Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Теоретические и практические аспекты метода молекулярной гибридизации 8
2.1 Типы гибридизационного анализа 10
2.1.1. Гомофазная гибридизация в растворе 10
2.1.2. Гетерофазная гибридизация 14
2.1.2.1. Гибридизация на частицах и иммунологических планшетах 16
2.1.2.1.1. Гибридизация на мелкодисперсных частицах 16
2.1.2.1.2. Гибридизация на наночастицах 16
2.1.2.1.3. Гибридизация на иммунологических планшетах 18
2.1.2.2. Гибридизация в слое геля 19
2.1.2.3. Гибридизация на плоских поверхностях 21
2.2. Эффективность и кинетика гибридизации (теоретические аспекты) 23
2.2.1. Гибридизация в растворе 23
2.2.2. Гетерофазная гибридизация 25
2.2.2.1. Носитель - микрочастица 25
2.2.2.2. Носитель - слой геля 27
2.2.2.3. Носитель - плоская поверхность 27
2.3. Структура пробы и зонда как фактор, влияющий на эффективность процесса гибридизации 30
2.3.1. Структура пробы в гетерофазной гибридизации : 30
2.3.2. Дизайн и структура зонда в гетерофазной гибридизации 33
2.3.2.1. Зонды, содержащие модифицированные основания 37
2.3.2.2. Зонды, содержащие модифицированный рибозофосфатный остов 37
2.3.2.3. Зонды, содержащие вставки в рибозофосфатном остове 40
2.4. Проблемы селективности параллельной гибридизации с набором олигонуклеотидных зондов 44
2.4.1. Буфер 45
2.4.2. Модифицированные основания 46
2.4.3. Фермент-зависимые реакции, используемые в гибридизационном анализе 51
2.5. Заключение 53
3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Влияние ненуклеотидиой вставки в составе «мостикового» олигонуклеотида на его гибридизационные свойства 55
3.1.1. Схема формирования комплекса, содержащего «мостиковый» олигонуклеотид 58
3.1.2. Определение термодинамических параметров комплексов, содержащих «мостико вый» олигонуклеотид 61
3.1.3. Влияние позиции ненуклеотидиой вставки в составе «мостикового» олигонуклеотида на его гибридизационные свойства 69
3.1.3.1. Олигонуклеотиды, содержащие одну мономерную вставку в разных положениях олигонуклеотидной цепи 69
3.1.3.2. Олигонуклеотиды, содержащие несколько моиомерных вставок в разных положениях олигонуклеотидной цепи 72
3.2. Сравнение алішлирования модельной ДНК-мишени реакционноспособными производными нативных и «мостиковых» олигонуклеотидов 74
3.3. «Мостиковых» олигонуклеотиды и их комплексы с ДНК как субстраты в ферментативных реакциях 77
3.3.1. «Мостиковые» олигонуклеотиды в реакциях, катализируемых фосфодиэстеразои змеиного яда 77
3.3.2. Субстратные свойства комплексов, содержащих «мостиковые» олигонуклеотиды, в реакциях, катализируемых Т4 ДНК-лигазой 19
3.3.2.1. Влияние однонуклеотидного несоответствия в составе ДНК-матрицы на эффективность лигирования тандема с участием «мостикового» олигонуклеотида 82
3.3.3. Субстратные свойства комплексов, содержащих «мостиковые» олигонуклеотиды, в реакциях, катализируемых Га^-полимеразой 84
3.3.3.1. Элонгация «мостиковых» олигонуклеотидов под действием Гад-полимеразы 84
3.3.3.2. «Мостиковые» олигонуклеотиды в качестве матричной цепи в реакциях, катализируемых Га^-полимеразой 87
3.3.3.3. Эффективность удлинения «мостиковых» олигонуклеотидов 7а<7-полимеразой на матрицах, содержащих однонуклеотидное несоответствие 91
3.4. «Мостиковые» олигонуклеотиды как зонды в методе молекулярной гибридизации 95
3.4.1. Выбор олигонуклеотидных зондов 95
3.4.2. Иммобилизованные «мостиковые» олигонуклеотиды как зонды в методе молекулярной гибридизации 97
3.4.2.1. «Мостиковые» зонды и ДНК-зависимые ферменты в методе молекулярной гибридизации 102
3.4.3. Использование «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве зондов в ДНК-диагностике 106
3.4.3.1. Использование «мостиковых» олигонуклеотидов для выявления ВКЭ 106
3.4.3.2. Использование «мостиковых» зондов для выявления и генотипирования ВГС 107
3.5. Заключение 111
4. Экспериментальная часть 112
4.1. Исходные материалы 112
4.2. Основные методы 114
4.4. Основные методики 117
Выводы 120
- Эффективность и кинетика гибридизации (теоретические аспекты)
- Зонды, содержащие модифицированный рибозофосфатный остов
- Сравнение алішлирования модельной ДНК-мишени реакционноспособными производными нативных и «мостиковых» олигонуклеотидов
- Выбор олигонуклеотидных зондов
Введение к работе
1. ВВЕДЕНИЕ
Использование олигонуклеотидных конструкций в качестве инструментов для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты (НІС), например, в антисенс технологии или в медицинской ДНК-диагностике, основано на способности олигонуклеотидов образовывать прочные комплексы с комплементарными им участками НК. Основные требования к олигонуклеотидным конструкциям состоят в обеспечении высокой эффективности, сайт-специфичности и селективности их связывания с комплементарными им участками НК.
Сайт-специфичность, как и эффективность связывания олигонуклеотида с комплементарной НК, определяется его длиной и нуклеотидной последовательностью и зависит от комплексообразующей способности этого олигонуклеотида, т.е. от стабильности формируемых им комплексов. Селективность олигонуклеотидных конструкций отражает их способность различать на уровне связывания ДНК-мишени, содержащие несоответствия в последовательности. Так, высокоэффективное связывание протяженного антисмыслового олигонуклеотида может оказаться неселективным, поскольку наряду с образованием прочного совершенного комплекса при физиологических условиях не исключена возможность формирования частично комплементарных комплексов с мишенями, содержащими нуклеотидные несоответствия в последовательности [1]. Наиболее остро проблема обеспечения селективности комплексообразования встает для GC-богатых олигонуклеотидных конструкций, когда стабильность GC-богатых комплексов, содержащих мисматчи, оказывается близка или даже выше стабильности совершенных АТ-богатых комплексов сопоставимой длины. Зависимость стабильности НК-комплексов от нуклео-тидного состава делает проблематичным использование при гибридизационном анализе НК наборов олигонуклеотидов равных по длине. В этом случае, при одинаковых условиях гибридизации, задаваемых форматом параллельного анализа, возможно появление ложноположительиых или ложноотрицательных сигналов [2]. Таким образом, создание олигонуклеотидных конструкций, способных высокоселективно связываться с НК, является важной и пока не решенной задачей как при разработке ген-направленных соединений, так и олигонуклеотидных зондов.
В настоящее время существуют несколько подходов к повышению селективности комплексообразования олигонуклеотидов: введение в состав буфера тетраалкиламмо-ниевых солей [3], которые способны частично нивелировать различия в связывании олигонуклеотидов разного нуклеотидного состава; замена протяженных олигомеров танде-
Введение мами на основе коротких олигонуклеотидов [4]; применение модифицированных олигонуклеотидов с измененными гибридизациоиными свойствами [5]. В качестве последних широко представлены олигонуклеотидные аналоги с замещенным рибозофосфатным остовом, например, на основе пептидил- (PNA) [б] или замкнутых (locked) (LNA) [7] нуклеиновых кислот, обладающие повышенными гибридизациоиными свойствами. Однако использование таких олигонуклеотидов ограничивается отсутствием строгого алгоритма для предварительного расчета стабильности образуемых ими комплексов как совершенных, так и содержащих мисматчи. Кроме того, комплексы таких олигонуклеотидов с ИК-мишенями не всегда могут выступать в качестве субстратов ферментов, часто используемых в различных молекулярно-биологических исследования.
Олигонуклеотиды, состоящие из иативных нуклеотидных блоков, соединенных ненуклеотидными вставками, и имеющие непрерывный сайт связывания с НК («мости-ковые» олигонуклеотиды), могут быть компромиссным вариантом между протяженными и модифицированными олигонуклеотидами. Гибридизационные свойства таких «мостиковых» олигонуклеотидов могут поддаваться расчету, т.к. вставки не затрагивают способности оснований образовывать комплементарные пары, не нарушают геометрию спирали комплексов НК, а лишь локально возмущают структуру рибозофосфатного остова. Кроме того, «выпетленная» из двуцепочечной спирали ненуклеотидная вставка не должна существенно влиять на способность модифицированных комплексов выступать в качестве субстратов в ферментативных реакциях. Описаны олигонуклеотиды с различными ненуклеотидными вставками (циклические [8] и шпилечные [9]); известны дуплексы [10], триплексы [11] и более сложные комплексы, олигонуклеотидные компоненты которых соединены вставками. Вставки являются инструментом, с помощью которого би- или трикомпонентные процессы сводятся к монокомпонентным, упрощая исследования нук-леиново-нуклеиновых взаимодействий [10, 11].
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение возможности использования «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве инструментов для ДНК-диагностики, основанной на методе молекулярной гибридизации (в качестве олиго-нуклеотидных зондов), и для направленного воздействия на НК мишень (в качестве адресной части алкилирующих производных).
В ходе исследования впервые решались следующие задачи:
Введение
систематическое изучение гибридизационных свойств «мостиковых» олигонуклеотидов, содержащих в сахарофосфатном остове различные ненуклеотидиые вставки на основе олигометилеидиолов и олигоэтиленгликолей;
исследование направленного воздействия на ДНК-мишень алкилирующими производными «мостиковых» олигонуклеотидов;
изучение способности «мостиковых» олигонуклеотидов и их комплексов с ДНК участвовать в реакциях катализируемых ферментами, таким как, фосфодиэстераза змеиного яда и Га^-полимераза, Т4 ДНК-лигаза;
исследование возможности использования иммобилизованных «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве зондов для ДНК-диагностики.
Обзор литературы
Эффективность и кинетика гибридизации (теоретические аспекты)
Видно, что время достижения равновесия зависит, во-первых, от величин констант скоростей прямой и обратной реакций (чем они выше, тем быстрее достигается состояние равновесия); во-вторых, от исходных концентраций взаимодействующих при гибридизации компонентов (при их повышении процесс ускоряется); в-третьих, от глубины протекания реакции (при а — 1 равновесие устанавливается медленнее). Константа скорости ассоциации практически одинакова для олигонуклеотидов разной длины и последовательности [132] и определяется только вероятностью (1/1000) успешных соударений (контактов) взаимодействующих цепей, приводящих к комплек-сообразованию. При гомофазной гибридизации с участием неструктурированных олигонуклеотидов равновесие устанавливается быстро - в течение нескольких миллисекунд. Величины констант скорости прямой реакции при взаимодействии неструктурированных олигомеров лежат в интервале 10 -108 М с" [133] (для сравнения - реакции, контролируемые только диффузией в водных растворах, имеют константу на 2-4 порядка выше (10 -10 М" с" ) [134]). Константа скорости ассоциации слабо зависит от температуры (поскольку энергия активации ассоциации олигомеров, как правило, невысока и является положительной величиной, то она плавно возрастает с повышением температуры [19, 135]); от ионной силы (повышение концентрации соли экранирует отрицательные заряды фосфодиэфирньгх групп в составе взаимодействующих олигонуклеотидных цепей, способствуя их сближению [19]). Константа скорости диссоциации в значительной степени зависит от температуры, от длины и нуклеотидного состава олигомеров (чем прочнее комплекс, тем ниже константа скорости диссоциации) [19]. Таким образом, процесс комплексообразования в растворе определяется многими параметрами и зависит как от внешних условий проведения гибридизации, так и от нук-леотидной последовательности компонентов. 2.2.2. Гетерофазная гибридизация При гетерофазной гибридизации один из компонентов образующегося комплекса присоединен к носителю, что исключает его диффузионное перемещение в растворе, поэтому образование комплекса между находящимся в растворе (ИК-мишень) и иммобилизованным (олигонуклеотидный зонд) компонентами возможно только при достижении первым поверхности носителя. В случае наиочастиц кинетика процесса образования комплекса близка к кинетике в растворе [36, 37], поскольку наночастицы сопоставимы по размеру с компонентами гибридизации [43].
Для микрочастиц, по аналогии с гибридизацией в растворе, степень ассоциации комплекса (а) при достижении равновесия зависит от равновесной константы скорости гетерофазного комплексообразования и исходных концентраций взаимодействующих компонентов - объемной концентрации (моль/л) для растворенного компонента А и поверхностной емкости (моль/см2) для иммобилизованного компонента В [38]: В условиях эффективного взаимодействия компонентов при (КрА0 »1), при избытке иммобилизованного компонента В 0 1), весь растворенный олигомер А оказывается связанным на частице (а- 1). В том случае, когда в избытке используется растворенный олигомер А (s \), степень ассоциации а оказывается прямо пропорциональна s, т.е. количеству иммобилизованного олигомера в смеси [38]. Следует отметить, что при прямом сопоставлении гибридизации 22-звенных оли-гомеров в гомо- и гетерогенном варианте было выявлено [38] различие в характере зависимости равновесных констант Кд[1Сс от температуры (Рис. 2). Как видно из рис. 2, эффективность гетерофазной гибридизации оказывается ниже, чем в растворе, при низких температурах (ниже температуры плавления дуплекса), однако, при высоких температурах (Т Тт) величина константы диссоциации дуплекса в растворе оказывается выше константы диссоциации дуплекса в случае гетерофазного процесса. Из приведенных данных следует, что повышение температуры увеличивает относительную эффективность гетерофазной гибридизации. Причина такого явления авторами детально не обсуждается, но они отмечают, что, вероятно, в данном случае на процесс комплексообразования накладываются эффекты, обусловленные взаимодействием олигонуклеотида и/или комплекса с поверхностью частицы. На основании представленного на стр. 25 уравнения очевидно, что, увеличивая количество иммобилизованного на твердом носителе компонента, можно повышать эффективность гетерофазной гибридизации. Однако остается непонятным, что является Обзор литературы более значимым в этом случае: увеличение поверхностной концентрации иммобилизованного компонента при сохранении площади поверхности твердой фазы (повышение емкости) или увеличение поверхности контакта фаз при фиксированной емкости носителя. В работе [39] удалось повысить эффективность гибридизации ДНК на микрочастицах только при увеличении количества вносимых в реакционную смесь частиц, в то время как попытки добиться такого же эффекта путем повышения плотности иммобилизованного на поверхности зонда оказались безрезультатными [43]. 2.2.2.2. Носитель - слой геля Гибридизация в данном формате происходит внутри фиксированного на стекле слоя геля за счет его пористой структуры. касс А+В(гель) - » АВ(гель) кдис Концентрация НК-матрицы (пробы) вые ячеек во всем объеме реакционной смеси, по мнению авторов, считается одинаковой и выравнивание концентрации НК-матрицы осуществляется быстро за счет принудительного перемешивания.
Диффузией ЫК-матрицы вдоль гибридизационного чипа авторы пренебрегают. В ходе гибридизации проба заполняет ячейку по механизму "замедленной диффузии" [21], под которой понимается особый характер движения молекул пробы в среде, содержащей неподвижные центры комплексообразования - иммобилизованные зонды. Концентрация свободной и связанной с иммобилизованными зондами ДНК-матрицы в геле изменяется за счет того, что ДНК диффундирует в слой геля и взаимодействует с неподвижными иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, присоединяясь к ним и вновь диссоциируя. При увеличении размера анализируемой ДНК или увеличении плотности геля, возникают проблемы с проникновением матрицы в гель [115]. Эта проблема решается при помощи уменьшения длины анализируемой ДНК, что будет рассмотрено далее. Таким образом, наличие именно слоя геля накладывает основные ограничения на условия проведения гибридизации в таком формате. 2.2.2.3. Носитель - плоская поверхность Теоретический анализ гетерофазной гибридизации на плоскости основан на адаптации принципа взаимодействия типа лиганд-рецептор [136] и приведен в работах [134, 137]. В работе [134] авторы ограничиваются случаем, когда соблюдаются условия необратимого специфического связывания иммобилизованного зонда, уделяя особое внимание скорости формирования гибридизационного комплекса. Данная модель оказывается работоспособной на начальной стадии гибридизации и может предсказать изменение скорости гибридизации только при низких концентрациях олигонуклеотидной матрицы. Авторы указывают на ряд особенностей комплексообразования нуклеиновых кислот, как в растворе, так и на носителе. Во-первых, как уже отмечалась выше, скорость ассоциации олигонуклеотидов даже в растворе ниже скорости межмолекулярных реакций, контролируемых диффузией. При этом иммобилизация одного из взаимодействующих компонентов еще более замедляет гибридизацию, т.е. фиксация зонда на поверхности понижает эффективность комплексообразования с его участием за счет дополнительных стерических и ориентационных ограничений. Во-вторых, при высокой концентрации ДНК в растворе реакция гетерогенного комплексообразования описывается кинетикой первого порядка по иммобилизованному компоненту. При этом, возможно, реализуются два механизма (проиллюстрированные ниже) специфического связывания ДНК из раствора с иммобилизованным на поверхности носителя олигонуклео-тидным зондом.
Зонды, содержащие модифицированный рибозофосфатный остов
Описанные в литературе олигонуклеотидные зонды, содержащие неприродные основания, условно можно разделить на две группы: несущие модифицированные природные нуклеотидные основания [5, 68, 118, 124, 160-163] либо содержащие измененные синтетические основания [59, 95, 164-166]. В качестве модифицированных природных оснований представлены: N4-алкилцитозин [5, 124,160, 161], 5-метил урацил или 5-(1-пропинил)урацил [68, 162], 2,6-диаминопурин [68, 118], 8-аза-7-деазапурин-2,б-диамин [163], инозин [59]. К синтетическим основаниям относятся универсальные основания нитроиндол [95, 164], производные карбостерила: [165] 3-метил изокарбостерил, 5-метил изокарбостерил, 7-пропинил изокарбостерил; пятичленные тиофеновые и фурановые гетероциклы [166]. Структурные формулы данных оснований, а также изменение гибридизационных свойств олиго-нуклеотидных зондов, обусловленное введением в их состав упомянутых оснований, будут подробно рассмотрены ниже в главе, посвященной проблемам селективности гибридизации. 2.3.2.2. Зонды, содержащие модифицированный рибозофосфатный остов Класс зондов с модифицированным рибозофосфатный остовом состоит из пепти-дил олигонуклеотидов (PNA) [6, 53, 142, 143, 167-177] и замкнутых {locked) олигонуклеотидов (LNA) - [7, 178]. Замена отрицательно-заряженного сахарофосфатиого остова в олигонуклеотид-ном зонде на нейтральный делает пептидил олигонуклеотиды (PNA-зонд) перспективными для гибридизационного анализа, поскольку, во-первых, приводит к существенной стабилизации гибридизационного комплекса, а, во-вторых, позволяет проводить гибридизацию в низкой концентрации соли, снижающей стабильность вторичной структуры НК-матрицы [167, 171]. Предварительная гибридизация при низкой ионной силе раствора меченого PNA-зонда с ДНК-матрицей, полученной после проведения ПЦР, была названа авторами работы [173] прегель-гибридизацией. Образующийся в этом случае комплекс выделяли гель-электрофорезом и переносили (блоттинг) на мембрану, с последующим выявлением продукта гибридизации (по аналогии с Саузерн-гибридизацией).
Выявление ДЫК-матрицы в режиме реального времени при гибридизации в низкой соли с меченым PNA-зовдои было продемонстрировано в работе [174]. Гибридиза-ционная смесь содержала меченный флюоресцеином (F) PNA-зоіщ, выявляемую (правильную или «неправильную») НК-матрицу и катионный водорастворимый полимер на основе поли(9,9-бис(6 -Л Д:Лг-триметиламмоний)-гексил)-флюорен фенилена (XII). Возможность in situ гибридизации с флюоресцентно меченным РЛ -зондом была показана при выявлении рибосомальной РНК патогенных грибков Candida albicans и Candida dubliniensis [175], детекции в крови Staphylococcus aureus [176] и Candida albicans [177]. Однако применение гидрофобных РЛ -олигомеров ограничивается их низкой растворимостью в воде. Эту проблему сейчас пытаются решать при помощи химерных олигонуклеотидов РЛ -ДНК [179]; но данных по использованию таких химерных оли-гонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов пока нет. LNA (locked) олигонуклеотиды недавно предложенный класс бициклических РНК-аналогов с заранее предформированной конформацией рибозного остатка. Использование LNA обусловлено высокой специфичностью их связывания с комплементарными ДНК и РНК, причем с последними предпочтительнее [180]. Это свойство, по-мнению авторов, позволяет использовать LNA при анализе GC-богатых НК последовательностей, обладающих повышенной структурированностью. Так, в работах [7, 178] показана возможность использования .ШЛ-олигонуклеотидов для определения полиморфизма в геномной ДНК. За счет повышенного сродства /,ЛС4-олигонуклеотидов к РНК также продемонстрировано, что введение в состав 21-мерного олигодезоксирибонуклеотидного зонда каждого третьего LNA-остатка. позволяет увеличить чувствительность определения соответствующей микроРНК методом блот-гибридизации [181]. Выбор последовательности зондов на основе PNA или LNA, как и ДНК-зондов, задача комплексная и решать ее сейчас предлагается при помощи компьютерной программы OligoDesign [182]. Основная проблема использования при гибридизации PNA и LNA заключается в том, что синтез таких олигонуклеотидов дорог, особенно непосредственно на поверхности слайда; кроме того, их использование не всегда совместимо с действием ДНК-зависимых ферментов, часто используемых в различных молекулярно биологических подходах при гибридизационном анализе. Использование олигонуклеотидов, содержащих вставки в рибозофосфатном остове, обусловлено тем, что в данном случае не затрагивается часть нуклеотида, ответственная за его комплементарное связывание с НК-матрицей, а вставка оказывается вытесненной (или выпетленной) при образовании двуцепочечного комплекса. Введение таких вставок позволяет получать линейные олигонуклеотиды [183], циклические [8] и шпилечные [9] олигонуклеотидные конструкции. Чаще всего в качестве вставок используют остатки этиленгликолей, метилендиолов. Такие модифицированные олигонуклеотиды применяются, например, для исследования НК-НК [184] и НК-белковых взаимодействий [185, 186], для получения термодинамических параметров комплексообразования дуплексов [10], триплексов [11], для исследования механизмов действия ферментов [187-189], а также для исследования активности рибозимов [190, 191]. Примером использования в гибридизационном анализе являются олигонуклеотидные зонды, содержащие вставки на основе пирена (XIII) [192] и птеридина (XIV) [193]. При образовании правильного комплекса между матрицей и зондом происходит интер-каляция одного остатка пирена в двуцепочечную спираль, и эмиссия флюоресценции в этом случае отсутствует. В случае матрицы, содержащей дополнительную нуклеотид-ную вставку («вставочный» полиморфизм) образуется «неправильный» комплекс, остаток пирена не встраивается в спираль, а происходит его «вытеснение» из спирали и сближение с другим остатком пирена, вследствии чего формируется эксимер, и наблюдается флюоресценция в более длинноволновой области [192]. В работе [193] в качестве гибридизационного зонда для выявления HIV-1 положительного ПЦР-продукта предлагается использовать олигодезоксирибонуклеотид, содержащий вставку на основе птеридина (XIV).
При образовании комплементарного комплекса между матрицей и зондом происходит выпетливание вставки с птеридином и, соответственно, его флюоресценция. Применение олигонуклеотидов, содержащих в сахарофосфатном остове ненук-леотидные вставки на основе пропантриола или гексаэтиленгликоля, при гибридизации с двуцепочечной ДНК исследовано в работах [194-196]. В работе [196] показана возможность связывания с 16-мерным дуплексом третьей олигонуклеотидной цепи, которая представляет собой 16-звенный олигонуклеотид 5 Ns3 -3 Ne5 (XV) или состоит из двух олигонуклеотидов, соединенных ненуклеотидной вставкой - пропантриолом: 15-мер 5 N73-пропантриол-3 Ng5 (XVI) и 14-мер 5N73- пропантриол- N7 (XVII). Ниже показано строение таких соединений, а также схематически представлены триплексы, которые образуются с их участием. Хугстиновскими связями () с комплементарными участками, расположенными на разных цепях природного Уотсон-Криковского 16-мерного дуплекса. Для триплекса, образованного с участием 5 Ng3 -3 Ng5 (XV), сайт связывания 16-мера оказывается непрерывным. Для комплекса, содержащего 5 N73 -пропантриол-3 Ng5 (XVI), ненуклеотидная вставка располагается над однонуклеотидным «гэпом», в случае же 5 N73 -пропантриол-N75 (XVII) - над «гэпом» из двух нуклеотидов. При сравнении сконструированных олигомеров было показано, что связывание 15-мера (XVI) с двуцепочечным комплексом сравнимо с 16-мером (XV), в то время как 14-мер (XVII) связывается с матрицей гораздо слабее. Таким образом, введение пропантриольной вставки в состав олигонуклеотида позволяло конструировать олигомеры, которые могут быть использованы в качестве альтернативных цепей при формировании триплексных структур. Выявление НК-матрицы олигонуклеотидами, содержащими в сахарофосфатном остове ненуклеотидные вставки на основе полиэтиленгликоля, было продемонстрировано в работах [194, 195]. В одном случае использовали циклический олигонуклеотид (XVIII), состоящий из четырех частей: двух олигонуклеотидных доменов и двух ненук-леотидных вставок на основе олигоэтиленгликоля; в другом - шпилечный олигонуклеотид (XIX), состоящий из трех частей: двух олигонуклеотидных доменов и одного ненук-леотидного.
Сравнение алішлирования модельной ДНК-мишени реакционноспособными производными нативных и «мостиковых» олигонуклеотидов
Влияние иенуклеотидной вставки в составе «мостикового» олигонуклеотида на его способность взаимодействовать с ДНК было оценено по эффективности модификации ДНК-мишени алкилирующими производными «мостиковых» олигонуклеотидов. Если в условиях эффективного комплексообразования модификация ДНК-мишени алкилирующим производным нативного и алкилирующим производным «мостикового» олигонуклеотида происходит по одинаковым сайтам ДНК, то, следовательно, оба нуклеотида образуют комплексы с одинаковой геометрией (по аналогии со статьей [235]). Алкилирование было исследовано на модельной системе (Рис. 18Б). В качестве мишени использовали 5 -[33Р]-меченный 20-звенный олигонуклеотид М. RCI-содержащие реагенты были получены на основе 12- или 8-звенных «мостиковых» или нативных олигонуклеотидов, комплементарных участку в составе ДНК-мишени. В «мостиковых» алкилирующих реагентах ненуклеотидная вставка на основе гексаметилендио-ла располагалась на расстоянии четырех нуклеотидов от 5 -конца олигомеров (5 pN4(Z)N4n 5 pN4()N8). Для всех исследуемых олигомеров первоначально была исследована стабильность их комплексов с 20-звенным олигонуклеотидом М в тех же буферных условиях, в которых в дальнейшем проводили реакцию алкилирования (Рис. 18Б). Алкилирование мишени М и самоалкилирование реагентов регистрировали гель-электрофорезом в денатурирующем 20% ПААГ по появлению продуктов деструкции полинуклеотидной цепи в местах модифицированных оснований после обработки реакционной смеси 10% водным пиперидином [236] и пиперидии-стабильыых аддуктов. Реакционную смесь, содержащую аддукты ковалентного присоединения реагента по основанию С 3 мишени, устойчивые к обработке пиперидином ( С13 на рис. 18А), предварительно обрабатывали гидразин-гидратом для расщепления модифицированной мишени по алкилированному основанию С по аналогии со статьей [237] (данные не приведены). Нативный додекануклеотид pN12 образует самый стабильный комплекс с мишенью М и модифицирует ее на 60% при 20С (Рис. 18Б). Введение в состав додеканукле-отида pN12 иенуклеотидной вставки практически не влияет (в условиях эффективного комплексообразования) на направленность (Рис. 18А, дорожки 1 и 2) и степень модификации мишени алкилирующим реагентом .RC7-pN4(L)N8 (64%), несмотря на уменьшение гибридизационных свойств «мостикового» додекануклеотида (Рис. 18Б). Подобный результат был получен ранее в работе [238] при алкилировании (в аналогичных условиях) этой же 20-звенной матрицы М реакциоиноспособными производными додекануклеотидов: правильного pN12 (pCAGCTCCAGGCA) и содержащего нук-леотидное несоответствие pN12a (pCAGaTCCAGGCA), обладающего пониженными гибридизационными свойствами по сравнению с pN12.
Как и в нашем случае, степени алкилирования обоими производными были близки, поскольку в условиях модификации мишени как правильный M/pN12, так содержащий мисматч M/pN12a дуплексы находились в условиях эффективного комплексообразования. Небольшое увеличение степени модификации мишени алкилирующим производным «мостикового» додекануклеотида pN4(Z)N8, скорее всего, молсет быть связано с двумя факторами. Во-первых, наличие ненуклеотидной вставки приводит к повышению константы скорости диссоциации комплекса «мостикового» олигонуклеотида и, как следствие, к повышению скорости обмена между гидролизованным и исходным алкилирущим агентами на основе pN4(Z)N8 в модифицированном комплексе. Во-вторых, ненуклеотидная вставка в составе pN4(Z)N8 может увеличивать конформационную подвижность 5 -алкилирующей группировки в дуплексе ifC/-pN4(i)NS/MJ образуемого данным олигомером с мишенью, по сравнению с более жестким дуплексом ifC/-pN12/M. И, таким образом, конформационная подвижность 5 -алкилирующей группировки в составе комплекса способствует более эффективному протеканию алкилирования в дуплексе. При использовании «мостикового» олигонуклеотида меньшей длины (олигомер pN4()N4), модификация ДНК ие регистрируется (Рис. 18А, дорожка 4), поскольку ок-тамер pN4(X)N4 имеет крайне низкие гибридизационные свойства (Тпл 7СС). Введение на 3 -конец «мостикового» октануклеотида pN4(Z)N4 остатка Т-(2-гидроксиэтил)-феназиния (Phn), повышающего его гибридизационные свойства, позволяет довести степень модификации мишени реакционноспособным производным олигомера (RCI-pN4()N4pP/znJ до 10% (данные не представлены). Во всех случаях как для наливного, так и для «мостикового» алкилирующих реагентов сайты модификации одни и те же: G9, G12, С13, G16, G19, включая главный сайт алкилирования - С13 (70% - от общей степени модификации). Суммируя представленные данные по модификации мишени алкилирующими производными нативных и «мостиковых» олигоиуклеотидов видно, что в условиях эффективного комплексообразования введение в состав олигонуклеотида ненуклеотидной вставки ие приводит к изменению эффективности и направленности алішлжрования ДНК мишени М. Таким образом, «мостиковые» олигонуклеотиды, несущие реакционноспо- Результаты и обсуждение собнуїо группу, могут быть использованы при физиологических условиях в качестве потенциальных инструментов в антисенс технологии.
Отсутствие изменений в направленности алкилирования ДНК мишени натйвным и «мостиковым» реагентами свидетельствует о том, что геометрия комплекса M/pN8(Z,)N4, содержащего «мостиковый» олиго-нуклеотид, существенно не отличается от геометрии комплекса, образованного с матрицей контрольным олигонуклеотидом (М/рШ2). 3.3. «Мостиковые» олигонуклеотиды и их комплексы с ДНК как субстраты в ферментативных реакциях В данном разделе была исследована способность «мостиковых» олигонуклеотидов и их комплексов с ДНК принимать участие в реакциях, катализируемых ферментами. Поскольку, как следует из литературного обзора, модифицированные олигонуклеотиды с регулируемой гибридизационной способностью, например PNA- и LNA- аналоги, не всегда могут выступать в качестве субстратов ферментов, часто используемых в различных молекулярно-биологических исследования и ДНК-диагностике. В качестве ферментов были выбраны ДНК-деградиругощий фермент (фосфодиэ-стераза змеиного яда Crotalus atrox) и ДНК-процессирующие ферменты (Т4 ДНК-лигаза и 7а 7-полимераза). 3.3.1. «Мостиковые» олигонуклеотиды в реакциях, катализируемых фосфодиэсте-разой змеиного яда Известно, что нативные олигонуклеотиды имеют короткое время полупревращения в биологический средах; увеличить время жизни олигонуклеотидов в среде можно за счет модификации внутренней фосфодиэфирной связи путем замены ее, например, на метилфосфонатную, амидофосфатную, тиофосфатную и др. [239]. Сравнение устойчивости нативного и модифицированного неттуклеотидными вставками олигомеров по отношению к фосфодиэстеразе (Crotalus atrox) было проведе-но на примере 5 -[ Р]- меченых эйкозонуклеотидов : Результаты и обсуждение В течение первых пяти минут оба 20-мерных олигонуклеотида оставались стабильными при выдерживании в присутствии 0.18 ед. фосфодиэстеразы змеиного яда (Рис. 19). Время полупревращения контрольного и «мостикового» олигонуклеотида в среде, содержащей фосфодиэстеразу змеиного яда, примерно одинаково и составляет 22 и 30 минут, соответственно (Рис. 19А). Но если нативный pN20 практически полностью разрушается до уровня тетрануклеотида pGCAT в течение часа, то за это же время для модифицированного олигомера pN8()N4(Z,)N8 наблюдается накопление продукта, укороченного с З -конца до первой ненуклеотидной вставки (Рис. 19А).
Выбор олигонуклеотидных зондов
Ранее в нашей лаборатории был разработан способ иммобилизации олигонуклео-тидов на мелкодисперсный полимер (ДМЭГ) [254], и полученные иммобилизованные олигонуклеотиды были использованы в качестве зондов в ДНК-диагностике при выявлении точечных мутаций методом молекулярной гибридизации [255]. Как было отмечено выше в литературном обзоре, основной проблемой гибридизационного анализа является обеспечение селективности связывания зонда с ЫК-матрицей. Известно, что максимальная дискриминация однобуквенных несоответствий между анализируемой последовательностью матрицы и зондом достигается при температуре плавления их правильного комплекса [197], что означает необходимость использования при гибридизационном анализе олигонуклеотидных зондов с близкими гибридизационными свойствами (или близкими Тпл их комплексов). Вводя в состав олигонуклеотидов ненуклеотидные вставки, можно конструировать олигомеры с заданными гибридизационными свойствами. В связи с этим мы исследовали возможность использования «мостиковых» олигонуклеотидов в качестве зондов при параллельной гибридизации2 в гетерофазных условиях. В качестве нативных зондов были выбраны 15-мерные Z1 + Z3 и 16гмерные Z4 Z6 олигонуклеотиды, различающиеся нуклеотидным составом (соотношением GC/AT) (Рис. 31А). Последовательности 15-мерных зондов Z1 Z3 соответствовали разным участкам генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Последовательности 16-мерных Z4 Z6 олигонуклеотидов - определенным участкам 5 -нетранслируемой области геномов различных субтипов вируса гепатита С (5 -UTR ВГС). В качестве модельных матриц использовали соответствующие 15-звенные MZ1 + MZ3 и 30-звенные MZ4 MZ6 олигонуклеотиды, последовательности которых будут представлены ниже. Комплексы этих олигонуклеотидов с комплементарными матрицами имели разную температуру плавления от 67 до 81 С и, соответственно, гибридизационные свойства (Рис. 31Б). На основе нативных зондов были сконструированы модифицированные олигонуклеотидные зонды, содержащие от одной (Zlb) до четырех (Z3a или Z3b) неиуїс-леотидных вставок на основе диэтиленгликоля (Рис. 31А). Видно, что введение в состав Модифицированные олигонуклеотиды с ненуклеотидными вставками были иммобилизованы на мелкодисперсный полимер (ДМЭГ) и использованы в методе молекулярной гибридизации в качестве зондов. Гибридизацию иммобилизованных олигонукле-отидных зондов с матрицами проводили по представленным ниже схемам, которые отличались способом введения в состав гибридизационного комплекса репортерной группы - биотина.
При обратной гибридизации (Схема 8А) репортерная группа входила в состав матрицы, в случае сэндвич-гибридизации (Схема 8Б) репортерную группу (биотин) вносил дополнительный декануклеотидный зонд. После образования гибридизационного комплекса полимер отмывали от избытка свободного биотинилированного компонента и инкубировали с конъюгатом стрептави-дин-щелочная фосфатаза. Далее полимер переносили в лунку (ячейку) микробиологического планшета и проводили «проявление» с помощью хромогенных субстратов ВСІР и NBT, взаимодействие которых, инициируемое фосфатазой, приводит к образованию во-донерастворимых окрашенных продуктов. В этом методе детекция биотинилированного продукта гибридизации происходит опосредованно, через промежуточное образование стрептавидин-биотинового комплекса. Из представленного на рис. 32 сканированного изображения планшета с полимерами, содержащими иммобилизованные зонды Z, после проведения обратной гибридизации (Схема 8А) с правильными матрицами MZ1 - MZ3 и выявления продуктов видно, что интенсивность окрашивания полимеров, содержащих «мостиковые» олигонуклеоти-ды Zla - Z3b практически не отличается от интенсивности окрашивания контрольного олигомера Z1, т.е. все иммобилизованные модифицированные олигонуклеотиды способны образовывать комплементарные комплексы с соответствующими правильными матрицами и могут быть использованы в качестве зондов при ДНК-диагностике. Далее мы исследовали влияние ненуклеотидных вставок в составе зондов на их способность дискриминировать однонуклеотидные несоответствия в матрицах при гиб-ридизационном анализе. Оказалось (Рис. ЗЗА), что интенсивность окрашивания полимера с иммобилизованным нативным немодифицированным зондом Z3 после проведения гибридизации с матрицей, содержащей однонуклеотидную замену (комплекс Z3/MZ3-g) не отличается от интенсивности окрашивания полимера при использовании правильной матрицы (Z3/MZ3) (Тпл 81 С). Более того, «неправильный» комплекс Z3/MZ3-g окрашивался с равной или даже большей интенсивностью, чем комплекс Z0/MZ0 (Тпл 56С). Введение в состав олигонуклеотидного зонда Z3 ненуклеотидных вставок приводит к тому, что модифицированные зонды Z3a и Z3b становятся способными дискриминировать однонуклеотидную замену в матрице MZ3-g, что видно из сравнения окрашивания полимеров в лунках планшета, соответствующих контрольным немодифициро-ванным гибридизационным комплексам (Z3/MZ3-g и Z3/MZ3) (Рис. ЗЗА) и комплексам с участием модифицированных зондов (Z3a/MZ3-g и Z3a/MZ3) и (Z3b/MZ3-g и Z3b/MZ3) (Рис. ЗЗБ). Повышение дискриминирующей способности «мостиковых» олигонуклеотидных зондов, по сравнению с контрольными зондами, наблюдалось и при параллельной сэн- двич-гибридизации (Схема 8Б). Модельные комплексы нативных Z4, Z5 и Z6 или модифицированных Z4a, Z5a и Z6a зондов с несущим метку олигонуклеотидом patttgggcgt-Віо в присутствии правильных и «неправильных» матриц MZ4, MZ5 и MZ6 представлены на рис. 34А.
Правильные матрицы для соответствующего зонда выделены жирным шрифтом. Видно, что в присутствии правильных матриц (диагональные лунки на рис. 34Б, В) интенсивность окрашивания полимеров, содержащих «мостиковые» олигомеры Z4a -Z6a, практически не отличается от интенсивности окрашивания полимеров с контрольными Z4 - Z6 олигонуклеотидами. Что касается выявления нуклеотидных несоответствий в составе исследуемых матриц, то контрольные немодифицироваиные олигонуклеотиды Z4 - Z6 не способны в полной мере выполнить эту задачу: селективная гибридизация наблюдается только в случае зонда Z6 в комплексе с матрицей MZ6 (Рис. 34Б, Г). С матрицами MZ4 и MZ5 этот зонд гибридизуется гораздо слабее. Зонд Z5 способен дискриминировать только матрицу MZ6, а для олигомера Z4 интенсивности сигналов гибридизации с правильной MZ4 и «неправильными» матрицами MZ5 и MZ6 различаются совсем слабо (Рис. 34Б, Г). В случае «мостиковых» олигонуклеотидных зондов видно, что гибридизация происходит всегда селективно (Рис. 34В, Д). Интенсивное окрашивание полимеров с иммобилизованными зондами Z4a, Z5a и Z6a наблюдается только при использовании полностью комплементарных матриц MZ4, MZ5 и MZ6. Таким образом, показано, что использование олигонуклеотидных зондов с ненук-леотидными вставками позволяет эффективно дискриминировать в одинаковых условиях матрицы, содержащие нуклеотидные несоответствия, т.е. «мостиковые» олигонуклеотиды, иммобилизованные на носителе, могут быть использованы в качестве высокосе-лективных к нуклеотидным несоответствиям в составе ДНК-матрицы зондов в методе молекулярной гибридизации. Выше (Разделы 3.3.2. и 3.3.3.) было показано, что «мостиковые» олигонуклеотиды могут быть субстратами при проведении ферментативной реакции и способны дискриминировать нуклеотидные несоответствия в составе матрицы в присутствии ДНК-зависимых ферментов (Т4 ДНК-лигазы и Год-полимеразы). Мы использовали это свойство «мостиковых» олигомеров при разработке описанного ниже подхода для твердофазного гибридизационного анализа. Использование упомянутых ферментов позволило, кроме того, ввести репортерную группу в иммобилизованный на твердофазном носителе олигонуклеотидный зонд, находящийся в составе гибридизационного комплекса. В этом случае метка оказывается ковалентно связанной с носителем, что позволяет применять более жесткие процедуры отмывки, что, в свою очередь, приводит к увеличению соотношения сигнал/шум, повышая тем самым специфичность сигнала гибридизации. Реакцию лигирования и выявление продукта, иммобилизованного на полимере, проводили по схеме 9:
