Содержание к диссертации
Введение
1 Минорные компоненты яда кобр 6
1. Введение 6
2. Нейротоксины 8
3. Ферменты 12
3.1. Оксидаза L-аминокислот 13
3.2. Нуклеазы 15
3.3. Гиалуронидаза 16
3.4. Ацетилхолинэстераза 16
3.5. Прочие гидролазы 17
4. Ингибиторы ферментов 19
5. Вещества, изменяющие показатели свёртываемости крови 22
6. Вещества, влияющие на систему комплемента сыворотки крови 27
6.1. Фактор яда кобры 27
6.2. Другие полипептиды, влияющие на систему комплемента. 32
7. Полипептидные соединения с иной функцией 33
7.1. Фактор роста нервов 33
7.2. Белки семейства CRISP 36
7.3. Олигопептиды и муцин-подобный гликопротеин. 37
8. Соединения непептидной природы 38
9. Заключение 39
2 Результаты и обсуждение 40
1. Выбор рациональной схемы выделения минорных компонентов ядов 40
2. Использование насекомых для определения общей токсичности соединений 48
3. Гликозилированный цитотоксин из яда кобры N. kaouthia 52
3.1. Структурная характеристика 52
3.2. Свойства гликозилированного цитотоксина 59
4. Белки семейства CRISP в ядах кобр JV! kaouthia и N. haje 63
5. Репролизин оксиагин из яда кобры N. oxiana 69
5.1. Структурная характеристика 69
5.2. Механизм влияния оксиагина на систему комплемента сыворотки крови 72
6. CVF из яда кобры N. melanoleuca 77
4 Экспериментальная часть 86
Выводы 96
- Нейротоксины
- Ингибиторы ферментов
- Соединения непептидной природы
- Репролизин оксиагин из яда кобры N. oxiana
Введение к работе
Актуальность проблемы
Яды кобр представляют собой сложные многокомпонентные смеси белков, содержащихся в разных количествах. Наиболее обильно представлены в ядах кобр высокотоксичные а-нейротоксины, цитотоксины и фосфолипазы А2. К настоящему времени их структуры, в целом схожие внутри каждой группы, а также механизмы действия изучены достаточно подробно. Однако яд кобр содержит множество минорньж компонентов иньж структурных типов. Диапазон биологической активности этих соединений весьма обширен, а токсичность зачастую на порядки ниже по сравнению с нейро- и цитотоксинами. Многие из них обладают уникальным набором фармакологических эффектов и воздействуют на различные функциональные системы организма животных.
Так, в частности, в ядах кобр идентифицированы белки, влияющие на рост и дифференцировку нейронов (например, фактор роста нервов), систему комплемента сыворотки крови (фактор яда кобры), систему свёртывания крови (различные факторы с про-и антикоагулянтной активностью) на мускариновые ацетилхолиновые рецепторы, опиоидные рецепторы, на клеточную адгезию, репродуктивную систему и многое другое, а также разнообразные ферменты и ингибиторы ферментов. Благодаря своим уникальным свойствам такие соединения ядов всё более интенсивно применяются как биохимические инструменты для исследования биологических процессов, особенно в силу того, что их, как правило, низкая токсичность позволяет проводить опыты не только in vitro.
На основании вышеизложенного весьма актуальным является идентификация и выделение минорньж белковых компонентов из яда кобр с последующим исследованием их биологической активности.
Цели и задачи исследования
Цель данной работы - идентификация и выделение из ядов кобр ранее неизвестных
минорньж белков, обладающих новыми структурными характеристиками.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: оптимизировать
условия фракционирования ядов четырёх видов кобр для выделения максимального числа
новых компонентов; провести идентификацию известных и поиск новьж соединений при
помощи анализа полученных фракций методом MALDI масс-спектрометрии и установления
полных или частичных аминокислотных последовательностей; усовершенствовать методику
определения общей токсичности минорньж компонентов ядов кобр; изучить биологическую
активность выделенных полипептидов. І рои НАЦИОНАЛЬНАЯ I
| БИБЛИОТЕКА !
! йчйзуя
Научная новизна и практическая ценность работы
Предложенная эффективная схема идентификации минорных белков, основанная на комбинации различных видов высокоэффективной жидкостной хроматографии и MALDI масс-спектрометрии, позволила идентифицировать в ядах кобр ряд новьж белков. Так, из яда кобры Naja kaouthia выделен гликозилированный цитогоксин - первый гликозилированный представитель семейства трёхпетельных токсинов, установлены его первичная структура, участок и тип гликозилирования. Установлено влияние гликозилирования на некоторые свойства цитогоксина. Впервые в ядах кобр обнаружен белок семейства CRISP (Cysteine-Rich Secretory Proteins - белки с высоким содержанием цисгеина). Показано, что в ядах кобр Naja kaouthia и Naja haje белки этого семейства представлены в виде набора нескольких нетоксичных гомологов. В яде кобры Naja oxiana впервые найден гликопротеин, относящийся к репролизинам яда змей. Этот белок является первым репролизином, для которого обнаружено ингибирование системы комплемента сыворотки крови по классическому пути. Фактор яда кобры (CVF) впервые выделен из яда кобры Naja melanohuca в виде двух форм, различающихся по активности. Эти соединения могут быть использованы при исследовании механизма функционирования системы комплемента. Предложено тестирование общей токсичности минорных компонентов яда кобр на насекомьж, что сокращает расход исследуемого вещества.
Апробация полученных данных и публикации.
По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Результаты были доложены на XIII Международном конгрессе Международного общества по токсинологии (Париж, 2000), на V чтениях, посвященных памяти академика ЮА Овчинникова (Москва-Пущино, 2000), на X и XI Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2002; 2003) и на Ш съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).
Структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на/СУ страницах машинописного текста и состоит из введения, трёх глав основной части (обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 131 ссылку. Материал иллюстрирован 26 рисунками и 3 таблицами.
Нейротоксины
Токсины яда кобр разделяются на две большие функциональные группы: цитотоксины и нейротоксины. Цитотоксины повреждают ткани путём лизиса клеток [14]. Нейротоксины нарушают передачу нервного импульса. Постсинаптические нейротоксины (а-нейротоксины) связываются подобно а-тубокурарину с никотиновым ацетилхолиновым рецептором (н-АХР) постсинаптической мембраны нервно-мышечного синапса, при этом блокируют участки связывания ацетилхолина и посредством этого предотвращают деполяризующее действие медиатора на мембрану [16]. к-Нейротоксины блокируют нейрональный н-АХР [17]. В целом, эти группы соединений нельзя назвать ни низкотоксичными, ни малопредставленными. Характерная особенность строения токсинов кобр - «трёхпетельная структура», заключающаяся в наличии трёх полипептидных петель, выступающих из гидрофобной сердцевины и ограниченных дисульфидными связями, стабилизирующих молекулу в активной конформации: их восстановление полностью устраняет токсический эффект полипептида. Аминокислотными остатками, важными для поддержания третичной структуры, считаются, кроме цистеина, Туг25, Gly40 и Рго44 (в нумерации эрабутоксина Ъ) [18]. По структуре а-нейротоксины кобр делятся на два основных типа: короткие (тип I), состоящие из 60-62 аминокислотных остатков и имеющие 4 внутримолекулярных дисульфидных связи, и длинные (тип II) нейротоксины, состоящие из 66-74 остатков и имеющие пятую дисульфидную связь в средней петле II [9, 16]. К «промежуточным» типам с «трёхпетельной» структурой, но с относительно невысокой токсичностью можно отнести: мускариновые токсины (состоят из 65-66 остатков, но имеют 4 дисульфидных связи) [19] и «слабые токсины» (состоят из 62-68 остатков, но пятую дисульфидную связь имеют в N-концевой петле I) [20]. Мускариновые токсины, впервые выделенные из яда мамб, обладают высоким сродством к мускариновому ацетилхолиновому рецептору (м-АХР). Большинство аминокислот, инвариантных в мускариновых токсинах, инвариантно или высококонсервативно в других трёхпетельных токсинах, и только ТугЗО уникален для них [15]. Селективность определяется участками 28-30 и 31-33. Для токсинов МТ1 и МТ2 из яда мамбы D. angusticeps установлено, что иодирование, предположительно по ТугЗО, приводит к повышению селективности [21].
Единственный мускариновый токсин, для которого установлена пространственная структура методами двумерной спектроскопии ядерного магнитного резонанса и молекулярного моделирования — токсин МТ2 [22] (рис. 1-а). Он имеет особенности, не встречающиеся у других «трёхпетельных» токсинов с установленной пространственной структурой: характерный изгиб петли I, образованные трехтяжевым р-слоем два гидрофобных кластера (вокруг Phe25 на одной поверхности петли II и около Тгр28 на противоположной поверхности этой петли) и выстроенньк в ряд через петли II и III основных аминокислот (Lys26, 40, 48 и Arg56). И, наконец, петля II между остатками Cys24 и Cys42 содержит 17 аминокислот (в других токсинах 16), что приводит к её закручиванию. На её узком окончании сильно выдаётся вперёд Lys34 (у MLTP-2 и некоторых других здесь - Arg), занимающий удобное положение для проникновения в щель между трансмембранными доменами м-АХР и связывания с консервативным остатком Asp на её дне [15,22]. Из яда кобры N. kaouthia выделено 3 полипептида (MLTP-1-3), имеющих наибольшее сходство в аминокислотной последовательности (до 73%) с мускариновыми токсинами мамб. MTLP-1 (выход 0.2% от массы яда) связывается in vitro с невысоким сродством со всеми подтипами м-АХР, предпочитая мі-подтип. Для MTLP-2 и -3 активность не установлена (выход 0.2% и 0.02%, соответственно) [23]. Исследование их токсичности не проводилось.но мускариновые токсины мамб не считаются токсичными [15]. Слабые токсины получили такое название ввиду более низкой токсичности по сравнению с а-нейротоксинами (LD5o 5-80 и более мг/кг против 0.04 - 0.3 мг/кг). В аминокислотной последовательности слабых токсинов присутствуют некоторые аминокислотные остатки, важные для их связывания с н-АХР как мышечного типа, так и а7 типа. Например, WTX из яда N. kaouthia содержит Lys27 и Lys47 для узнавания мышечного и Arg37 для узнавания обоих типов рецептора. Поэтому слабые токсины способны к слабому связыванию (полипептид Wntx-5, химически синтезированный по аминокислотной последовательности, выведенной из к-ДНК ядовитых желёз N. sputatrix) и ингибированию (WTX) этих типов н-АХР. Слабый токсин NNA2 из яда кобры N. atra ингибирует сокращения мышцы лягушки, вызываемые ацетилхолином. Остатки, важные для поддержания третичной структуры, консервативны у всех слабых токсинов кобр (однако Туг25 заменён на Phe) [20]. Пространственная структура слабых токсинов к настоящему времени установлена для таковых из яда крайтов. Один из наиболее токсичных слабых токсинов, кандоксин из яда крайта Bungarus candidus (LD50 0.83 мг/кг), имеет на гомологичных позициях ряд аминокислотных остатков, существенных для связывания н-АХР мышечного типа (Хгруб (ТгрЗІ, Arg35, Gly36, Arg38, Glu40, а также Lys28 и Lys47) (рис. 1-6).
Данные КД (кругового дихроизма) и компьютерное моделирование показали, что для NNA2 нехарактерно такое большое количество Р-слоёв, как для коротких и длинных нейрогоксинов. Предполагается, что такая менее организованная структура приводит к снижению активности [25]. В целом, однако, принято считать, что действительная молекулярная мишень слабых токсинов ещё не установлена [20]. Существуют ли нейротоксины, воздействующие на адренэргическую иннервацию, точно не установлено. Во всяком случае, внутривенное введение нейротоксической фракции яда египетской кобры N. haje вызывает у кроликов повышение концентрации в крови кортизола и инсулина, падение уровня адренокортикотропного гормона, общего содержания липидов, триацилглицеридов, жирных кислот и гипергликемию, связанную с гликогенолизом в печени и почках. Эти эффекты позволяют предполагать, что данная фракция воздействует на адренокортикальные клетки, модулирующие содержание в крови инсулина и глюкозы при стрессе [26]. Интересное соединение обнаружено в яде королевской кобры (Ophiophagus hannah): а-нейротоксин, названный ганнальгезин, в дозе 16-32 нг/г массы тела оказывал анальгетический эффект, который блокировался налоксоном и L-NG-нитроаргинилметиловым эфиром, что позволяет предположить вовлечение в действие ганнальгезина опиоидных рецепторов и системы оксида азота, соответственно. Неврологических и мышечных эффектов в указанных дозах он не вызывал, имея LD50 80 нг/г внутрибрюшинно [27]. 3. Ферменты Проведённое сравнительное исследование ядов девяти видов кобр рода Naja обнаружило в них фосфолипазу А2, оксидазу L-амино кислот, 5 -нуклеотидазу и щелочную фосфомоноэстеразу, присутствующие в нескольких изоформах; кроме этого, были выявлены следующие ферментные активности: гиалуронидазная, ацетилхолинэстеразная, фосфодиэстеразная и протеазная [28]. Были продемонстрированы межвидовые различия в содержании в ядах фосфолипазы А2, ацетилхолинэстеразы, гиалуронидазы и фосфодиэстеразы. При изучении яда королевской кобры Ophiophagus hannah, был установлен в нём очень высокий (более чем на порядок в сравнении с ядами других змей) уровень активности щелочной фосфомоноэстеразы. Высокомолекулярная фракция (свыше 20 кДа) содержит 58% белка яда (у кобр рода Naja — менее 25%) и отвечает практически за всю его ферментативную активность, исключая фосфолипазную, будучи при этом нетоксичной для мышей в дозах до 5 цг/г внутривенно (в/в) (LDso нейротоксической фракции 0.23 ur/г в/в) [29]. Определение токсичности фракций яда N. охіапа на мышах показало, что нетоксичными являются фракции, отвечающие за холинэстеразную, гиалуронидазную и АТФ-пирофосфатазную активность яда, а также одна из двух фракций с фосфолипазной активностью [30]. Наиболее полно охарактеризованными ферментами яда кобр являются фосфолипазы А2 (ФЛА2), катализирующих гидролиз фосфолипидов клеточных мембран. ФЛА2 обильно представлены, с преобладанием высокотоксичных изоформ, в ядах различных видов кобр. На этом основании они в настоящем обзоре не рассматриваются.
Ингибиторы ферментов
Из яда кобр выделены ингибиторы сериновых протеиназ, относящиеся к Куниц/БПТИ (бычий панкреатический ингибитор трипсина) семейству ингибиторов, широко распространённому в животных организмах. Они характеризуются консервативной укладкой полипептидной цепи (приблизительно из 60 аминокислотных остатков), стабилизированной тремя дисульфидными связями. Филогенетически, нетоксичные ингибиторы семейства Куниц/БПТИ яда змей родственны нейротоксинам дендротоксинам (яды мамб) и В-цепи Р-бунгаротоксинов (яды крайтов), блокаторам калиевых и кальциевых каналов, утратившим ингибиторные свойства [49]. Ингибиторы сериновых протеиназ яда кобр состоят из 57 аминокислотных остатков и имеют молекулярную массу около 6,2 Ша. Ингибитор трипсина из яда кобры N. naja гомологичен (70% идентичных аминокислотных остатков) аналогичному ферменту, выделенному из яда другой кобры, N. nevia, а также ингибитору трипсина из поджелудочной железы быка (42% идентичных остатков) [50, 51]. Ингибитор химотрипсина N. naja структурно сходен с ингибитором трипсина, но содержание его в яде значительно ниже [52]. Данные соединения содержат немного инвариантных остатков. Однако, как и в случаях полипептидов яда кобр других структурных типов, имеет место строгое расположение остатков цистеина и одинаковое распределение дисульфидных связей (5- участвующие в формировании дисульфидных связей, подчёркнуты. Вариабельные остатки выделены полужирным курсивом. Активный участок помещён в рамку. 55, 14-38, 30-51). У нетоксичных ингибиторов семейства Куниц/БПТИ змей более консервативна сердцевина молекулы и N-концевая последовательность, но не область активного участка [49]. Приведённые на рисунке 2 ингибиторы сериновых протеиназ имеют активный участок в положении 15-16, образованный остатками лизина и аланина, за исключением ингибитора химотрипсина, у которого его образуют Phe-Gly. Полагают, что Phe-15 главного контактного участка с протеазой обусловливает специфичность ингибитора в отношении химотрипсина [52]. Имеется указание, что для проявления своего действия ингибиторам трипсина и химотрипсина важен Gly-36 [52]; этот остаток консервативен и у двух других ингибиторов сериновых протеиназ яда кобр (рис. 2). Трёхмерная структура определена для ингибитора Куниц/БПТИ из яда Bungarus fasciatus — ингибитора химотрипсина, состоящего из 65 аминокислотных остатков. Она имеет дважды-сложенный антипараллельный р-слой с р-изгибом Ser27-His30 и С-концевую а-спираль. В активном участке у данного соединения находится Asnl7, этим объясняют его низкую ингибиторную активность [53].
Кобра-цистатин, ингибитор цистеиновой протеиназы, был выделен из яда тайваньской кобры N. naja atra [54]. Он представлен двумя формами, имеющими pi 6,2 и 6,1 и молекулярные массы 11,870 и 12,087 kDa, соответственно. Кобра-цистатин гомологичен другим цистатинам (25-40% идентичных остатков), особенно недавно описанному цистатину М человека, имея с ним одинаковую вставку из 5 аминокислотных остатков. Для цельного яда кобры N. ох шпа показана антихолинэстеразная активность [30], однако ингибирующая субстанция до сих пор не идентифицирована. 5. Вещества, изменяющие показатели свёртываемости крови Вещества, влияющие свёртываемость крови, являются важными составляющими ядов различных змей. При этом, выступая как коагулянты, они могут иметь протромбошіастино- или тромбино-подобную активность, активировать фактор X, XI или V, активировать протромбин; как антикоагулянты — могут иметь фибриногенолитическую или фибринолитическую активность, стимулировать высвобождение активатора плазминогена рядом клеток, оказывать ингибирующее или разрушающее действие на любой фактор свёртывания крови, активировать протеин С, ингибировать формирование протромбиназного комплекса. Кроме того, эти соединения могут выступать как индукторы, ингибиторы или усилители агрегации тромбоцитов [55]. Не всеми, но некоторыми из этих свойств обладают компоненты яда кобр (рис. 3); подавляющее большинство из них является протеиназами. В литературе они иногда встречаются под названиями, отражающими их физиологическую активность, как, например, активатор фактора X коагуляции крови, выделенный из яда королевской кобры {Ophiophagus hannah). Он не активирует протромбин, не оказывает влияния на фибриноген, а действует только на фактор X. На принадлежность его к протеазам указало то, что действие его абсолютно зависимо от кальция и угнетается ингибиторами сериновых протеаз, например, трипсиновым ингибитором сои и, частично, - L-цистеивом [56]. Активированный фактор X требует в качестве кофактора активированный фактор V коагуляции крови (Ас-глобулин). Белки, активирующие фактор V, выделены в основном из ядов змей семейства Viperidae. Однако, в яде кобры N oxiana содержится (в количестве около 3%) кислый одноцепочечный полипептид с молекулярной массой 48 kDa, способный активировать фактор V, разрезая его на два фрагмента в 90 и 77 kDa.
Конечный продукт этой гидролитической реакции сравним с протромбин-активирующим фактором V по способности служить кофактором фактора X. Константа Михаэлиса для протромбина с яд-активируемым фактором Va в 9 раз выше, чем в физиологических условиях [57]. Авторы также определили способность цельных ядов ряда змей семейства Elapidae активировать фактор V; наиболее высокая удельная активность оказалась у яда Hemachatus hemachatus. Некоторые протеазы обладают несколькими различными эффектами. Так, например, металлопротеиназа мокархагин из яда Naja mossambica mossambica гидролизует рецептор фибриногена (гликопротеин ПЬ-Ша), экспрессированный на поверхности тромбоцитов, и таким образом ингибирует агрегацию тромбоцитов [58]. Ранее было показано, что мокархагин устраняет у тромбоцитов способность связывать адгезивный лиганд, фактор фон-Виллебранда [59]. Мокархагин ингибирует также агглютинацию тромбоцитов; этот эффект блокируется ЭДТА или диизопропилфторфосфатом, ингибитором протеиназ [58]. Этот фермент отщепляет декапептид от N-концевого участка PSGL-1, миелоидного рецептора Р-селектина на нейтрофилах, предотвращая таким образом связывание Р-селектина с PSGL-1 [60]. Во всех случаях эффекты необратимы по причине протеолиза мишеней. Тем не менее, поскольку мокархагин связывает гепарин [58] и предпочитает отрицательно заряженный кластер сиаломуцина PSGL-1 [60], то он, по-видимому, использует свои лектин-подобные свойства в распознавании и/или связывании мишеней. В базе данных TrEmbl размещена аминокислотная последовательность Mocarhagin 1, выведенная из гена-предшественника; она имеет 83% идентичных остатков с N-концевой аминокислотной последовательностью мокархагина, определённой прямым секвенированием (см. рис. 17). В противоположность этому для металлопротеиназы каоутиагина из яда N naja kaouthia установлен к настоящему времени единственный участок протеолиза: она селективно гидролизует связь P708-D709 фактора фон-Виллебранда, в результате чего падает агрегирующая и коллаген-связывающая способность этого фактора [61]. В аминокислотной последовательности каоутиагина найдено две дизинтегрин-подобных области, которые, как показано в случае инактивации протеиназного домена, ингибируют агрегацию тромбоцитов, вызываемую коллагеном [62]. Обе металлопротеиназы активны только в присутствии ионов металлов: первая — цинка или кальция, вторая — любого двухвалентного иона металла. В яде кобры N. nigricollis обнаружена фибриногеназа, названная F1 (выход 3%) [63]. F1 - одноцепочечный протеин с молекулярной массой около 58 кДа и изоэлектрической точкой выше 10, является цинк-зависимой металлопротеиназой. Альфа-фибриногеназы расщепляют альфа-цепь фибриногена и ингибируют агрегацию тромбоцитов. Протеаза F1 - альфа-фибриногеназа с оптимумом рН 8-10, активная также в отношении сс-макроглобулина и фибронектина. К тому же она ингибирует агрегацию тромбоцитов в цельной крови (дозозависимо), но в промытой суспензии тромбоцитов резко снижает свою активность, т. е. требует присутствия плазмы. Было установлено, что антиагрегирующая способность F1 не зависит от ей действия на фибриноген, поскольку продукты F1-опосредованного расщепления фибриногена не вызывают значительного ингибирования агрегации тромбоцитов; более того, эта активность четырёхкратно усиливается в отсутствие плазменного фибриногена (при применении так называемой дефибриногенированной плазмы) [64]. Кроме этого, для яда N. nigricollis была определена тромбино-подобная активность [65].
Соединения непептидной природы
Эта группа включает в себя широко распространённые неорганические ионы, свободные аминокислоты, нуклеозиды, липиды, не являющиеся ядо-специфичными, и поэтому в данном обзоре не рассматривается. Следует лишь заметить, что для нуклеозидов (аденозина, гуанозина, инозина) показано или предполагается кооперативное действие с большинством остальных соединений яда кобр [13], а ионы металлов (прежде всего кальция, магния и натрия) необходимы для функционирования некоторых ферментов. Яды кобр представляют собой сложнейшие смеси белков и пептидов, обладающие широчайшим спектром биологической активности. Превалирующие высокотоксичные компоненты, будучи наиболее полно охарактеризованными, отвечают лишь за небольшой участок этого спектра.
Очевидно, что малопредставленные компоненты вносят свой вклад в общую токсичность яда, воздействуя на организм жертвы сразу по многим направлениям и при этом потенцируя эффекты других компонентов. Некоторые из минорных низкотоксичных соединений могут оказаться (или уже являются) полезными инструментами для биохимических исследований, также как и прототипами лекарственных средств. 1. Выбор рациональной схемы выделения минорных компонентов ядов. Белки новых структурных типов можно обнаружить в малоисследованных ядах или только среди минорных компонентов достаточно детально изученных ядов. Содержание основных компонентов в ядах кобр может достигать 10% (цитотоксины) и более (25% - а-кобратоксин) от массы сухого яда. В то же время содержание отдельных компонентов порой не превышает долей процента, (вследствие чего они не были обнаружены ранее), поэтому для выделения таких соединений требуется многостадийная схема очистки, основанная на сочетании различных видов хроматографии с чувствительным методом идентификации белков. В настоящее время работа с такими минорными компонентами стала возможной благодаря развитию эффективных методов разделения белков (высокоэффективной жидкостной хроматографии, ВЭЖХ) и их анализа (MALDI масс-спектрометрия, matrix-assisted laser desorption ionization, ионизация посредством лазерной десорбции, MALDI МС). Белки новых структурных типов с большой вероятностью должны отличаться по массе от уже известных белков.
Основным способом первичной идентификации белка яда нами было выбрано определение молекулярной массы методом MALDI МС, высокая чувствительность которого позволяет обнаруживать минорные компоненты сложных белковых смесей и устанавливать молекулярные массы этих белков на всех этапах их выделения и очистки. Наиболее полно охарактеризованные компоненты яда кобр перекрывают следующие диапазоны масс: токсины трёхпетельного типа - 6.4-8.3 кДа; фосфолипазы А2 - 13-14 кДа. Молекулярные массы белковых компонентов новых структурных типов должны, очевидно, находиться за пределами этих диапазонов. Исходя из этой характеристики, в качестве первого этапа схемы разделения ядов кобр мы использовали гель-фильтрацию, позволяющую фракционировать белки по молекулярной массе. В результате гель-фильтрации нам удалось разделить яд кобр Naja kaouthia, N. haje и N. melanoleuca на следующие фракции (рис. 5-а, б, в, соответственно): I - содержащую соединения с массами более 30 кДа; II — 9-30 кДа; III — содержащую основные токсические компоненты с массами 6-8 кДа и кислые фосфолипазы А2 и IV — содержащую низкомолекулярные вещества. Основные компоненты фракции IV нами были идентифицированы как аденозин, гуанозин и инозин. Таким образом мы отделяли соединения с массами свыше 9 кДа от большинства компонентов яда, в первую очередь от высокотоксичных. Наилучшие результаты разделения яда кобр на фракции по молекулярной массе были получены на большой (4.5x150 см) колонке, позволяющей начать выделение минорных компонентов с нанесения до 1 г яда за этап, с носителем сефадекс G-50 sf (в качестве носителя пробовались и другие марки сефадекса, а также акрилекс, сефакрил и молселект). Фракцию II, содержащую главным образом соединения основного характера, разделяли методом ВЭЖХ на катионообменной колонке НЕМА BIO 1000 СМ. Полученные после этого фракции анализировали методами электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПАГЭ) и MALDI МС. Наряду с известными соединениями (фактор роста нервов, молекулярная масса 13.1 кДа, фосфолипазы А2,13.4-13.6 кДа, тайкобрин, 12.1 кДа), в яде N. kaouthia были (рис. 6-а) обнаружены ранее не описанные основные соединения с массами 25.0 кДа (фракция П-6), 23.6 и 23.7 кДа (фракция П-10) и 24.2, 24.3 и 9.3 кДа (фракция 11-11), а в яде N. haje (рис. 6-6) - с массами 25.0 кДа (фракция II-4), 23.6 кДа (фракция П-7) и смесь соединений кислотного характера (фракция П-1), содержащая вещество с массой 25.0 кДа. Фракцию II-1 далее разделяли на анионообменной колонке НЕМА ВЮ 1000 DEAE (рис. 7-а). Компоненты указанных фракций подвергали очистке методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac СІ8 (рис. 7-б,в) и определяли молекулярные массы белков с помощью MALDI МС. В результате из яда N. kaouthia выделены белки Nk25 (молекулярная масса 24953 Да, основной компонент фракции П-6), Nk24 (MALDI масс-спектр характеризуется наличием двух близких по интенсивности сигналов, соответствующих массам 24080 и 24179 Да; компонент фракции II-11» рис. 7-6), Nk23 (также два сигнала, 23621 и 23704 Да; компонент фракции II-10, рис. 7-в) и гликопротеин (GP, рис. 7-6) с массой -9,3 кДа. Из яда TV. haje выделены белки Nh24 (23590 Да, основной компонент фракции П-7), Nh25 (24960 Да, основной компонент фракции П-4) и кислый белок NK25A (25006 Да, компонент фракции П-1, рис. 7-а). С целью разработки условий тестирования общей токсичности компонентов ядов кобр мы выделили несколько известных компонентов разных типов из ядов N. kaouthia (цитотоксины І, ІП и IV, длинный нейротоксин а-кобратоксин, слабый нейротоксин WTX, мускариновый токсин MTLP1, фосфолипазу А2 CMII, рис. 8) и N. oxiana (цитотоксины I и II и короткий нейротоксин II). Для этого основные токсические фракции ПІ ядов разделяли на катионообменной колонке НЕМА BIO 1000 СМ, дальнейшую очистку полученных белков проводили при помощи обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vidac С18.
Идентификацию компонентов осуществляли посредством MALDI МС и определения N-коицевой аминокислотной последовательности. Фракции I после гель-фильтрации ядов N. kaouthia и N. melanoleuca, содержащие в основном кислые белки с молекулярными массами свыше 30 кДа, разделяли при помощи ВЭЖХ на анионообменной колонке НЕМА ВЮ 1000 DEAE (рис. 9-а,б). Анализ полученных фракций методами ДСН-ПАГЭ и MALDI МС показал наличие в яде N. melanoleuca двух белков, близких по физико-химическим свойствам ранее охарактеризованному CVF (Cobra venom factor, фактор яда кобры) из яда N. kaouthia [75]. Для всех видов ионообменной ВЭЖХ применялся градиент концентрации аммонийно-адетатного буфера (рН 7.5), удаляющегося из фракций в процессе лиофилизации. Буферная ёмкость ацетата аммония минимальна при нейтральном значении рН, а буферы с низкой ёмкостью часто дают лучшее разрешение, чем с высокой. В частности, аммонийно-ацетатный буфер давал намного лучшее разрешение при разделении фракции I, чем буфер Трис-HCL Для выделения нового белка с антикомплементарной активностью из яда кобры N oxiana была применена другая схема, выбор которой был продиктован необходимостью повторения стадий, описанных ранее другими авторами [85]. Согласно такому подходу, для получения фракции CFB-III, содержащей белки, ингибирующие систему комплемента сыворотки крови, яд фракционировали на колонках с DEAE-Сефарозой CL-6B и затем СМ-Сефарозой CL-6B. Далее эту фракцию мы разделяли методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac СІ8 (рис. 10-а). В итоге был выделен новый гликопротеин (фракция V) с молекулярной массой около 50 кДа (рис. 10-6) — ингибитор системы комплемента сыворотки крови. Поскольку мы обнаруживали антикомплементарное действие по ингибированию лизиса эритроцитов под действием комплемента сыворотки, то для удаления следов цитотоксина фракция V подвергалась рехроматографии в тех же условиях. Наличие углеводной части в составе всех белков определяли по окрашиванию полосы белка в геле реактивом Шиффа. 2. Использование насекомых для определения общей токсичности соединений. Поскольку яд кобры высокотоксичен, можно ожидать, что и многие выделенные соединения окажутся в большей или меньшей степени токсичными.
Репролизин оксиагин из яда кобры N. oxiana
Из полученных при разделении обращённо-фазовой ВЭЖХ фракции CFB-III только фракция V (рис, 10-а) обладала выраженной антикомплементарной активностью (основной белок фракции CFB-Ш, цитотоксин II, имел по сравнению с ней удельную активность на 3 порядка ниже). Выход целевого белка, названного оксиагином, из фракции V составил 1.3% от массы сухого яда. Анализ оксиагина методом ДСН-ПАГЭ в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях показал, что он содержит единственную гликозилированную полипептидную цепь с молекулярной массой около 50 кДа. MALDI МС дала величину 49.7 кДа (рис. 10-а, вставка). Появление набора близких полосок в невосстанавливающих условиях можно объяснить существованием нескольких денатурированных форм белка с интактными дисульфидными связями, возможно, вызванных условиями ДСН-ПАГЭ, поскольку эти полоски исчезают в восстанавливающих условиях (рис. 10-6). Анализ углеводного состава показал присутствие галактозы, N-ацетилглюкозамина, фукозы и маннозы в молярном соотношении 2:2:1:5, характеризующим углеводную часть молекулы как N-гликан сложного типа. Видимо, гликан совершенно необходим очищенному белку для поддержания его в растворимом состоянии, поскольку при добавлении PNG-F в отсутствие детергента оксиагин полностью и довольно быстро вьтадает в осадок вне зависимости от рН раствора (данные не показаны). N-концевые аминокислотные последовательности пиридилэтилированного белка и некоторых фрагментов его расщепления бромцианом были определены деградацией по Эдману. Сравнение установленных последовательностей с таковыми известных белков показало, что наш белок имеет ярко выраженное сходство с репролизинами из ядов змей, которых на основании данных по первичной структуре относят к металлопротеиназам (рис. 18). Подсемейство репролизинов родственно и имеет общую организацию генов с семейством белков ADAMs. Структура генов соответствует следующей доменной организации белков-предшественников этих соединений: сигнальная последовательность - про-домен (зимоген) -металлопротеиназный домен - дезинтегриноподобный домен -богатый цистеином домен — некоторые другие. Зрелые репролизины содержат не все перечисленные домены, например, некоторые состоят только из металлопротеиназного домена, протеолитическое созревание других приводит к высвобождению в яд одного дезинтегрино подобно го домена [67]. N-концевая последовательность оксиагина соответствует N-концевой последовательности металлопротеиназного домена репролизинов (особенно велико сходство с мокархагином из яда кобры N. mossambica, Q8JGN1).
Один из бромциановых фрагментов оказался гомологичен части С-концевой области богатых цистеином доменов мокархагина и репролизина каоутиагина из яда N. kaouthia (Р82942). ги два белка имеют металлопротеиназный, дизинтегриноподобный и богатый цистеином домены и, таким образом, относятся к репролизинам класса Р-Ш [67]. Длина полипептидной цепи оксиагина сопоставима с длиной зрелого мокархагина и каоутиагина, а гомология с этими белками как в N-, так и в С-концевой области позволяет рассматривать его как репролизин класса Р-Ш. Наш белок назван оксиагином по аналогии сними. Однако для двух бромциановых фрагментов оксиагина [(M)IYIYLNFNFA и M)TWTPPEEEGY] нам не удалось установить гомологичные участки ни в одной из известных последовательностей металлопротеиназ. Поэтому говорить о нём как о типичном репролизине следует с осторожностью. Вероятно, оксиагин является новым структурным аналогом репролизинов класса Р-Ш. Для ряда репролизинов (например, гомологов оксиагина 042138, Q9PT47-50, рис. 18) протеолитическая активность не установлена. С использованием некоторых обычных субстратов протеиназ (фибриноген, р-казеин, гемоглобин, миоглобин, ферритин, химотрипсиноген и мелиттин) для оксиагина также не удалось обнаружить протеолитическую активность. S.Z Механизм влияния оксиагина на систему комплемента сыворотки крови Оксиагин обладал способностью эффективно ингибировать дозо-зависимым образом активацию системы комплемента сыворотки крови по классическому пути. Для установления механизма антикомплементарного действия оксиагина мы использовали метод, основанный на лизисе эритроцитов барана сывороткой крови морской свинки. Способность оксиагина к ингибированию активации системы комплемента снижалась после предварительной 30-минутной инкубации с сывороткой (рис. 19-а), что может объясняться медленной инактивацией оксиагина некоторыми компонентами сыворотки (например, при связывании с сывороточными иммуноглобулинами). Далее было проверено влияние оксиагина на последовательные стадии активации комплемента по классическому пути. Эритроциты барана, сенсибилизированными иммуноглобулинами кролика, (ЕА) инкубировались с оксиагином и затем центрифугированием отделялись от избытка оксиагина. После ресуспендирования осадка в литической системе наблюдался ингибирующий эффект оксиагина, лишь слегка сниженный центрифугированием (рис. 19- На этой стадии наблюдалась также гемагглютинация. Эффект ингибирования полностью подавлялся инкубацией смеси ЕА-оксиагин с иммуноглобулинами G человека. Это означает, что оксиагин первоначально связывается не с компонентами комплемента, а с ЕА, и в частности - с антителами в составе ЕА. Оксиагин ингибировал в значительной мере функционирование и (в некоторой степени) формирование ЕАС4Ъ (комплекса ЕА с компонентом комплемента С4Ь). Это означает, что оксиагин ингибирует систему комплемента влиянием на функцию комплекса ЕАС4Ь, но не на инициирующие стадии процесса, т.е. не затрагивает активацию компонента CI. Количество СЗ-конвертазы ЕАС4Ь2а, сформировавшейся во время инкубации ЕАС4Ь с сывороткой, дефицитной по компоненту СЗ, в присутствии NiCk, зависит от концентрации оксиагина в смеси (рис. 20, колонка 1). В то же время добавление оксиагина (до 0.3 мкМ) к уже сформированной и стабилизированной ионами никеля СЗ-конвертазе не влияло на её активность (рис. 20, колонка 2).
Следовательно, оксиагин не влияет на последующие стадии каскада активации комплемента. Ингибирование формирования СЗ-конвертазы вероятно происходит на стадии связывания компонента С2 с комплексом ЕАС4Ь, После осаждения центрифугированием комплекса ЕАС4Ь2а (СЗ-конвертазы), сформировавшегося в присутствии оксиагина, в супернатанте было определено количество активного не связавшегося С2 с использованием отдельной гемолитической системы с сывороткой, дефицитной по компоненту С2. Оксиагин ингибировал связывание С2 с ЕАС4Ь с ICso 4 мкг/мл (80 нМ) (рис. 21). То, что мы наблюдали повышающийся уровень активного С2 в супернатанте при повышении концентрации оксиагина, говорит скорее о появлении стерических или конформационных препятствий для связывания компонента С2, чем о его ферментативной инактивации. предполагается, что в распознавании субстратов мокархагином участвует его лектиноподобный регион [58]. Поэтому мы проверили влияние углеводов на ингибирование комплемента оксиагином. D-галактоза подавляла связывание оксиагина с ЕА, однако на уже сформировавшийся комплекс ЕА-оксиагин влияния не оказывала. Оксиагин (в концентрации 1.2 мкМ) вызывал гемагглютинацию эритроцитов кролика, барана (0.6 мкМ) и ЕА (0.15 мкМ). Эти данные подтверждают прямое взаимодействие оксиагина с поверхностью эритроцитов, более сильное в случае ЕА, т.е в присутствии иммуноглобулинов. Важно также то, что оксиагин в концентрациях до 1.2 мкМ не влияет на активацию комплемента по альтернативному пути, т.е. для проявления своего эффекта ему требуется активация классического пути с участием антител. Обобщая изложенные данные, можно сделать вывод: новый репролизин из яда кобры ингибирует активацию системы комплемента по классическому пути, связываясь с иммуноглобулинами в составе ЕА в тесной близости от места посадки компонента С4Ь и вызывая этим стерические или конформационные препятствия для последующего связывания и активации компонента С2. Оксиагин является первым репролизином яда кобр, для которого обнаружено ингибирование системы комплемента сыворотки крови.
