Введение к работе
Актуальность
Лиганд-активируемые ионные каналы (ЛАИК) - группа белков, ответственных за обеспечение передачи сигнала в химических синапсах высших животных. Белки группы характеризуются полимерной структурой и радиальной симметрией вокруг проводящей поры. Одно из наиболее изученных семейств ЛАИК - пентамерные лиганд-активируемые ионные каналы, или Cys-петельные рецепторы (Cys-loop receptors, CLR). К ним относятся рецепторы ацетилхолина (ацетилхолиновый рецептор никотинового типа, нАХР), глицина (ингибирующий глициновый рецептор, ГР), серотонина (5-гидрокситриптаминовый рецептор, 5НТЗР), у-аминомасляной кислоты (ГАМКР) и др. Все белки семейства характеризуются общей структурной организацией, включающей внеклеточный лиганд-связывающий, проводящий трансмембранный и регуляторный внутриклеточный домены. Связывание лиганда происходит на поверхности контакта между двумя субъединицами во внеклеточном домене, причем основную роль в этом процессе играет петля С, меньшую -петли Е и F (см. Рис. 1). Поверхность связывающего центра, предоставляющую петлю С, называют (+) поверхностью; комплиментарную к ней - (-) повехрностью. При связывании лиганда происходит изменение положения петли С. Предполагалось, что при взаимодействии с агонистами петля плотно связывается с рецептором и приближается к нему, при связывании антагонистов - отдаляется от рецептора. В данной работе были обнаружены исключения из этой закономерности (см. Результаты и обсуждение).
Важной и широко используемой модельной системой является т.н. ацетилхолин-связывающий белок (АХСБ), выполняющий регуляторную функцию в холинергических синапсах брюхоногих моллюсков. Он представляет собой водорастворимый структурный гомолог внеклеточного домена нАХР и широко применяется для изучения взаимодействия Cys-петельных рецепторов с лигандами.
Ранее работа отдела молекулярной нейросигнализации ИБХ РАН строилась вокруг исследований ацетилхолинового рецептора никотинового типа (нАХР), и прежде всего -свойств его лиганд-связывающего домена. В рамках международного сотрудничества с различными институтами и университетами (Институт мозга общества Макса Планка, г. Франкфурт-на-Майне, Германия; Технический университет, г. Дармштадт, Германия; Католический университет, г. Лёвен, Бельгия; Национальный институт рака, г. Амстердам, Нидерланды) начата работа по исследованию лиганд-связывающих доменов других (глицинового, у-аминомаслянного, 5-гидрокситриптаминового) рецепторов, а также их трансмембранного и внутриклеточного доменов.
Разные подтипы ацетилхолиновых и глициновых рецепторы вовлечены во многие процессы нервной деятельности организма, в том числе в координацию движений, ориентацию в пространстве, соматическую регуляцию, проведение боли, зрение и многие другие. В связи с этим они являются чрезвычайно значимой фармакологической мишенью, и получение новых, высокоафинных и селективных веществ, действующих на эти рецепторы, клинически оправдано.
Рис. 1. Представители надсемейства пентамерных лиганд-активируемых ионных каналов -(а) ацетилхолиновый рецептор никотинового типа, реконструкция по электронной микрофотографии с разрешением 4.1 A (PDB Ш 2BG9), (б) ингибирующий глициновый рецептор, компьютерная модель; (в) прокариотический канал Erwinia chrysanthemi, рентгеновская структура с разрешением 1.8A (PDB Ш 2VL0), ацетилхолин-связывающий белок Aplysia californica, рентгеновская структура с разрешением 1.8A (PDB Ш 2BYN).
Однако, в связи с отсутствием точных кристаллических структур данных белков, для рационального дизайна новых соединений необходимо привлекать косвенную структурно-функциональную информацию.
В данной работе рассматриваются, во-первых, алкалоиды стрихнин и d-тубокурарин, характерные высокоаффинным связыванием, но низкой специфичностью к подтипам (d-тубокурарин) и даже типам (стрихнин) рецепторов, и механизм их взаимодействия с АХСБ и рецепторами; во-вторых, пример рационального дизайна связывающих центров для новых лигандов на основании структурно-функциональных данных; и, в-третьих, высокоспецифичное внутрибелковое взаимодействие, обеспечивающее сборку трансмембранного домена Cys-петельных ионных каналов. Информация, полученная по этим направлениям, позволит улучшить возможности рационального дизайна соединений, направленных на ацетилхолиновые и глициновые рецепторы, а также связывающих центров этих рецепторов для получения новых экспериментальных инструментов и биосенсоров.
Список использованных сокращений
ЛАИК - лиганд-активируемые ионные каналы; CLR - Cys-петельные рецепторы; нАХР -ацетилхолиновый рецептор никотинового типа; ГР - ингибирующий глициновый рецептор; АХСБ - ацетилхолин-связывающий белок, d-TK - d-тубокурарин, ДДС - додецилсульфат натрия.
Цель исследования
Целью данной работы было, во-первых, рассмотрение свойств связывающих центров глицинового и ацетилхолинового рецепторов, находящихся во внеклеточном и трансмембранном доменах, и определение остатков, ответственных за их функционирование там, где они неизвестны; во-вторых, применение полученных структурно-функциональных данных для рационального дизайна связывающих центров для двухвалентных катионов на основе глицинового рецептора; в-третьих, изучение остатков, обеспечивающих сборку трансмембранных связывающих центров и олигомеризацию Cys-петельных рецепторов.
Задачи
Проанализировать вычислительными методами структуры комплексов АХСБ с алкалоидами стрихнином и d-тубокурарином. Выявить закономерности в их динамическом поведении, определить аминокислотные остатки, ответственные за афинность связывания с АХСБ. Сравнить кристаллические структуры с моделями связывания лигандов с соответствующими рецепторами (стрихнина - с ГР, d-тубокурарина - с нАХР). Объяснить низкую селективность данных алкалоидов между подтипами рецепторов.
Рассмотреть правомочность использования АХСБ как модели не только для различных подтипов нАХР, но и для других типов пентамерных лиганд-активируемых ионных каналов (ГР, ГАМКР и др).
На основе полученных данных о функциональной роли остатков внеклеточных связывающих центров создать вариант глицинового рецептора, способный реагировать на наномолярные концентрации двухвалентных катионов.
При помощи вычислительных методов проанализировать вероятное взаимодействие, обеспечивающее сборку и олигомеризацию трансмембранного домена глицинового рецептора. Предсказать вероятные молекулярные детерминанты данного взаимодействия, предложить способы проверки.
При помощи биохимических и электрофизиологических методов проверить правильность предсказаний. Проанализировать полученные соответствия между структурными данными компьютерного моделирования и функциональными данными. Рассмотреть универсальность данного механизма для всего надсемейства.
Научная новизна работы
В работе показан механизм действия алкалоидов стрихнина и d-тубокурарина, характеризующихся высокоафинным, но низкоселективным связыванием с ацетилхолиновым и глициновым рецепторами. На основании полученных данных о функциях консервативных остатков внеклеточного лиганд-связывающего домена проведен рациональный дизайн связывающих центров с заданной чувствительностью к двухвалентным катионам на основе а 1-глицинового рецептора, которые, возможно, найдут применение в аналитической химии и нейрофизиологии. Также на основании длительной молекулярной динамики исследованных в работе комплексов АХСБ с алкалоидами, и другими лигандами, опубликованных ранее (Celie et al., 2005, Bourne et al., 2005), была получена информация о взаимосвязи направленности действия лиганда и частоты осцилляции его комплекса с белком. Данный подход можно использовать в качестве метода оценки влияния активного соединения на динамическое поведение рецептора, позволяющего предсказывать агонистическое или антагонистическое действие лигандов вычислительным путем.
Основные положения, выносящиеся на защиту
Впервые показано, что при связывании с ацетилхолин-связывающим белком молекулы алкалоидов могут иметь две ориентации (d-тубокурарин) или находиться по две в одном сайте связывания (стрихнин). Низкая специфичность стрихина и d-тубокурарина к различным подтипам рецепторов обеспечивается тем, что наибольший вклад в взаимодействие между алкалоидом и белком вносят консервативные остатки внеклеточного центра связывания (W145, Y186, С188, С189, Y193 в ацетихолинсвязывающем белке Aplysia californica), присутствующие практически во всех рецепторах семейства.
На основании полученных кристаллических структур показано, что частотная характеристика колебаний лиганд-связыающего домена Cys-петельных ионных каналов в равновесной фазе молекулярной динамики является собственным свойством рецептора и
зависит от его химической структуры. Данная характеристика меняется под воздействием связывания с лигандами, отражая изменение термодинамической температуры белка.
Показано, что сборка и олигомеризация Cys-петельных ионных каналов обеспечиваются сетевым взаимодействием ароматических остатков первого, третьего и четвертого альфа-спиральных фрагментов трансмембранного домена (Y228, W239, W243 из Ml; W286, F293 из МЗ и F395, F399, F402, F405, Y410 из М4 в аі-глициновом рецепторе). Данное взаимодействие специфично и основано на точном распознавании поверхностей связывания.
Модификация ароматических остатков внеклеточного центра связывания агонистов и антагонистов глицинового рецептора придает рецептору чувствительность к двухвалентным катионам металлов в наномолярных концентрациях. Предсказаны и получены варианты белков, чувствительных к ионам цинка, меди и магния.
Научно-практическая ценность работы
В сотрудничестве с Техническим университетом г. Дармштадт (Technisches Universitat Darmstadt), ФРГ, начата работа по использованию модифицированных версий глицинового рецептора, чувствительных к незначительным концентрациям двухвалентных катионов, в качестве детекторов на биочипах для применения в аналитической химии.
Публикация и апробация работы
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ. Основные материалы диссертации были представлены на рабочем совещании проекта Neurocypres седьмой рамочной программы Европейского Союза (FP7 Neurocypres, Амстердам, Нидерланды, 2008), российско-немецких симпозиумах по Cys-петельным рецепторам (Москва, 2007 и Франкфурт-на-Майне, Германия, 2008), конференциях 51 FENS Forum (Вена, Австрия, 2006) и Iх FENS Forum (Амстердам, Нидерланды, 2010) и "Biophysical Society Annual Meeting" (США, 2010).
Структура и объем диссертации.