Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 10
1.1. Цепные процессы в органической химии и биологии 10
1.1.1. Общие теоретические представления о цепных процессах и основные типы их механизмов 10
1.1.2. Некоторые аспекты теории цепных процессов в применении к биологическим системам 20
1.2. Активные форм кислорода и их роль в процессах жизнедеятельности 29
1.2.1. Генерация и реакционная способность активных форм кислорода. 29
1.2.2. Важнейшие реакции активных формгк#слорода с биообъектами V. 38
1.2.3. Белки как объекты пероксидации 46
1.2.4. Судьба активных форм кислорода в тканях 69
1.3. Пероксидные процессы при различных патологических состояниях 80
1.4. Краткая характеристика объектов исследования 85
1.4.1. Ацетилхолинэстераза 85
1.4.2. Гемоглобин 89
1.4.3. Альбумин 94
2. Обсуждение результатов 98
2.1. Исследование повреждения полипептидной цепи под действием активных форм кислорода 98
2.1.1. Пероксидное повреждение альбумина 98
2.1.1.1. Исследование пероксидного повреждения альбумина, инициированного реактивом Фентона 98
2.1.1.2. Исследование пероксидного повреждения альбумина под действием отдельных компонентов реактива Фентона 114
2.1.1.3. Исследование аутоокисления альбумина 126
2.1.1.4. Исследование пероксидного повреждения альбумина, инициированного системой нитрит-ион - пероксид водорода 129
2.1.1.5. Исследование пероксидного повреждения альбумина в присутствии нитрит-иона 137
2.1.2. Исследование пероксидного повреждения гемоглобина 139
2.1.2.1. Исследование аутоокисления гемоглобина 139
2.1.2.2. Исследование окисления гемоглобина, инициированного реактивом Фентона 145
2.1.2.3. Исследование пероксидного повреждения гемоглобина под действием отдельных компонентов реактива Фентона 150
2.1.2.4. Исследование пероксидного повреждения гемоглобина, инициированного системой
пероксид водорода - нитрит-ион 158
2.1.2.5. Исследование пероксидного повреждения гемоглобина под действием нитрит-иона 163
2.2. Инактивации ацетилхолинэстеразы под действием активных форм кислорода 167
2.2.1. Инактивации ацетилхолинэстеразы реактивом Фентона 167
2.2.2. Инактивация ацетилхолинэстеразы системой нитрит-ион - пероксид водорода 172
2.2.3. Инактивации ацетилхолинэстеразы системой оксигемоглобин - нитрит-ион 176
2.3. Влияние ловушек свободных радикалов на скорость процесса пероксидного повреждения полипептидной цепи 181
2.3.1. Ингибирование процесса пероксидного окисления белков классическими ловушками АФК 181
2.3.2. Ингибирование процесса пероксидного окисления ацетилхолинэстеразы нитроксильным радикалом 187
2.3.3. Изучение процесса пероксидного окисления ацетилхолинэстеразы в опытах in vivo 189
2.3.3.1. Изменение активности ацетилхолинэстеразы эритроцитов под действием системы оксигемоглобин - нитрит-ион в опытах in vivo 189
2.3.3.2. Ингибирование нитроксильным радикалом процесса пероксидного окисления ацетилхолинэстеразы в опытах in vivo 191
2.4. Определение уровня пероксидного окисления белков и липидов в некоторых биологических объектах 193
2.4.1. Определение уровня пероксидного окисления белков и липидов в крови больных с различными патологиями 193
2.4.2. Определение уровня пероксидного окисления белков и липидов в детских молочных продуктах 203
3. Экспериментальная часть 208
3.1. Приборы 208
3.2. Материалы 209
3.3. Методы 210
3.3.1. Изучение пероксидного повреждения белков спектрофотометрическим методом 210
3.3.2. Изучение пероксидного повреждения белков методом хемилюминесценции 212
3.3.3. Измерение степени инактивации ацетилхолинэстеразы 213
3.3.4. Обработка образцов крови 215
3.3.5. Определение содержания диеновых коньюгатов в сыворотке крови 216
3.3.6. Определение содержания малонового диальдегида в сыворотке крови 217
3.3.7. Измерение индуцируемого пероксидного гемолиза эритроцитов 218
3.3.8. Измерения степени инактивации ацетилхолинэстеразы в гемолизате в опытах in vivo 218
3.3.9. Определение концентрации общего гемоглобина 220
3.3.10. Определение форм гемоглобина 220
3.4. Математическая обработка результатов исследований 223
3.4.1. Построение графиков по результатам исследований 223
3.4.2. Оценка экспериментальных данных 224
Выводы 226
Библиографический список использованной литературы 228
Приложения 256
- Активные форм кислорода и их роль в процессах жизнедеятельности
- Исследование пероксидного повреждения альбумина, инициированного системой нитрит-ион - пероксид водорода
- Инактивации ацетилхолинэстеразы под действием активных форм кислорода
- Изучение пероксидного повреждения белков спектрофотометрическим методом
Введение к работе
Настоящая работа посвящена исследованию закономерностей протекания процесса пероксидного повреждения полипептидной цепи различных белков (альбумина, гемоглобина, ацетилхолинэстеразы) некоторыми радикал-генерирующими системами (H202-Fe +, H202-N02~). К настоящему времени неоспоримо доказано, что весь цикл существования живого организма сопровождается изменением радикальных и окислительно-восстановительных процессов.
У аэробных организмов, использующих в процессах жизнедеятельности молекулярный кислород, помимо естественного его восстановления по четырехэлектронному варианту, всегда имеют место процессы генерации активных форм кислорода (АФК). Термин «АФК» помимо свободных радикалов кислорода, к которым относятся супероксидный анион-радикал (02*), его протонированная форма - гидропероксидный радикал (НО'), гидроксильный радикал (НО'), включает также молекулы пероксида водорода (Н202), синглетный кислород (!02), озон (03) и гипохлорит (НОСІ). Указанные активные интермедиа в небольших количествах необходимы организму для нормального протекания процессов жизнедеятельности. Фиксированное соотношение в тканях антиоксидантной и прооксидантной систем в норме обеспечивает поддержание концентрации реакционноспособных метаболитов кислорода на стационарном уровне, необходимом для проявления их биологической активности.
Воздействие многих бытовых и техногенных факторов, развитие практически всех патологических состояний, а также процессы физиологического старения у аэробных организмов связаны с образованием различных, в основном кислородсодержащих, радикалов, в количествах, отличных от стационарного уровня. Отклонение в концентрациях этих частиц от нормального фонового уровня приводит к процессам пероксидного
7 повреждения важнейших биомолекул (белков, липидов, нуклеиновых кислот, углеводов), клеточных структур, клеток и тканей, то есть к драматическим последствиям для организма и, в предельном случае, к его гибели. Поэтому вопросы пероксидного окисления биоструктур на молекулярном, клеточном, органо-системном, организменном уровнях в последнее время привлекают большое внимание широкой научной общественности.
Для поддержания нормального функционирования организма в целом необходима коррекция указанных состояний, для чего используются препараты - антиоксиданты, как природного, так и синтетического происхождения. Естественно, что каждый окисляемый биосубстрат имеет свою специфику и для нормализации процессов свободнорадикального окисления необходимо знать тонкие механизмы повреждения биоструктур в каждом конкретном случае.
Выявление деталей механизмов химических реакций в биосистемах затруднено. Организм или интактный орган представляют собой "...биологический эквивалент черного ящика с известным входом и выходом, однако внутренние процессы в котором запутаны и непонятны, таким образом, анализ внутренних реакций биологической системы должен вестись путем выделения и изучения каждой конкретной реакции черного ящика"1. Изучение каждого объекта пероксидного окисления - задача, которая требует объединения исследователей разного профиля. Наиболее изученными из биомолекул, повреждаемых активными формами кислорода, являются липиды. Изучением процессов их оксидативной модификации занимаются уже более 40 лет.
Так как белки выполняют важнейшие функции в процессах жизнедеятельности организмов любого уровня, последние два десятилетия они привлекли пристальное внимание научных кругов как субстраты процессов пероксидации. Такие исследования имеют особенно важное значение для Sawyer D. Т., Roberts J. L., CalderwoodJ. Т. S., Sugimoto К, McDowell M.S. Reactivity and activation of dioxygen-derived species in aprotic media (a model matrix for biomembranes)// Philosophical Transaction of the Royal Society of London. 1985. V. B311. N 1152. P. 483-503.
8 медицины, так как все ферменты являются белками. Показатели ферментативной активности широко используются в клинической биохимии при постановке диагноза. Патологические состояния всегда сопровождаются нарушением окислительно-восстановительных процессов в организме, поэтому особый интерес представляет взаимосвязь изменения активности ферментов и степени пероксидного повреждения белков, что может служить основой для постановки диагноза на ранней стадии и эффективного контроля за лечением.
Так как нарушение оксидативного равновесия предполагает лечение антиоксидантами, для корректного их использования необходимо знание деталей механизма окисления биомолекул. В данном аспекте просматривается перспектива взаимодействия физико-химиков и биологов, так как изучение кинетики процесса приводит к пониманию его механизма. Использование подходов и методов химической кинетики для решения проблем биологии и медицины привело к формированию и успешному развитию физико-химической биологии как самостоятельной области знаний.
Учитывая, что в настоящее время доказан свободнорадикальный характер оксидативной модификации биоструктур, а для липидов установлен цепной радикальный механизм пероксидного окисления, во многом схожий с процессами жидкофазного окисления органических соединений, попытка рассмотреть процесс пероксидного повреждения белков как имеющий радикально-цепную природу представляет существенный интерес. Ранее таких попыток не предпринималось. Предлагаемый подход дает возможность выявить основные стадии данного процесса, участвующие в нем реакционно-способные интермедиаты, что в свою очередь открывает путь к поиску средств, нормализующих процессы пероксидации в организме. На наш взгляд, поиск антиоксидантов должен обязательно сочетаться со знанием деталей механизмов оксидативной модификации.
Необходимо отметить, что именно российская химическая школа имеет большой опыт изучения цепных радикальных процессов, в том числе их биологических аспектов (Н.Н. Семенов, Н.М. Эмануэль, Ю.А. Владимиров,
А.И. Арчаков). Бурное развитие этой области пришлось на 50-70-е годы ушедшего столетия. После открытия в начале XX века М. Боденштейном цепных реакций (их изучение началось в 1910 году), лауреатами Нобелевской премии академиком Н.Н. Семеновым и профессором С. Хиншелвудом была создана теория цепных процессов (Нобелевская премия 1956г.). Окончательно учение о цепных процессах было сформулировано в монографии Н.Н. Семенова "Цепные реакции" (1-е издание 1934г., 2-е издание - 1986г.).
Учитывая глобальность процессов пероксидного повреждения, необходимо выявление общих законов их течения для различных по строению и функциям белков. В настоящей работе мы попытались реализовать такой подход в рассмотрении данной проблемы следующим образом: исследовать процессы пероксидного повреждения полипептидной цепи различных по строению и функциям белков; выявить общие закономерности течения этих процессов;
3)на основе выявленных закономерностей подобрать эффективные регуляторы пероксидного окисления, опробовать некоторые препараты в опытах in vivo.
Диссертационная работа выполнена по тематическому плану научно- исследовательских работ Санкт-Петербургского государственного технологического института (технический университет). Исследование осуществлялось в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники».
Основные результаты работы доложены на 8 конференциях, из них 7 международные (г. С-Петербург: 1999, 2000 гг.; г. Москва: 2001, 2002 гг.; г. Москва - Тверь: 2001 г.; г. Луга: 2001 г.). По теме диссертации опубликованы 6 статей в научных журналах (из них 1 обзор), 1 статья в сборнике научных работ.
Активные форм кислорода и их роль в процессах жизнедеятельности
Как было показано выше, в большинстве изученных цепных процессов, протекающих в организме в процессе жизнедеятельности, активное участие принимают свободные радикалы кислорода [18, 19]. С тех давних пор, когда стала очевидной двухатомность молекулы кислорода, существовали две на первый взгляд взаимоисключающие друг друга точки зрения на механизм первичного акта реакции окисляющегося вещества с кислородом. До сих пор живут, развиваясь и совершенствуясь, две теории: 1) сначала происходит разрыв молекулы 02 на на два атома О; 2) молекула 02 реагирует как таковая, а разрыв кислород-кислородной связи осуществляется уже в каких-то первоначально образующихся соединениях [45, 46]. Молекулярный кислород обладает большим сродством к электрону (Еа = 1.4670 эВ) и легко присоединяет один электрон, превращаясь тем самым в суперокисдный анион-радикал О , называемый часто суперокисид-ионом (ур. 1). Межъядерное расстояние в молекулах кислорода равно 1.209 А, а в супероксидном анион-радикале- 1.29 А [45]. На воздухе легко образуются супероксиды щелочных и щелочноземельных металлов. Металл в этих реакциях выступает в роли донора электрона, а молекула кислорода - в роли акцептора. Многие жизненно важные микроэлементы, такие как Си, Fe, Са, также образуют супероксиды (ур. 2). Легкость окисления соединений одновалентной меди объясняется образованием л-комплекса, который затем превращается в нестабильный, в отличие от обычного оксида меди (II), супероксид меди (II) [45]. При изучении многих реакций тонкого органического синтеза оказалось, что кислород может участвовать в каких-то промежуточных стадиях, не входя в состав конечных продуктов, то есть в суммарное стехиометрическое уравнение и является, согласно гипотезе А.Е. Шилова, посредником (М), осуществляющим транспорт электрона от донора (Д) к акцептору (А): Д-М-А. Видимо, число таких реакций гораздо больше, чем это кажется сейчас. В подобных реакциях молекулярный кислород играет роль либо инициатора, либо катализатора химического процесса.
Инициирующая роль кислорода при окислении органических веществ общеизвестна: молекула кислорода вклинивается в органическую молекулу, чаще всего по связи С-Н, образуя гидропероксид, который распадается на свободные радикалы. Молекулярный кислород, обладая высоким сродством к электрону, стремится захватить его от органической молекулы, при этом образуется ион-радикальная пара: катион-радикал органической молекулы и анион-радикал молекулярного кислорода (ур. 3). Органические катион радикалы чаще всего отщепляют протон, образуя свободный радикал (ур. 4). 31 Свободный радикал, в свою очередь, как активная частица может реагировать с молекулярным кислородом, рекомбинировать с супероксидным анион-радикалом, а образующийся органический пероксидный радикал также может реагировать с суперокисидным анион-радикалом, при этом последний отдает один электрон, то есть является восстановителем. Примеры таких радикальных процессов окисления органических веществ приведены в разделе (1.1.1.). Из вышесказанного можно видеть, что анион-радикал молекулярного кислорода проявляет двойственную реакционную способность. С одной стороны, в реакциях нуклеофильного замещения он ведет себя как анионный нуклеофил. В окислительно-восстановительных реакциях анион-радикал кислорода может, как все анионы, окисляться. С другой стороны, имея неспаренный электрон, супероксидный анион-радикал ведет себя как активная радикальная частица, например в реакциях рекомбинации с другими радикалами. Необходимо отметить, что донорные свойства О2 явно превалируют над акцепторными, о чем свидетельствует то, что в реакциях, где молекулярный кислород играет роль инициатора, практически всегда присутствуют пероксиды, да и протекают эти реакции чаще всего по цепному радикальному механизму. Аэробные условия жизни предполагают вовлечение молекулярного кислорода во все основополагающие процессы жизнедеятельности.
При этом, кроме полного четырехэлектронного восстановления молекулы 02 до воды в дыхательной цепи митохондрий в аэробных клетках всегда происходит и неполное одно-трехэлектронное восстановление с последовательным образованием различных активных форм кислорода по схеме (5) (здесь донорами электрона могут быть Fe2+, Си или семихиноны, а для второй и третьей реакции - также и 02 )
Регистрация кислородных радикалов в основном осуществляется методом ЭПР при быстром замораживании образцов. Так было доказано образование радикалов кислорода при радиолизе воды, при окислении in vivo органических соединений и при действии на них ультрафиолетового излучения [47, 48]. Термин «активные формы кислорода» (АФК) помимо свободных радикалов кислорода, к которым относятся супероксидный анион-радикал (02 ), его протонированная форма - гидропероксидный радикал (НО ), гидроксильный радикал (НО ), включает также молекулы пероксида водорода (Н202), синглетный кислород ( О2), озон (Оз) и гипохлорит (НОСІ) [49, 50]. Активные формы кислорода генерируются во всех частях клетки. Концентрации АФК в тканях невысоки: концентрация Н202 составляет около 10"8М, 02" около 10"ПМ, НО менее 10"11 М [49]. Генерируемые in situ активные формы кислорода существенно различаются по своей реакционной способности. В соответствии со схемой (5) последовательного восстановления кислорода окислительная способность активных форм кислорода возрастает от супероксидного анион-радикала к Н02 и далее к ОН. с Анион-радикал 0 более реакционноспособен, чем молекула кислорода, и не способен к длительному существованию в апротонных растворителях [38]. Он легко отдает электрон некоторым акцепторам: цитохрому С [51], тетранитрометану [52] и может не только восстанавливать подходящие акцепторы электрона, но и окислять некоторые соединения. Так, супероксидный анион-радикал, являясь чрезвычайно слабым окислителем, способен в физиологических условиях принять электрон только от таких соединений, которые образуют при окислении устойчивые радикалы, например, от аниона пирокатехина [53], в этом случае образуется устойчивый семихинон. Таким образом, анион-радикал 0 обладает амфотерными окислительно-восстановительными свойствами. С карбонильными соединениями супероксидный анион-радикал ведет себя как нуклеофил (ур. 6). Для О характерны реакции нуклеофилного присоединения и замещения (ур. 7-8), включающие внутренний перенос электронов. Характер образующегося пероксидного интермедиата зависит от электроотрицательности уходящей группы [47]. Более выраженные окислительные свойства проявляет протонированная форма супероксидного анион-радикала - гидропероксидный радикал (#02 ) Однако и эта частица сохраняет амфотерные окислительно-восстановительные свойства, то есть в определенных условиях может выступать в качестве восстановителя (ур. 9). Гидропероксидные радикалы способны оторвать атом Н от связи С-Н, могут атаковать двойные связи, например в нитронах (ур. 10), которые используются для регистрации радикалов НО2 и 0 методом ЭПР, причем гидропероксидные радикалы значительно лучше улавливаются нитронами в
Исследование пероксидного повреждения альбумина, инициированного системой нитрит-ион - пероксид водорода
Систематические исследования окисления альбумина, инициированного реактивом Фентона и его отдельными компонентами, а также аутоокисления белка показали, что во всех случаях процесс пероксидации протекает по единому цепному неразветвленному механизму, где частицами, повреждающими полипептидную цепь, являются активные формы кислорода, в частности, гидроксильный и гидропероксидный радикалы. Оксидативная модификация альбумина протекает через промежуточную генерацию гидропероксидов белка, которые участвуют в продолжении цепи. Обрыв цепей осуществляется путем рекомбинации углерод- и кислород-центрированных радикалов. Представляет интерес выяснить, будет ли пероксидация полипептидной цепи альбумина протекать по аналогичному механизму при ином способе инициирования цепей. В качестве системы, генерирующей АФК, в том числе наиболее активную частицу - радикал ОН, использовали смесь нитрит-иона и пероксида водорода. Выбор такой системы не является случайным. Неблагоприятные условия существования, стресс способствуют генерации дополнительного количества Н202 в организме как источника активных форм кислорода. Нитритное загрязнение окружающей среды активизирует Н202 и способствует дополнительной генерации АФК, интенсификации процессов пероксидации, приводящих к заболеваниям и ускоряющих процессы старения. Знание механизмов повреждающего действия АФК на живую систему и способов их генерации при участии различных химических соединений позволяет более объективно оценить уровень безопасного содержания нитрит-и нитрат-ионов в окружающей среде и последствия их попадания в организм.
Хорошо известно, что нитрит- и нитрат-ионы обладают выраженным метгемоглобинобразующим действием [99]. Изучена кинетика этого процесса, показано, что он может быть описан как цепной, осложненный вырожденным разветвлением цепей. При этом было установлено, что основным разветвляющим продуктом в реакции метгемоглобинообразования как под действием нитрит-иона, так и тетраоксида диазота является пероксид водорода. Генерация основного радикала, ведущего цепь ( N02), в системе оксигемоглобин - нитрит-ион осуществляется путем одноэлектронного окисления нитрит-иона пероксидом водорода. Параллельно генерируется и радикал ОН - важнейший инициатор пероксидного повреждения белков. То есть помимо процесса окисления железа гема должен осуществляться и процесс пероксидного повреждения полипептидной цепи, поэтому процесс пероксидного окисления полипептидной цепи, инициированный смесью Н2О2-N02 , был подробно изучен нами на примере альбумина. Реакция нитрит-иона с пероксидом водорода исследована достаточно подробно [264]. Однозначно доказано, в том числе и с применением метода ЭПР, что в реакции нитрит-иона с пероксидом водорода генерируются свободные радикалы, в том числе и активные формы кислорода [99, 265]. Было показано [78, 99, 265], что на начальном этапе реакции в системе нитрит-ион -пероксид водорода (ур. 1) образуется наиболее реакционноспособная из активных форм кислорода - гидроксильный радикал, который в дальнейшем может вовлекаться в разнообразные химические реакции, а также взаимодействовать с биомолекулами. По аналогии с уже изученным процессом окисления белка, инициированного реактивом Фентона, было логично предположить, что далее следует реакция повреждения полипептидной цепи радикалом ОН. Однако исследование этого процесса хемилюминесцентным методом на стадиях зарождения и расходования гидроксильного радикала показало, что суммарная интенсивность хемилюминесценции уменьшается при увеличении концентрации нитрит-иона (рис. 10). Эта зависимость свидетельствует, что в системе протекает реакция (2), которая приводит к уменьшению свечения за счет взаимодействия гидроксильного радикала с нитрит-ионом, которое хорошо известно из литературы [99].
Тогда дальнейший процесс окисления альбумина будет протекать за счет взаимодействия образовавшегося радикала диоксида азота с нативным белком, (yp. 3) с последующей генерацией углерод-центрированного радикала R и далее, аналогично описанным выше схемам, по реакциям (4 - 6) (что не противоречит литературным данным [22-24, 41, 44, 99, 117]). Нужно отметить, что пероксидное окисления белка за счет атаки полипептидной цепи гидроксильным радикалом протекает и в этом случае, так как зависимость суммарной интенсивности хемилюминесценции от концентрации белка (ур. 7), характеризующая именно этот процесс, имеет вид, аналогичный таковой в системе Alb-H202-Fe2+ (рис. 4). Однако при этом суммарная интенсивность хемилюминесценции значительно меньше, чем в предыдущем случае. Все это позволяет говорить о том, что деструкция белка с участием радикала ОН протекает параллельно основному пути, но не вносит существенного вклада в общую скорость процесса. При изменении концентрации альбумина в интервале 1.54 - 38.46 мкмоль/л диапазон изменения суммарной интенсивности хемилюминесценции составляет 45832 - 10784 (отн. ед.); с(Н202) = 80.9 ммоль/л, c(NOf) = 0.28 ммоль/л; т=30 с. Зависимость интенсивности хемилюминесценции от концентрации пероксида водорода в системе Alb-H202-N02 имеет сложный вид с перегибом при концентрации Н202 0.029 ммоль/л (рис. 11). До перегиба она соответствует уравнению (8) (рис. 12), что является следствием реакции (1), которая генерирует гидроксильный радикал. После перегиба эта же зависимость (рис. 11) имеет характер нисходящей степенной функции (с показателем степени Уг) от концентрации пероксида водорода (ур. 9) (рис. 13), что объясняется независимым процессом (ур. 10 - 11), который постоянно выводит определенную часть гидроксильного радикала из системы. Однако, в отличие от аналогичного процесса в системе Alb-H202-Fe \ это приводит не к генерации дополнительного пероксида водорода, а к образованию молекулярного продукта - надазотистой кислоты 0=N-OOH [124-126, 262], на которой происходит обрыв цепи этого независимого цепного процесса, в результате чего и наблюдается падение светового выхода.
Инактивации ацетилхолинэстеразы под действием активных форм кислорода
Белки-ферменты представляют особый интерес как субстраты в реакции с кислородсодержащими радикалами, так как их повреждение ведет к наиболее глубоким нарушениям жизненно важных процессов. В качестве объекта для изучения нами был выбран фермент ацетилхолинэстераза ( -субстрат), который, как известно из [78], легко повреждается активными формами кислорода, в том числе и гидроксильным радикалом. Мы предположили, что, воздействуя на ацетилхолинэстеразу, гидроксильный радикал, генерированный реактивом Фентона [242], модифицирует данный фермент в соответствии с закономерностями процесса пероксидного повреждения белков, предложенными нами в разделе (2.1.). Изменение структуры белка-фермента в результате модификации должно сказаться на каталитической активности ацетилхолинэстеразы. Таким образом, глубину воздействия гидроксильного радикала на фермент можно оценить и по степени изменения его активности. Мы предположили, что глубина пероксидного повреждения белковой молекулы и степень инактивации фермента, вызванные единой причиной, должны коррелировать между собой. Процесс инактивации фермента химическими агентами является результатом реакции между белком и инактивирующим агентом и протекает во времени. Скорости таких реакций варьируют в очень широких пределах. В связи с этим было необходимо выяснить длительность процесса инактивации в определенных условиях для того, чтобы в дальнейших исследованиях свести к минимуму возможность ошибки, а также оптимизировать условия проведения опыта. Чем глубже нарушение структуры белка в результате пероксидного повреждения, тем более значительное изменение активности фермента должно иметь место, однако даже при полной инактивации фермента протекает и дальнейший процесс его более глубокой деструкции. При увеличении времени контакта фермента с повреждающей системой должна нарастать глубина пероксидного повреждения белка.
О завершении процесса инактивации фермента судили по отсутствию нарастания степени инактивации при увеличении времени контакта фермента с буферным раствором, содержащим сульфат железа (II) и пероксид водорода (табл. 1). Таким образом нами было установлено, что процесс инактивации фермента в изучаемом диапазоне концентраций реагентов (табл. 1), завершается за 20-30 минут при рН 8.0. При подробном исследовании процессов пероксидного повреждения альбумина, инициированных реактивом Фентона (разд. 2.1.1.), были установлены закономерности образования продуктов пероксидного окисления белка, определяемых в виде 2,4-динитрофенилгидразонов (ДНФГ), от концентрации Н202 и Fe2+ в водном фосфатном буфере, рН 7.4. Так, при концентрации альбумина 30.8 мкмоль/л и концентрации ионов железа 0.18 ммоль/л количество генерируемых продуктов пероксидного повреждения зависит от концентрации пероксида водорода в соответствии с уравнением (1). При изменении концентрации пероксида водорода в интервале 0.08 - 1.94 моль/л диапазон изменения концентраций 2,4 динитрофенилгидразонов составляет 2.0 - 8.86 мкмоль/л. сднФг =6.44- (с„202)1/2; г = 0.994; л = 8 (1) При вариации концентрации ионов железа (Fe2+) в диапазоне 0.46 - 11.0 (ммоль/л), постоянных концентрациях Н202 (42.1 ммоль/л) и альбумина (30.8 мкмоль/л) количество образующихся в системе продуктов пероксидного повреждения белка изменяется в соответствии с уравнением (2). При этом диапазон изменения концентрации 2,4-динитрофенилгидразонов составляет 2.27 - 40.91 мкмоль/л. Как уже говорилось выше, если инактивация ацетилхолинэстеразы является прямым следствием степени пероксидного повреждения белка, то должны наблюдаться аналогичные зависимости изменения активности фермента от концентраций компонентов системы Фентона. При этом исследования должны проводиться при концентрациях компонентов реактива Фентона, заведомо меньших по сравнению с концентрациями, представленными в таблице 1, так как тогда процесс инактивации АХЭ должен замедляться и завершаться за время много большее, чем 30 минут. Так, в водном фосфатном буфере (рН 8.0) при концентрация фермента 0.40 мкмоль/л и концентрации ионов железа (Fe2+) 0.6 ммоль/л, в диапазоне изменения концентрации Н202 1.0 - 83.0 ммоль/л падение активности {А) фермента протекает по уравнению (3) в интервале от 5.6 до 51 %. Активность АХЭ без добавок инактивирующей смеси 1.4+0.1 ммоль/(мг-ч), время контакта 30 минут, 37С. А = 5.43 (cHi02 У12 + 0.66; г = 0.95; п = 8 (3) При изменении концентрации ионов Fe2+ в пределах 0.08 - 0.82 ммоль/л и постоянных концентрациях Н202 (83.0 ммоль/л) и фермента (0.40 мкмоль/л) падение активности (А) ацетилхолинэстеразы описывается уравнением (4).
При этом диапазон падения активности фермента составляет 11.1 - 89.6 %. Активность фермента без добавок инактивирующей смеси 1.3±0.1 ммоль/(мг-ч); время экспозиции 30 минут; 37С. Таким образом, имеет место идентичный характер зависимости падения активности ацетилхолинэстеразы и увеличения концентрации продуктов пероксидного повреждения полипептидной цепи альбумина от концентраций пероксида водорода и феррокатиона. В тех же условиях (при сохранении концентрации пероксида водорода, феррокатиона и АХЭ), когда наблюдается полная инактивация фермента (табл. 1), было показано, что дальнейшее увеличение концентрации Н202 приводит к снижению степени инактивации ацетилхолинэстеразы (табл. 2). Этот факт связан с тем, что увеличение концентрации пероксида водорода приводит к интенсификации реакции (5) и меньшая концентрация гидроксильного радикала вызывает меньшее пероксидное повреждение фермента. Полученный результат согласуется со снижением суммарной интенсивности хемилюминесценции с ростом концентрации пероксида водорода в системе Alb-H202-Fe2+ (разд. 2.1.1.1.). Генерированный в реакции (5) гидропероксидный радикал обладает меньшей реакционной способностью [25] и, следовательно,
Изучение пероксидного повреждения белков спектрофотометрическим методом
В случае спонтанной пероксидации к свежеприготовленному 1%-ному раствору лиофилизованного альбумина (из человеческой сыворотки) либо лиофилизованного гемоглобина лошади в бидистиллированной воде в объеме 0.1 - 0.9 мл добавляли фосфатный буфер (рН 7.4) (0.9 - 0.1 мл), доводя общий объем реакционной массы до 1.0 мл. Для инициирования процесса пероксидного окисления белка к раствору, содержащему белок и фосфатный буфер, последовательно добавляли компоненты инициирующей смеси I или II суммарным объемом от 0.2 до 0.8 мл, соответственно уменьшая объем вводимого фосфатного буфера из расчета конечного объема реакционной массы 1 мл.
Компоненты смеси I: 1) свежеприготовленная смесь 0.06%-ного водного раствора сульфата железа (II) и 0.06%-ного водного раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (в объемном соотношении 1:1); 2) 1.5%-ный водный раствор пероксида водорода. Компоненты смеси II: 1) 0.03%-ный водный раствор нитрита натрия; 2) 1.5%-ный водный раствор пероксида водорода. При изучении влияния ингибиторов на степень повреждения полипептидной цепи перед введением инициирующей смеси добавляли 0.1 -0.6 мл водного раствора изучаемого ингибитора различной концентрации. При исследовании зависимости количества образующихся конечных продуктов пероксидного окисления белка от концентраций вводимых компонентов концентрации последних варьировали за счет изменения концентраций исходных растворов и изменения объемов вводимых растворов с учетом конечного объема реакционной массы 1 мл. Далее проводили экспозицию реакционной массы на водяной бане при 37С в течение 15 минут. Процесс пероксидного окисления альбумина останавливали добавлением 1 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты. К полученной смеси добавляли 1 мл 0.2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2н. НС1, таким образом обрабатывая образовавшиеся карбонильные фрагменты для получения окрашенных 2,4-динитрофенилгидразонов. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч. Образовавшийся осадок был отделен центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Полученный осадок отмывали от избытка 2,4-динитрофенилгидразина, для чего к нему прибавляли 3 мл смеси этанола и этилацетата в объемном соотношении 1:1, отделяя осадок центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин.
Подсушенный на воздухе осадок растворяли в 5 мл 8 М. водного раствора мочевины, прибавляя 1-2 капли 2н. НС1 (для лучшего растворения), смесь нагревали на водяной бане при 37 С до полного растворения осадка. Интенсивность процесса повреждения полипептидной цепи оценивали спектрофотометрически по накоплению окрашенных гидразонов [271] на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 363 нм. Расчет концентрации образовавшихся гидразонов проводили исходя из коэффициента молярной экстинкции (є) 2.2-104 л/(моль-см) [75]. К свежеприготовленному 1%-ному раствору лиофилизованного альбумина (из человеческой сыворотки) в бидистиллированной воде добавляли фосфатный буфер (рН 7.4), доводя общий объем раствора до 2.7 мл. Затем приливали 0.3 мл химического активатора хемилюминесценции - люминола (1-10" М раствор в димексиде, который хранили в холодильнике при 4С). Для инициирования процесса пероксидного окисления белка добавляли от 2.0 до 5.0 мл свежеприготовленной смеси 0.06%-ного водного раствора сульфата железа (И) и 0.06%-ного водного раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (в объемном соотношении 1:1). В реакционную массу, перелитую в кювету, помещенную в рабочую камеру хемилюминометра, впрыскивали 0.5%-ный раствор пероксида водорода от 5.0 до 2.0 мл (из расчета, что конечный объем реакционной массы должен составлять 10 мл). Для оценки интенсивности хемилюминесценции
