Введение к работе
Актуальность тег-ш диссертации. Цитохром Р-450 (Р-450) является терминальной окепдазой в монооксигенаэмон системе, которая широко распространена в природе и участвует в детокенкашш ксенобиотиков, биосинтезе стероидных гормонов, простагландннов, лейкотрненов, желчных кислот и витаминов группы D3 Значимость процессов трансформации этих соединений ставит его в один ряд с такими гемопротепдамн, как гемоглобин и ммоглобпн, каталаза и пероксидаза.
Развитие в последние годы микробиологического способа получения белка с использованием в качестве продуцента клеток дрожжей и бактерии позволяет нарабатывать в больших масштабах ферменты монооксигеиазной системы. В связи с этим большие надежды возлагаются также на использование Р-450 для контроля за загрязнением окружающей среды, окисления химических соединении, используемых в производстве пищевых продуктов, и синтеза новых лекарств.
Особенный интерес представляет исследование Р-450-эависимых ферментов, участвующих в биосинтезе стероидных гормонов, поскольку это позволяет выяснить молекулярные основы ряда тяжелых наследственных заболеваний, связанных с нарушением гормонального гомеостаза н открывает перспективу их пренатальной диагностики. К настоящему времени имеется информация о взаимосвязи структуры и функций Р-450: определены С-концевон гем-связывагаший пептид, установлены предположительные области связывания стероидных субстратов, а также N-концевой фрагмент, выполняющий роль "якоря" в лнпндной мембране (Nelson D.R., 1988; Gotoh О., 1992). Однако, до сих пор остается дискуссионным ряд вопросов: какова общая схема организации цптохромов Р-450 в мембране, какова природа взаимодействия между белками-партнерами вовлеченными в стероидогенез, чем обусловлена субстратная специфичность?
Связь работы с к рунными научными п рограммами. темами.
Диссертационная работа выполнялась в- рамках плановой темы Института
биоорганической химии ЛИ Беларуси "Исследование молекулярных механизмов и
структурных основ функционирования молооксигенязных систем с участием Р-450"
(№ гос. регистрации 19941428) ив рамках Международного сотрудничества с
Институтом Молекулярной Биологин в Тайване, а также представляет собой
логическое продолжение структурно-функциональных 'исследований
стероидгидроксилирующих ферментных систем, проводимых в ИБОХ АНБ.
Цель ч задачи исследования. Основная задача работы - изучение'молекулярноГі организации цитохрома Р-150с21 (Р-450с21) в растворе и п составе лнпндной мембраны, а также установление структурно-функциональных взаимоотношений между отдельными компонентами мнтохонариальной и микросомалыюй монооксигеназннх систем клеток коры надпочечников.
2 Научная новизна полученных результатов Впервые показано, что
адренодоксинредуктаза стимулирует как 17а-, так и 21-гндроксилазные активности
макросом коры надпочечников быка, в то время как цитохром Ь5 ингибирует их как в
присутствии адренодоксннредуктазы, так и в ее отсутствие. Установлено, что
ограниченный трипсннолиз Р-450с21 как в мембране, так и d растворе приводит к
образованию двух полипептидных фрагментов с молекулярными массами 25 и 29 кДа,
которые жестко связаны с мембраной. Зарегистрировано уменьшение ферментативной
активности и частичный переход Р-450с21 в форму с максимумом поглощении при 420
им после проведения ограниченного трипсннолнза. Осуществлена гетерологнческая
экспрессия Р-450с21 человека в клетках бактерий Escherichia coli (Е. coli) и разработан
метод выделения н очистки 21-гидроксилазы из бактериальных мембран с помощью
металло-аффннной хроматографии.
Практическая значимость полученных результатнії. Установленные структурно-функциональные взаимоотношения в ряду Р-450-завнсимых моноокснгеназ являются основой для понимания действия сложных, многокомпонентных систем на молекулярном уровне, а также тонких механизмов регуляции процессов биосинтеза стероидных гормонов. Создание на базе полученных результатов простых шунтированных систем, содержащих митохондриальные и мнкросомальные монооксигеназы и их вспомогательные белки, открывает возможность их практического использования для биосинтеза физиологически активных соединений.
Экономическая значимость полученных результатов. Подходы, применяемые для гетерологическон экспрессии и очистки Р-450с21, могут быть также использованы при выделении других лабильных белков нз биомассы различных микроорганизмов и тканей. Полученные стероидгидроксилирующие ферменты могут использоваться при создании бпокатализаторов для получения стероидных гормонов и их аналогов. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Изучение взаимоотношений микросомальных и митохондриальных систем гндроксилировання стероидов локализованных в коре надпочечников быка.
-
Разработка высокоэффективного метода выделения и очистки до гомогенного состояния Р-450с21 из коры надпочечников быка.
-
Установление физико-химических, спектральных и каталитических характеристик Р-450с21 из надпочечников быка.
-
Исследование иммунохимических свойств 21-гндроксилазы.
-
Определение топологии Р-450с21 в липидной мембране с использованием ограниченного прйтеолнза и иммунохимических подходов.
-
Осуществление гетерологнческой экспрессии Р-450с21 человека в клетках Е. coli.
7. Разработка метода очистки Р-ч50с21, экспресснропанного п Е. соїі с
использованием металло-аффпнной хроматографии, н изучение физико-химических свойств очищенного белка.
Личный пклад соискателя. Результаты по исследованию взаимоотношений мнкросомальных и ннтохондрнальных систем гидрокснлировання стероидов и очистке Р-450с21 получены лично автором диссертации. В изучении влияния ограниченного трипашолта на ферментативные и спектральные свойства Р-450с21 принимала участие инженер С.Л. Былинская. В разработке метода гетерологическон экспрессии 21-гндроксилазы и ее очистки из бактериальных мембран оказывал помощь научный сотрудник, кандидат химических наук В.М. Гуэов. Кроме того, в постановке темы диссертационного исследования и обсуждении полученных результатов принимал участие главный научный сотрудник, доктор химических наук С.Л. Усанов.
Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации доложены на 7-ой Международной конференции "Цнтохром Р-450: биохимия и биофизика", Москва (1991 г.), 8-ой Международной конференции "Цнтохром Р-450: биохимия, биофизика и молекулярная биология", Португалия (1993 г.), 9-ом Международном симпозиуме "Мнкросомы и окисление лекарств", Израиль, Иерусалим, (1992 г.). .
Опублнновяппость результатов. Основные результаты диссертационной работы изложены в 3-х статьях, 1 сборнике, 3-х тезисах конференций.
Структура и объем диссертации, Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, экспериментальной части, материалов и методов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 15G страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 11 таблиц. Библиография включает 254 наименования.
Похожие диссертации на Молукулярная организация и структурно-функциональная характеристика природного и рекомбинантного цитохрома Р-450с21
