлюидном чипе простой формы не позволяют проводить экстракцию в непрерывном потоке, поскольку граница раздела сохраняется стабильной только при больших скоростях потока, когда экстракция невозможна в силу коротких времен контакта и отсутствия диффузии. При уменьшении скоростей потока до приемлемых для начала экстракционных процессов (меньше Юмкл/мин), поверхность раздела фаз теряет стабильность и на ней появляются волны.
Для лучшей стабилизации раздела фаз в водно-органическом потоке применили многослойную экстракционную систему (рис. 1.6) [50]. Авторами продемонстрировано образование устойчивого многослойного потока интегрированного в химический микрочип. Введение двух водных фаз и одной органической сделали возможным формирование в микроканале трехслойного потока с мембраной органической фазы в центре. Скорости потоков водных фаз и органической равные 0.5 мкл/мин и 1.0мкл/мин соответственно (общая скорость 0.56 см/с), позволили достичь стабильного течения многослойного потока на протяжении более, чем 30 мм. Продемонстрировано образование устойчивого трехслойного потока вода-ти-ксилол-вода и жидкость-жидкостная экстракция комплекса Со(П) с 2-диметил-5-аминофенолом (Ю-6 М). Отмечено, что экстракционное равновесие достигается за 4 с в потоке, в то время как в обычной двухфазовой системе требуется 60 с после полной остановки фаз [49]. Авторы объяснили полученную разницу двукратным сокращением диффузионного расстояния, а следственно четырехкратным уменьшением времени диффузии, а также увеличением специфической площади поверхности соприкосновения по сравнению с двухфазной системой.
Также, для стабилизации поверхности раздела в двухфазовом микрофлюидном потоке, предложено оптимизировать форму поперечного сечения микроканала [44,51] или проводить химическую модификацию части поверхности микроканала экстракции [52]. Например, авторами работ [27,29,46,47] разработан специальный процесс травления микроканала, в результате которого, канал имеет форму сечения с разделительной структурой на дне (рис. 1.7), которая обеспечивает протекние многофазовых микропотоков в заданной области, предотвращая их неконтролируемое смещение. Травление трех независимых каналов, которые затем перекрывались, обеспечивало формирование одного общего канала, на дне которого образовывалась трехдольчатая структура хорошо видимая в микроскоп. Высота разделительных перегородок составляла 5 мкм при общей высоте канала в 20 мкм. Форму разделительных структур и их высоту контролировали произвольно на основании времени травления и промежутка между полосами на фотошаблоне. Подобные усовершенствования формы поперечного сечения канала позволили достичь стабильного течения не только двухфазных, но и многофазных потоков [53] при различном соотношении их скоростей. Авторы работы [54] отмечают ускорение протекания экстракции, обусловленное введением разделительной структуры на дне канала, за счет появления микротурбулентных завихрений вблизи границы раздела фаз.
В микрочипах с каналом, имеющим разделительную структуру на дне, продемонстрировано экстракционно-термооптического определения Со(П) с 2-нитрозо-1-нафтолом, с экстракцией в потоке образующегося комплекса в микрофлюидный поток о-ксилола, а также с дальнейшей одновременной обратной экстракцией мешающего комплекса Cu(II) и с разрушением избытка реагента, с достигнутыми пределами обнаружения КГ8 М [29]. В такой системе реализовано определение кобальта в присутствии ионов меди посредством совместной экстракции комплексов /?7/шс-(2-нитрозо-1-нафтолатов) кобальта(Ш) и меди(П) и последующим разложением комплекса меди и детектированием только кобальта. Скорость метаксилола составила 0.4 мкл/мин, скорость водных растворов — 0.2 мкл/мин. В данных условиях экстракционное равновесие почти достигалось к концу микроканала в реакционно-экстракционной зоне, что соответствовало позиции разделения каналов и начала зоны разложения. Общая длина канала от точки слияния фаз до разделения составила около 130 мм. Время выхода на равновесие — 30 с.
Определение коэффициентов распределения и проницаемости описано в работе [53], где с использованием трехслойной микрофлюидной системы (в канале с разделительной структурой на дне) изучены процессы молекулярного транспорта веществ из водной фазы «донора» в водную фазу «акцептора» через поток органической фазы.
В работе [52] впервые предложено использовать химическое модифицирование поверхности гидрофобными октадецилсилаиольными группами. Для реализации противоточной экстракционной системы использованы пластины с микроканалами, поверхность одной из которых обработана октадецилсиланом. Накладывая модифицированную и немодифицированную подложки одна на другую и скрепляя в центре винтом, получена перекрестная структура с углом пересечения микроканалов 30 (рис. 1.8). Продемонстрировано фазовое разделение потоков, путем введения водной фазы в канал без модификации (гидрофильный), и органической (нитробензол)- в модифицированный (гидрофобный), в точке пересечения каналов наблюдали образование жидкость-жидкостной поверхности раздела фаз. В условиях стабильной поверхности определены верхний и нижний пределы скоростей обоих фаз. Подобное усовершенствование системы позволило достичь минимальных скоростей фаз 0.1 и 0.2 мкл/мин для нитробензола и воды соответственно.
Следует отметить, что в данном случае поверхность раздела фаз формируется в горизонтальной плоскости, а не в вертикальной, как в предыдущих химических микрочипах. Горизонтальное положение поверхности в микроканале в сочетании с поверхностно-селективными методами делает возможным изучение движения молекул на границе раздела, а также структурных и динамических свойств самой поверхности.
Инструментальная погрешность приборов (погрешность сигнала от сигнала) и их сравнение
С увеличением числа операций в потоках возможных к выполнению в химических микрочипах, с ростом биохимических приложений интегрированных в микроустройства, и конечно с уменьшением объема образца, необходимость в высокочувствительных методах детектирования приобретает все более и более существенную значимость. Эффект размера, обратно пропорциональный глубине (ширине) канала, является одним из наиболее привлекательных характеристик микрочипов, вследствие ускоренной диффузии в пределах микроканалов. Также благодаря эффекту размера обеспечивается высокая пропускная способность аналитических систем. Успех МФС в большей степени зависит от способности исследователей и инженеров в создании систем детектирования способных работать в условиях уменьшенной длины диффузии, ограниченной геометрии и планарных подложек, а также справляющимися со всеми вытекающими трудностями, связанными с миниатюризацией.
Разработкам в области детектирования для микрофлюидных систем посвящено большое число работ, в том числе ряд обзоров [7,78-81]. В следующих разделах мы остановимся на методах детектирования, наиболее используемых в микрочиповой практике на данный момент, и рассмотрим перспективы новых аналитических приложений, появившихся вследствие развития микрочиповых технологий.
На данный момент, среди методов детектирования, используемых для регистрации сигнала в микроканалах, самым чувствительным и наиболее часто используемым методом является лазерно-индуцируемая флуоресценция (ЛИФ) [82].
Несмотря на некоторые ограничения (применим только либо к образцам обладающим природной флуоресценцией, либо требует подбора подходящего флюорофора для получения флуоресцирующих продуктов), тем не менее ЛИФ сегодня стоит на позиции стандартного метода детектирования анализируемых соединений при микрочиповом разделении [48,83-90].
Детектирование осуществляется пропусканием луча лазера через канал для разделения и собиранием испущенной флуоресценции при помощи оптического микроскопа расположенного перпендикулярно над микрочипом. Аккуратная оптимизация параметров, таких как диафрагма, глубина канала, эффективность возбуждения и размер пятна лазера в конфокальной эпифлуоресцентной микроскопии позволяет детектировать концентрации на уровне 300 фМ флуоресцеина [91,92]. Более подробно об особенностях метода: оптимизации сигнала, необходимой оптике и ее настройках — изложено в работе [82].
Лазерно-индуцируемая флуоресценция является наиболее распространенным методом при биохимических исследованиях. Метод хорошо зарекомендовал себя при детектировании в химических микрочипах биологически активных соединений, обладающих природной флуоресценцией, например некоторых белков [93], флавинов и рибофлавинов [87], а также молекул, которые могут быть превращены в высоко-флуоресцирующие, например ДНК [83,84,88,90,94], катехоламины [90]. Определение ДНК, как правило, сопровождается селективной реакцией с флуоресцирующим красителем — вставочным агентом. Благодаря широкому выбору вставочных агентов анализ ДНК не вызывает трудностей. Большое количество работ опубликовано по определению белков [85], клеточного анализа [86] и малых молекул [95,96] в химических микрочипах с ЛИФ детектированием. В отличие от ДНК, для белков не существует вставочных агентов, и флуоресцентное детектирование обычно требует маркирования подходящим флуорофором [97]. Часто используется динамическое маркирование комплекса белка с ДДСН [98]. ЛИФ также является центральным методом при детектировании одиночных макромолекул ДНК при КЭ разделении в химических микрочипах [92,99-102].
Среди спектральных методов анализа используемых для детектирования в условиях КЭ после ЛИФ по распространенности следует хемилюминесценция (ХЛ) [80]. Данный метод позволяет достичь высокой чувствительности определений при разделении КЭ на уровне детектирования одной молекулы [103] и имеет широкий диапазон интенсивности сигнала-отклика.
Наиболее выгодной характеристикой, отличающей ХЛ детектирование, является простота инструментальной установки, где нет необходимости наличия источника света, хотя метод и требует оптимизации интерфейса при соединении с сепарационными технологиями.
Лию и Терабе [104] интегрировали ХЛ детектирование в КЭ микрочип созданный на основе ПДМС. Авторами проверены различные топологии каналов в микрофлюидном чипе и найдены наиболее подходящие для ХЛ-систем люминол-пероксид и пероксалат-пероксид. Успешно выполнено разделение катионов металлов Сг(Ш), Со(Н) и Cu(II), а также хиральное распознавание дансил-фенилаланин энантиомеров за время меньшее, чем 1 мин и с пределами обнаружения на уровне субмикромолярных концентраций.
Яковлева и сотрудники [105] описывают микрофлюидный ферментный биосенсор с иммобилизированными белками А и G, которые используются при ХЛ детектировании. Химический микрочип применен для разработки иммуносенсоров на основе HRP, катализирующего ХЛ окисление люминола 4-йодофенолом. Биосенсор использовали для определения атразина в поверхностных водах и соках с добавлением известного количества атразина.
В последнее время как метод детектирования в микрофлюидных микрочипах все большее значение приобретает электрохемшюмипесценция (ЭХЛ). Достоинством этого метода является высокая чувствительность и сочетание достоинств хемилюминесцентного и электрохимического детектирования. В качестве реагентов чаще всего используют комплекс и люминол. В целом современное состояние в этой области отражено в небольшом, но достаточно подробном обзоре [106]. Среди наиболее ярких примеров использования электрохемилюминесценции в аналитических целях можно привести сочетание электрохимического детектирования с ЭХЛ [107], определение микроколичеств кодеина в варианте микро-проточно-инжекционнного анализа [108] и определение глюкозы при помощи реактора со стеклянными шариками с поверхностью, модифицированной глюкозооксидазой [109]. В большинстве случаев используется специальный реактор, который может работать как в химических микрочипах, реализующих микро-проточно-инжекционный анализ, так и для электрофоретических определений [110], при этом для разных реакций используется один и тот же реагент, (Rb(bpy))2+, который подается в систему специальным насосом.
Анализ современных работ в этой области показывает, что ЭХЛ детектирование характеризуется достаточно высокой чувствительностью и воспроизводимостью и при этом не требует больших производственных затрат, что позволяет добиться достаточно низкой себестоимости анализа. Можно только согласиться с авторами [106], что данный вариант микроанализа — один из наиболее перспективных вариантов для коммерческих приборов и серийного использования.
Исследование процессов массопереноса через границу раздела фаз жидкость-жидкость
В основе термооптической спектроскопии лежит фотоиндуцированные изменения в тепловом состоянии образца, что непосредственно связано с взаимодействием электромагнитного излучения с веществом. Поглощенная энергия света и отсутствие потерь при последующей эмиссии приводят к нагреву среды. Этот нагрев в свою очередь вызывает температурные изменения, как и изменения термодинамических параметров образца, зависящих от температуры. Измерения изменений температуры, давления и плотности, происходящие вследствие оптического поглощения являются базисом фототермических спектроскопических методов [111,112,158-163].
Среди термооптических методов для работы с микрофлюидными системами в основном используют термолинзовую спектрометрию [112,158] и термолинзовую микроскопию [10]. Несмотря на то, способ формирования сигнала теоретическая база и особенности инструментального оборудования этих методов во многом совпадают, они не являются идентичными и каждый занимает свою нишу.
Термолинзовая спектрометрия позволяет работать с микроколичествами веществ в любых агрегатных состояниях, измерять оптические плотности на уровне п х Ю-9 и определять вещества на уровне концентраций до п х 10 12-«х Ю-1 М [164]. В целом, чувствительность термолинзовой спектрометрии на 2-4 порядка превышает чувствительность спектрофотометрии. Более того, лазерный луч можно сфокусировать до размеров капилляров проточных кювет [165], что определило основное применение метода в микрофлюидных системах. К достоинствам этого метода относятся и относительная простота аппаратурного оформления, что позволяет создавать компактные приборы [165-169], использовать термолинзовый спектрометр в качестве детектора в капиллярном электрофорезе [162,170,171] и высокоэффективной жидкостной хроматографии [112,172,173].
Термолинзовую микроскопию мы выделили среди термооптических методов, как наиболее подходящий для сочетания с планарными микрофлюидными технологиями (химическими микрочипами). В следующих разделах остановимся подробнее на особенностях термолинзовой микроскопии и ее отличиях от термолинзовой спектрометрии.
Термолинзовая микроскопия (фототермическая микроскопия) как метод появилась в процессе развития термолинзовой спектрометрии. Метод разработан для измерения сигнала в микропространстве, лазерное излучение перед прохождением через образец собирается и направляется посредством оптического микроскопа. Таким образом, микроскоп дополнительно включен в оптическую схему характерную для термолинзового спектрометра.
Метод основан на термолинзовом эффекте - образовании рассеивающей линзы в среде, поглощающей лазерное излучение. Термолинзовый эффект основан на пространственном градиенте показателя преломления, образующимся вследствие локального нагрева, приводящего к прямому изменению распространения луча света. Искривление пространственного профиля показателя преломления вызывает фокусировка или дефокусировка света, таким образом тепловые пертурбации образца могут действовать как линза [158]. Как правило, для инициации термолинзового эффекта используют лазерное излучение с ТЕМоо модой (гауссово распределение интенсивности) [158]. Далее мы будем рассматривать только двулучевые измерения, в которых один луч индуцирует оптический элемент, а второй — является зондирующим. В случае термолинзовой спектрометрии, когда лучи лазеров коаксиальны, образуется сферическая линза. Для большинства растворов образующаяся линза является рассеивающей.
Термолинзовый сигнал получается путем контролирования мощности лазерного излучения прошедшего через диафрагму, помещенную на достаточном расстоянии после кюветы с образцом. Образующаяся рассеивающая линза дефокусирует лазерное излучение, таким образом, мощность в центре луча уменьшается.
Теорию термолинзы для шкалы макро-пространства разрабатывали исследователи нескольких научных групп [163,165,168,169], подробно описаны термолинзовый эффект и поведение сигнала [158], однако для шкалы микропространства до недавнего времени теория не представлена в полном объеме.
Экспериментально, несколько групп пытались реализовать традиционную коаксиальную термолинзовую спектрометрию в микроскопе, однако безуспешно. В 1990 г. группой проф. Китамори (Япония) создан первый коаксиальный термолинзовый микроскоп [174]. Существенным фактором повлиявшим на образование термолинзового эффекта в микропространстве стала хроматическая аберрация линзы объектива.
Принципиальным отличием термолинзовой микроскопии от традиционной является конфигурация лучей лазеров в образце.
В традиционной двулучевой термолинзовой спектрометрии кювета с образцом располагается после точки фокуса (перетяжки) обоих индуцирующего и зондирующего лучей, под воздействием термолинзы луч зондирующего лазера расходится и наблюдается ослабление сигнала. При термолинзовой микроскопии оба луча собираются линзой объектива и фокусируются в микропространстве канала (плоской кюветы) (рис. 2.1). При отсутствии аберраций объектива, позиции фокусов лучей индуцирующего (точка возникновения термолинзы) и зондирующего лазеров совпадают (рис. 2.2А). В таком случае, из теории оптики следует, что возникновение линзы не влияет на расхождение луча зондирующего лазера.
В общем случае, в объективах, предназначенных для наблюдения микрообъектов, хроматическая аберрация (Az) полностью скомпенсирована, поскольку она ухудшает качество изображения. Таким образом, нормальный оптический микроскоп не может быть применен для термолинзовой спектрометрии, в отличие от старых микроскопов (произведенных до 1970 г., когда стала применятся компенсация), где хроматическая аберрация составляла приблизительно 2.2 мкм для объектива с численной апертурой 0.65. И поскольку коэффициент преломления луча индуцирующего лазера больше, чем зондирующего, фокус индуцирующего располагается на 2 мкм впереди зондирующего. При такой конфигурации, образующаяся термолинза «удлиняет» фокусное расстояние объектива, а луч зондирующего лазера претерпевает собирающий эффект, (рис. 2.2Б) и результирующий сигнал увеличивается.
Данное явление подтверждено теоретически и на практике в работе [174] на примере изменения интенсивности сигнала при помещении стеклянной пластинки нанесенным слоем угля под объектив термолинзового микроскопа. В работе также предложена возможность использовать апохроматический объектив (скомпенсированный), контролируя расстояние между фокусами лучей с помощью проектирования оптической системы вне микроскопа. В настоящее время в термолинзовой микроскопии используются стандартные скомпенсированные объективы, а расстояние между фокусами лучей задается двухлинзовыми уширителями [175], которые также дополнительно включены в оптическую схему характерную для термолинзового спектрометра.
