Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Основные морфологические элементы рибосомы 11
2.2. Инициация трансляции 15
2.3. Связывание аа-тРНК с Аучастком 33
2.4. Пептидилтрансферазная реакция 55
2.5. Транслокация 74
3. Результаты и их обсуждение 104
3.1. Мутагенез рРНК и способы выделения рибосом, содержащих мутации..105
3.1.1. Используемые плазмиды 105
3.1.2. Используемые штаммы 107
3.1.3. Выделение рибосом, несущих летальные мутации 108
3.2. Определение генов, кодирующих рРНК метилтрансферазы и получение рибосом, не содержащих метилированных оснований 114
3.3. Методы изучения фенотипа мутаций и отсутствия модификаций рРНК 118
3.3.1. Измерение характеристик роста клеток 118
3.3.2. Измерение точности трансляции in vivo 119
3.3.3. Химическая модификация 120
3.3.4. Выделение компонентов для тестов in vitro 121
3.3.5. Toy-принт 123
3.3.6. Изучение связывания тРНК с рибосомой 124
3.3.7. Измерение активности белковых факторов трансляции 126
3.4. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G966 16S рРНК 128
3.5. Мутации нуклеотидов спиралей 31,34,35 и 38 16S рРНК.' 133
3.6. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G1835 23S рРНК 142
3.7. Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В1а: укорочение ASF 146
3.8. Мутации нуклеотидов, образующих "ворота", через которые проходит перемещение аа-тРНК в А участок 152
3.9 Разработка метода прямого определения протонированных оснований в рРНК 158
3.10. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей G2445 23S рРНК 162
3.11. Определение гена рРНК-метилтрансферазы, метилирующей А1618 23S рРНК 166
3.12. Изучение роли Е участка в работе рибосомы с помощью мутации C2394G, препятствующей связыванию тРНК с Р и Р/Е участками 173
3.13. Изучение роли нуклеотида G2655 SRL 23S рРНК в связывании EF-G и транслокации 188
3.14. Изучение роли взаимодействия между спиралями 89 и 91 23S рРНК в функционировании факторов трансляции - GTPa3 192
3.15. Изучение роли взаимодеііствия между спиралями 39 23S рРНК и D петлей 5S рРНК в формировании структуры РТС и участка предполагаемой передачи аллостерического сигнала 203
3.16. Изучение движения GAC, как основного конформационного изменения, необходимого для связывания EF-G. Роль GAC в связывании EF-G и EF-Ти 208
4. Материалы и методы 223
4.1 Реактивы и биопрепараты 223
4.2. Буферы и растворы 223
4.3. Штаммы и плазмиды 227
4.4 Манипуляции с ДНК: клонирование, мутагенез 232
4.4.1 Выделение плазмидной ДНК 232
4.4.2. Определение концентрации ДНК в растворе 232
4.4.3 ПЦР 232
4.4.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 233
4.4.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 233
4.4.6. Приготовление векторов и вставок 234
4.4.7. Лигирование 234
4.4.8. Приготовление компетентных клеток Е. coli 234
4.4.9. Трансформация компетентных клеток Е. coli 235
4.4.10. Мутагенез М13 по методу Кункеля 235
4.4.11. Мутагенез с помощью набора QuickChange (Stratagene) 236
4.4.12. Создание плазмид для экспрессии генов 16S и 23S рРНК с мутациями 236
4.4.13. Создание плазмиды, кодирующей модельную мРНК 237
4.4.14. Создание плазмиды pYbinPPAA 237
4.5. Манипуляции с клетками 238
4.5.1. Создание штаммов для экспрессии генов рРНК с мутациями...238
4.5.2 Измерение времени удвоения клеток 238
4.5.3. Измерение скорости вытеснения клеток мутантных штаммов клетками дикого типа при совместном культивировании 239
4.5.4. Измерение точности трансляции in vivo 239
4.5.5. Создание штаммов для экспрессии генов рекомбинантных белков 240
4.6 Выделение рибосом, рибосомных субчастиц, рРНК и частично депротеинизированных частиц 240
4.6.1. Выделение рибосом из штамма AVS69009 240
4.6.2. Выделение рибосом с помощью аффинной хроматографии 241
4.6.3. Выделение больших количеств рибосом 242
4.6.4. Выделение рРНК 244
4.6.5. Выделение суммарной клеточной РНК 244
4.6.6. Выделение частиц, частично депротеинизированных LiCl 244
4.6.7. Выделение частиц, частично депротеинизированных NH4Cl/EtOH 244
4.7. Выделение рекомбинантных белков 245
4.7.1. Выделение рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии на NiNTA агарозе 245
4.7.2. Электрофоретическое разделение белков в SDS-ПААГ 246
4.8 Выделение других компонентов для реакций in vitro 246
4.8.1. Получение S100 экстракта без тРНК 246
4.8.2. Получение аминоацил-тРНК 247
4.8.2.1. Получение [3H]Met-TPHKfMet Е. coli 247
4.8.2.2. Получение [14C]Phe-TPHKPhe Е. coli 248
4.8.2.3. Получение Lys-TPHKLys . coli 249
4.8.2.4. Получение радиоактивно меченной тРИК^-Е. coli 249
4.8.2.5. Получение радиоактивно меченной TPHKf,et Е. coli 249
4.8.3. Получение мРНК, кодирующей MFK пептид 250
4.8.4. Электрофорез РНК в денатурирующем ПААГ 250
4.9. Манипуляции с рРНК в составе рибосом и в депротеинизированном виде ..251
4.9.1. Ферментативное метилирование рибосом, рРНК и частично депротеинизированных частиц 251
4.9.2. Обработка рибосом и рРНК борогидридом натрия для модификации протонированных оснований 251
4.9.3. Обработка рибосом и рРНК модифицирующими реагентами...252
4.9.3.1. Модификация диметилсульфатом 252
4.9.3.2. Модификация кетоксалем 252
4.9.3.3. Модификация карбодиимидом 252
4.9.4. Вырезание фрагмента РНК с помощью РНКазы Н 252
4.9.5. Разрезание фрагмента РНК с помощью РНКазы ТІ 253
4.9.6. Анализ олигонуклеотидных фрагментов рРНК с помощью масс-спектрометрии 253
4.9.7. Анализ модификации рРНК с помощью обратной.транскрипции 253
4.9.8. Анализ с помощью обратной транскрипции соотношения рРНК дикого типа и рРНК, несущей мутации в образце 254
4.10 Функциональные тесты рибосом 254
4.10.1. Оценка способности рибосомных субчастиц к ассоциации 254
4.10.2. Оценка эффективности poIyU-зависимого синтеза polyPhe и частоты ошибочного встраивания Leu 255
4.10.3. Тестирование при помощи тоу-принта способности мутантных рибосом осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro ...255
4.10.4. Стимуляция СТРазной активности фактора элонгации G 256
4.10.5. Стимуляция СТРазной активности фактора инициации 2 257
4.10.6. Стимуляция СТРазной активности фактора элонгации Ти 257
4.10.7. Анализ функциональных комплексов рибосомы с помощью химической модификации (футпринтинг) 257
4.10.8. Определение степени связывания тРНК с рибосомами с помощью фильтрования через нитроцеллюлозные фильтры 258
4.10.9. Измерение степени и скорости образования дипептида .259
4.10.10. Пуромициновая реакция 261
5. Выводы 262
6. Список цитируемой литературы 263
7. Список публикаций по теме диссертации 283
- Пептидилтрансферазная реакция
- Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В1а: укорочение ASF
- Выделение рибосом с помощью аффинной хроматографии
- Тестирование при помощи тоу-принта способности мутантных рибосом осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro
Введение к работе
Жизнь основана на взаимодействии и взаимопревращении биомолекул и собранных из них надмолекулярных устройств. Биомолекулы физически и химически ничем не отличаются от всех остальных органических и неорганических соединений и совершенно также подчиняются классическим законам химии [1]. Однако биомолекулы обладают несвойственной другим молекулам особенностью, которая делает их столь интересными в глазах исследователей. Эта особенность, присущая также устройствам, созданным человеком, - функциональность. Биологические молекулы обладают функцией, или многими функциями, и эта функциональность заложена в биомолекулах изначально, т.е. они возникли (были отобраны в ходе эволюции) для выполнения той или иной цели. Мы не можем ответить на вопрос: "зачем в природе водород?", но можем ответить на вопрос: "зачем в природе рибосома?". С тем, чтобы по возможности, не слишком углубляться в вопросы философии, мы не будем стремиться пройти по цепочке последовательных вопросов "зачем синтезировать белки?", "зачем нужен метаболизм?", "зачем нужна жизнь?", оставив это занятие Фоме Аквинскому [2]. В данной работе нас больше будет интересовать, насколько можно приписать функциональность более мелким компонентам, частям биомолекул. В этом ключе уместно будет сравнить биомолекулы с устройствами, созданными человеком. Несмотря на то, что принципы работы молекулярных устройств живой природы и, скажем, автомобиля, совершенно различны, нас будут интересовать "детали" молекулярного устройства, функцию которых мы будем стараться понять, как, например, мы можем понять функцию руля или фар у автомобиля.
Данная работа посвящена изучению рибосомы. Рибосома - это крупное надмолекулярное устройство, функция которого заключается в синтезе белков [3], согласно информации, закодированной в матричной РНК (мРНК) [4]. При этом синтез белка осуществляется из аминокислотных остатков, присоединенных к индивидуальным транспортным РНК (тРНК). Каждая тРНК отвечает за перенос одной единственной аминокислоты и может существовать в трех видах: деацилированном (без аминокислоты), аминоацилированном (с аминокислотой, присоединенной к ее 3 -концу) и пептидильном (с присоединенным к 3 -концу пептидом). Собственно, синтез белка, т.е. полимеризация аминокислот, состоит из повторяющихся реакций присоединения растущего пептида к аминокислоте. При этом до начала реакции и пептид, и аминокислота присоединены к разным молекулам тРНК.
Изучение рибосомы ведется уже несколько десятилетий, за которые был накоплен колоссальный массив данных о структуре рибосомы и протекании всех этапов ее функционального цикла. В наше время основной интерес представляет взаимосвязь структуры и функции отдельных элементов рибосомы. Эта взаимосвязь изучается с помощью двух дополняющих друг друга подходов. Во-первых, это изучение параметров протекания тех или иных стадий цикла работы рибосомы и выявление сопутствующих им структурных изменений тех или иных компонентов рибосомы и ее лигандов. Во-вторых, это намеренное изменение каких-либо элементов рибосомы или ее лигандов и выявление тех стадий функционального цикла, которые были нарушены в результате такого воздействия. Естественно, что оба эти подхода применяются совместно и необходимо дополняют друг друга. Воспользовавшись аналогией, можно представить себе, что для изучения функционирования автомобиля можно подвергать его различным тестам, как на станции технического осмотра, а можно ломать последовательно те или иные детали автомобиля и смотреть с помощью тестов, какие функции окажутся нарушенный. В случае рибосомы, "ломать" что-либо можно несколькими основными способами. Во-первых, использовать аналоги субстратов, неспособные участвовать в тех или иных химических реакциях. Например, вместо GTP использовать его негидр о лизуемый аналог -GDPNP. Во-вторых, использовать природные ингибиторы работы рибосомы -антибиотики. Эти, как правило, небольшие молекулы связываются с достаточно небольшим участком рибосомы или ее лигандов и могут влиять на множество стадий работы рибосомы. И, в-третьих, можно вводить мутации в компоненты рибосомы и изучать функциональные последствия таких структурных изменений.
Особое внимание мы уделим движущимся "деталям" рибосомы. Говоря о движении компонентов и лигандов рибосомы, необходимо оговориться, что рибосома, как и всякое другое молекулярное образование, подчиняется статистическим законам физической химии и не может быть полным аналогом какой-либо механической машины, созданной человеком [5, 6]. Функционирование рибосомы построено на принципах работы всех ферментов и движения компонентов и лигандов рибосомы должны относиться к следующим нескольким типам. Во-первых, взаимодействие рибосомы и ее лиганда может быть построено на принципе "жесткого соответствия" [7], когда и рибосома и ее лиганд при взаимодействии друг с другом не изменяют своей пространственной структуры. Тогда только сам факт связывания лиганда будет иметь функциональное значение. Во-вторых, связывание лиганда может осуществляться по принципу "индуцированного соответствия" [8]. При этом конформационное изменение рибосомы при связывании с лигандом будет происходить из-за того, что тот или иной компонент рибосомы или лиганд обладает достаточной подвижностью, и одна из его конформаций стерически благоприятна для связывания. В этом случае мы будем наблюдать, что при связывании с лигандом рибосома меняет конформацию, но никакой функциональной ролью это изменение конформаций не обладает — важно лишь связывание лиганда. В-третьих, изменение конформации рибосомы или ее лиганда при связывании может иметь функциональное значение. При этом мы можем говорить об "аллостерическом эффекте" [9], когда взаимодействие рибосомы с лигандом может влиять на конформацию других лигандов или компонентов рибосомы, не находящихся в прямом контакте с участниками взаимодействия. Иными словами, функциональные центры рибосомы получают возможность "передавать сигналы" друг другу. Разумеется, такая передача сигналов возможна только с помощью индуцированного изменения структуры элементов рибосомы/лигандов, находящихся между сообщающимися центрами. И, в-четвертых, изменение пространственного расположения молекулярных структур рибосомы или ее лигандов может быть обусловлено их подвижностью и не иметь никакого функционального значения.
В обзоре литературы будут последовательно рассмотрены инициация синтеза белка, связывание аминоацил-тРНК (аа-тРНК) с А участком рибосомы, пептидилтрансферазная реакция и транслокация. Будут сформулированы основные вопросы, относящиеся к механизму протекания отдельных стадий, и дан обзор тех ответов, которые уже были найдены.
Пептидилтрансферазная реакция
Различные домены вторичной структуры 16S рРНК соответствуют крупным пространственным блокам 30S субчастицы (Рис. 2 а, б). "Тело" и "плечо" образует 5 -концевой домен 16S рРНК, центральный домен образует "платформу", главный 3 -концевой домен 16S рРНК составляет "голову" 30S субчастицы, а малый 3 -концевой домен 16S рРНК располагается на границе с 50S субчастицей и входит в состав "тела" малой субчастицы (Рис. 2 б). Кроме перечисленных крупных частей 30S субчастицы, можно отметить более мелкие детали: туннель, в ходе трансляции содержащий 3 -концевую часть мРНК, шпору, образованную спиралью 6 16S рРНК, и "шею", образованную спиралью 28 16S рРНК (Рис. 2 б). Глобулярные домены рибосомных белков располагаются на периферии субчастицы, особенно с той стороны, которая обращена от 50S субчастицы (у обеих субчастиц сторона, противоположная месту их контакта, называется цитоплазматической). Немногочисленные исключения, белки, находящиеся на поверхности 30S субчастицы и обращенные к большой субчастице, такие как S12 и S13, имеют важное функциональное значение.
Большая субчастица содержит молекулы 23S рРНК (2904 нуклеотидных остатка) и 5S рРНК (120 нуклеотидных остатков) (Рис. 2 в). Кроме того, в состав большой субчастицы входит более 30 белков, пронумерованных от L1 до L36. Несколько белковых полос были пронумерованы, но позже оказались вариациями уже известных белков. Так, L8 оказался комплексом L10 (L7/L12)2, L7 и L12 оказались идентичными, за исключением посттрансляционного ацетилирования, а белок L26 - белком S20 малой субчастицы. К изначально определенным 34 полосам позже были добавлены L35 и L36. Пространственная структура 50S субчастицы также определяется ее основным компонентом — 23S рРНК [21]. В пространственной структуре большой субчастицы можно выделить характерные выступы: L1 и L7/L12 "пальцы" и центральный протуберанец, образованный 5S рРНК и белками L5, L18 и L25. Кроме того, в структуре 50S субчастицы видна ложбина, в глубине которой располагается каталитический пептидилтрансферазный центр рибосомы (РТС) (Рис. 2 г). От РТС к цитоплазматической стороне 50S субчастицы идет сквозной туннель, через который осуществляется, по многочисленным данным, выход пептида [22, 23]. Глобулярные домены белков большой субчастицы, также как и белков малой, располагаются по краям субчастицы (Рис. 2 д). Особенно богата белками цитоплазматическая сторона 50S субчастицы и сторона, примыкающая к L7/L12 пальцу. Межсубчастичное пространство, напротив, обеднено белками. Во внутреннем пространстве 50S субчастицы, помимо нуклеотидных цепей рРНК, представлены развернутые белковые цепи, обогащенные положительно заряженными аминокислотами (Рис. 2 д). Рибосомные белки, за исключением нескольких, расположенных на выступах 50S субчастицы, контактируют с несколькими доменами 23S рРНК и служат своеобразным "клеем", соединяющим элементы вторичной структуры рРНК в пространстве [20].
В основе структурной организации рРНК в рибосоме лежит ее вторичная структура [13,24]. Достаточно "жесткие" спирали рРНК соединены подвижными сочленениями. Одноцепочечные участки, соединяющие спирали, как правило, структурированы и скреплены многочисленными водородными связями и стекинг взаимодействиями. Тем не менее, подобные сочленения обладают большей гибкостью, нежели двойные спирали. Отдельные элементы вторичной структуры скреплены как РНК-белковыми взаимодействиями, так и третичными взаимодействиями РНК. В случаях конформационных изменений РНК, протекающих в рибосоме, можно с достаточной долей уверенности говорить о движении "жестких" спиралей рРНК друг относительно друга за счет изменения сочленений и третичных контактов.
Описание топографии рибосомных субчастиц было бы не полным без краткого упоминания о расположении функциональных центров (Рис. 1 а,б), к которому мы будем неоднократно обращаться в дальнейшем. Малая субчастица (Рис. 1 а) образует декодирующий центр и связывает мРНК вокруг "шеи" [25, 26]. Платформа 30S субчастицы находится в контакте с 5 -концевой областью мРНК, затем следует участок, взаимодействующий с молекулами тРНК, после чего начинается туннель, содержащий 3 -концевую часть мРНК [27]. Участки связывания тРНК образуют обе субчастицы. А участок служит местом связывания аа-тРНК, Р участок содержит пептидил-тРНК, а в Е участке находится деацилированная тРНК, покидающая рибосому на следующем шаге трансляции. Пептидилтрансферазный центр, расположенный на большой субчастице, связывает 3 -концы тРНК, находящихся в А и Р участках и, соответственно, синтезируемый пептид и аминокислоту, на которую пептид необходимо перенести. Кроме того, выделяют участок связывания белковых факторов — GTPa3, включающий в себя L7/L12 палец, т.н. центр, ассоциированный с ОТРазной активностью (GAC), и сарцин-рициновую петлю (SRL).
Информация об аминокислотной последовательности белка, который необходимо синтезировать рибосоме, содержится в матричной РНК (мРНК). У прокариот мРНК не содержат кепа и полиаденилового хвоста. Область, кодирующая белок (открытая рамка считывания) как правило, находится во внутренней части мРНК, т.е. мРНК содержит дополнительные 5 - и 3 - нетранслируемые участки. Имеются и редкие исключения, когда трансляция начинается прямо с 5 -конца мРНК [28]. Часто мРНК прокариот кодируют несколько белков, рамки считывания которых расположены одна за другой с небольшими перерывами. Следовательно, участки начала кодирующих областей могут располагаться практически в любом месте мРНК. Инициация трансляции у Е. coli всегда происходит с участием специфической инициаторной fMetPHKfMet. Формилметионин всегда служит первой аминокислотой при синтезе любого белка, хотя впоследствии может деформилироваться и отщепляться. Кроме мРНК и fMetPHKfMet в инициации трансляции принимают участие три белка - фактора инициации - IF1, IF2 и IF3.
Какие задачи необходимо решить для того, чтобы инициация трансляции прошла без ошибок? 1. Связать мРНК и определить точку начала кодирующей области - первый кодон. 2. Связать fMetPHKfMet. При этом ее необходимо отличить от элонгационных тРНК, в том числе и от MetPHKMet. Кроме того, необходимо также отличить fMetPHKfMet от деацилированной TPHKfMet и неформилированной MetPHKfMet. 3. До образования правильно сформированного комплекса не допускать перехода рибосомы в стадию элонгации, т.е. не допускать связывания аа-тРНК в А участок и протекания пептидилтрансферазной реакции. 4. Сформировать комплекс рибосомы, содержащий в Р-участке fMetPHKfMet, взаимодействующую с инициаторным кодоном в декодирующем центре малой субчастицы. Остаток fMet при этом должен находиться в пептидилтрансферазном центре большой субчастицы и быть готовым к транспептидации, а А участок рибосомы должен быть готов к связыванию аа-тРНК.
Изучение функциональной значимости межсубчастичного мостика В1а: укорочение ASF
Итак, SD-последовательность или участок связывания S1 задают точку старта трансляции с точностью до нескольких нуклеотидов, а далее инициаторная fMetPHKf ct "ищет" инициаторный кодон среди нескольких кодонов, расположенных на оптимальном расстоянии от SD - последовательности. Таким образом, проблема поиска начала кодирующей области мРНК решена. Каким же образом 30S субчастица и инициаторные факторы выбирают fMetPHKfMct и как отсеивают элонгационные аа-тРНК и деацилированные и деформилированные TPHKfMet? В ходе элонгации все тРНК проходят через Р участок рибосомы и по необходимости должны прочно с ним связываться. В пробирке практически любая тРНК может напрямую связаться с Р участком рибосомы, однако в клетке на стадии инициации отбирается только fMetPHKfMet. Достаточно давно было показано, что за селективность инициации по отношению к fMetPHKfMet "отвечают" белки IF2 и IF3 [38]. Для того чтобы отличить инициаторную тРНК от элонгаторных, необходим IF3 [39].
Предполагалось, что IF3 напрямую взаимодействует с fMetPHKfMct, но не взаимодействует (хуже взаимодействует) с элонгаторными тРНК [44]. Известно, что IF3 способствует диссоциации рибосомы на субчастицы [45]. Отсюда был сделан вывод о том, что IF3 задерживает ассоциацию субчастиц до тех пор, пока не будет связана fMetPHKfMct [46]. Инициаторный фактор 3 состоит из двух доменов: N и С. Его расположение на 30S субчастице не совсем понятно. С помощью сшивок было показано, что IF3 контактирует со спиралями 26 и 45 16S рРНК [47]. IF3 защищает от химической модификации основания нуклеотидов G700, U701, G703, G791 и U793, входящих в состав спиралей 23 и 24 16S рРНК [48]. Для того, чтобы определить, какие участки рРНК расположены рядом с IF3 использовали также и разрезание рРНК гидроксил-радикалами (ОН ) [40]. Опыт проводили в двух вариантах. Во-первых, искали нуклеотидные остатки 16S рРНК, разрезание которых предотвращает связывание IF3. Во-вторых, использовали локализованное образование ОН", катализируемое ионами железа, присоединенными к поверхности IF3. На основании полученных данных построили модель взаимодействия IF3 с рибосомой. Эта модель учитывает места связывания IF3 с рибосомой, определенные с помощью химической модификации, и пространственную структуру отдельных доменов IF3 [49-51](Рис. 4 а). Согласно модели, N-домен IF3 взаимодействует с платформой 30S субчастицы в районе белка S11, а С-домен закрывает участок платформы необходимый для ассоциации с 50S субчастицей [40]. Помимо этого, С-домен находится рядом с местом связывания fMetPHKfMet. Таким образом IF3 может осуществлять отбор тРНК и препятствовать ассоциации субчастиц. Предложенная модель согласовывалась с возможностью сшивки IF3 со спиралью 45 16S рРНК, но противоречила возможности образования сшивки со спиралью 26 16S рРНК, находящейся с цитоплазматической стороны платформы. Изучение комплекса С-концевого домена IF3 с 30S субчастицей с помощью РСА [41] показало, что этот домен связывается с цитоплазматической стороны платформы малой субчастицы (Рис. 4 б). Чтобы минимизировать противоречия с результатами, полученными методом химической модификации и сшивания, было предположено, что N-домен располагается на межсубчастичной части платформы (Рис. 4 б). Поскольку С - домен IF3 имеет антиассоциативную активность и без N - домена [52], был сделан вывод о том, что влияние IF3 на ассоциацию субчастиц носит аллостерический характер. Применение крио электронной микроскопии (криоЭМ) не помогло разрешить противоречие между биохимическим и рентгеноструктурным исследованием. Изучение комплекса 30S IF3 с помощью криоЭМ низкого разрешения [42] позволило зарегистрировать дополнительную электронную плотность, как с цитоплазматической стороны платформы, так и со стороны межсубчастичного пространства (Рис. 4 в). Инициаторный комплекс, содержащий все три инициаторных фактора, fMetPHKf ct и обе рибосомные субчастицы изучали с помощью криоЭМ высокого разрешения [43]. В пространственной структуре подобного комплекса достаточно легко было отличить те участки, которые занимают 30S и 50S субчастицы. Отличить область, соответствующую N и С доменам IF3, от участков, занятых другими лигандами, оказалось более сложным делом (Рис. 4 г). Пространственное расположение электронной плотности, приписываемой IF3 (Рис. 4 д), в целом соответствовало результатам биохимических исследований. Однако, непонятным стало, почему IF3 препятствует ассоциации субчастиц? Во-первых, электронная плотность, приписываемая IF3, не загораживала тех участков 30S субчастицы, которые взаимодействуют с 50S. Во-вторых, сам факт существования комплекса, в состав которого входят и IF3, и 50S субчастица, говорит о том, что взаимодействие 30S субчастицы с IF3 и 50S субчастицей не является взаимоисключающим. Конечно, возможно, что антиассоциативная активность IF3 проявляется лишь по отношению к комплексам рибосомы с элонгаторными тРНК и не заключается в прямой конкуренции с 50S субчастицами за перекрывающиеся участки связывания с 30S субчастицами.
Взаимодействие IF3 с 30S субчастицей и влияние IF3 на связывание fMetPHKfMet и других тРНК детально изучали в лабораториях Эренберга [46, 53] и Ноллера [54]. Оказалось, что вопреки сложившемуся мнению, IF3 не способствует более прочному связыванию fMetPHKfMet. IF3 дестабилизирует связывание любых тРНК с 30S субчастицей и ускоряет обмен тРНК, связанных с Р участком [46, 53, 54]. Несмотря на такое дестабилизирующее действие, IF3 остается фактором селективности в выборе тРНК. Дело в том, что fMetPHKf е обладает более высоким сродством к Р участку рибосомы, чем другие тРНК, и только она может успешно "сопротивляться" дестабилизирующему действию IF3 [53]. Хотя и не было строго показано, что IF3 не имеет механизмов специфического "узнавания" fMetPHKfMet, действие IF3 может быть объяснено и аллостерическим эффектом, т.е. изменением структуры 30S субчастицы, понижающим ее сродство к тРНК. Это значит, что IF3 вызывает изменение конформации 30S субчастицы, неблагоприятное для связывания тРНК с Р участком. Также IF3 препятствует ассоциации субчастиц вне зависимости от того, какая тРНК присутствует в Р участке [53]. Из анализа кинетических кривых ассоциации рибосомньгх субчастиц в присутствии IF3 следует, что диссоциация комплекса 30S и IF3 предшествует ассоциации субчастиц [46]. Одновременное связывание и 50S и IF3 с 30S субчастицей, согласно модели инициации трансляции, предложенной Эренберго, исключено.
Выделение рибосом с помощью аффинной хроматографии
Если IF1 и IF3 взаимодействуют с 30S субчастицей и, возможно, с инициаторной тРНК, то IF2 выполняет более сложные функции, требующие нескольких конформационных изменений, которые должны произойти в течение цикла его работы. Как уже было написано, IF2 связывается с 30S субчастицей и fMetPHKfMet кооперативно [74]. При этом IF2 должен узнать формилметиониновый остаток, присоединенный к тРНК. С формилметиониновым остатком взаимодействует IV домен IF2, расположенный на значительном расстоянии от других доменов IF2 (Рис. 6). Возможно, взаимодействию IV домена IF2 с fMet способствует взаимодействие IF1 со вторым доменом IF2 (Рис. 8 а). Общепринято, что in vivo связывание IF2 с 30S субчастицей происходит, когда G-домен IF2 уже связан с GTP. Тем не менее, in vitro различными научными группами были получены взаимоисключающие результаты относительно необходимости связывания и гидролиза GTP при инициации. В работах групп Винтермайера и Гвалерци [87] было показано, что IF2, связанный с GTP и входящий в состав инициаторного комплекса с 30S субчастицей, при ассоциации с 50S субчастицей гидролизует GTP очень быстро (kGTPase=30 с"1). Отсутствие задержки между смешиванием инициаторных комплексов с 50S субчастицами и гидролизом GTP, говорило о том, что ассоциация субчастиц в присутствии IF2 проходила еще быстрее, чем гидролиз GTP. В свою очередь, выход неорганического фосфата в раствор происходил с задержкой 200 мс, после которой константа скорости выхода Pi составляла 1.5 с". Переход рибосомы в состояние, компетентное к элонгации, наблюдали по связыванию комплекса aaPHK EFu GTP с А участком рибосомы. Дело в том, что когда А участок свободен и инициаторные факторы покинули рибосому, связывание aaPHK EFu GTP с А участком быстрое (порядка 108 IvrV1). Переход рибосомы в состояние, компетентное для связывания ааPHK EFU GTP гораздо медленнее (естественно, при высоких концентрациях ааPHK EFU GTP, используемых в опыте), его константа скорости численно совпадает с константой скорости выхода Pi.
Итак, 30S субчастицы, с которыми связаны мРНК, fMetPHKfMet, и все три инициаторных фактора, быстро связываются с 50S субчастицами и сразу гидролизуют GTP. Затем с комплексом происходят какие-то превращения, приводящие к выходу Pi и переходу к элонгации. С этими положениями нет противоречий между группами Винтермайера/Гвалерци [87] и Эренберга [46, 53]. Основное противоречие заключается в необходимости связьшания и GTP. В работе Винтермайера/Гвалерци [87] было показано, что замена GTP на GDP и даже полное отсутствие нуклеотида никак не влияло на быструю ассоциацию субчастиц и медленный переход к элонгации. В работе Эренберга [46], наоборот, было показано, что для ассоциации субчастиц с высокой скоростью необходим GTP (ka=l.l 106 M V), либо его негидролизуемый аналог - GDPNP (ка=0.4 106 M V1). GDP, связанный с IF2, значительно замедлял ассоциацию субчастиц (ка=5 104 M V1). Переход к состоянию, готовому к связыванию аа-тРНК был очень быстрым для комплексов, содержащих GTP (слишком быстрым для того, чтобы измерить константу скорости без аппарата quench-flow), замедленным для комплексов, содержащих GDP и чрезвычайно медленным (к=0.004 с 1) для комплексов, содержащих GDPNP. Последнее значение совпадало с константой скорости спонтанной диссоциации комплекса IF2 GDPNP и рибосомы.
Из описанных экспериментов можно сделать следующие выводы. Во-первых, комплекс IF2 с GTP необходим для ассоциации субчастиц. Во-вторых, GDP может заменять GTP в реакции ассоциации, но это приводит к замедлению реакции. Сходный феномен встретится нам при описании транслокации, катализируемой EF-G и, возможно имеет похожую природу. В-третьих, гидролиз GTP нужен для перехода к состоянию, компетентному к элонгации.
Какие структурные изменения лежат в основе поздних стадий инициации? Структура инициаторного комплекса 30S субчастицы пока не определена. Методом РСА были определены структуры комплексов малой субчастицы с IF1 [75] (Рис. 7 а) и, отдельно, с С-доменом IF3 [41] (рис. 4 б). Использование криоЭМ для установления строения комплекса 30S с IF3 дало достаточно мало информации [42] (Рис. 4 в). Структура инициаторньгх комплексов после присоединения 50S была изучена более подробно методом криоЭМ. Группой Франка в сотрудничестве с группой Эренберга была определена структура комплекса 70S рибосомы с мРНК, инициаторной тРНК и тремя инициаторными факторами IF1, IF2 и IF3 [43] (Рис. 4 г,д). При рассмотрении этой структуры заметно наличие избыточной электронной плотности (Рис. 4 д). Допустив, что электронная плотность, расположенная в районе платформы малой субчастицы - IF3, возникает сомнение в аутентичности этого комплекса. Возможно, впрочем, что такой комплекс может образоваться сразу после присоединения 50S субчастицы. В нем IF3 должен менять свою конформацию, чтобы допустить объединение большой и малой субчастиц. На основе экспериментов по химической модификации комплекса IF3. и 30S субчастицы было предположено, что С-концевой домен IF3 должен располагаться на месте, которое в рибосоме занимает спираль 69 23 S рРНК [40]. В структуре инициаторного комплекса (Рис. 4 г) спираль 69 23 S рРНК находится в том же месте, что и на стадии элонгации трансляции. Скорее всего, пространственное положение IF3, приведенное в работе Франка и Эренберга [43], следует принимать с определенной долей осторожности. Почти наверняка, это положение отличается от положения IF3 на ранних стадиях инициации, когда осуществляется проверка соответствия инициаторной тРНК.
Положение IF2 [43] (Рис. 4 д) вполне соответствует результатам биохимических исследований [88, 89]. Комплекс был "законсервирован" заменой GTP на его негидролизуемый аналог - GDPNP. При этом объединение субчастиц происходит, но не происходит гидролиз GTP и, следовательно, не происходит разрушение инициаторного комплекса и переход к элонгации. Заметим, что относительная стабильность такого молекулярного ансамбля свидетельствует в пользу модели Эренберга [46], т.е. гидролиз GTP необходим для "ухода" инициаторных факторов. Домен ГУ взаимодействует с формилметиониновым остатком (Рис. 4 д). Это взаимодействие приводит к отклонению аминоацилированного 3 -конца fMetPHKfMet в сторону Е-участка рибосомы. Подобное гибридное РЯ состояние характерно только для инициации и служит, возможно, для предотвращения преждевременного протекания пептидилтрансферазной реакции. Впрочем, пептидилтрансферазная реакция вряд ли вообще возможна на этой стадии, поскольку А участок 30S субчастицы блокирован IF1. Нельзя исключить, что -поддержание формилметионинового остатка вне РТС важно для предотвращения его гидролиза. Также возможно, что в P/I состоянии осуществляется мониторинг G-C пары 31-39 нуклеотидом 1338. Как уже упоминалось, IF1 находится в А участке 30S субчастицы (Рис. 7 а) и взаимодействует со II доменом IF2 (Рис. 4 д). Это взаимодействие может напоминать взаимодействие EFu с аа-тРНК. Адекватно ли применение такой аналогии не вполне ясно. В отличие от аа-тРНК и EFu, гидролиз GTP инициаторным фактором II точно не нужен для связывания IF1 с А участком 30S субчастицы. Гидролиз GTP, катализируемый IF2, необходим для ухода IF1 из рибосомы. Может ли такая реакция рассматриваться как аналог стадии коррекции при связывании аа-тРНК с А участком, неизвестно.
Тестирование при помощи тоу-принта способности мутантных рибосом осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro
Далее, после гидролиза GTP, EFu меняет свою конформацию и теряет сродство к аа-тРНК. Наступает фаза коррекции. Альтернативами для аа-тРНК служит перемещение в А участок, в результате которого аминокислота оказывается в пептидилтрансферазном центре, и "уход" из рибосомыгСкорости этих реакций не менее сильно зависят от соответствия кодона и антикодона, чем активация гидролиза GTP. Константа скорости полного перемещения аа-тРНК в А участок (ks) составляет 7-12с-1 для аа-тРНК, образующей только канонические пары с кодоном мРНК [119, 121-124] и 1.6с"1, если кодон-антикодоновый дуплекс содержит "разрешенную" неканоническую пару [120]. Измерить скорость перемещения аа-тРНК в А участок, если ее антикодон образует "запрещенную" пару с кодоном, в случае проведения реакции в буфере с низкой концентрацией ионов магния, невозможно. При высокой концентрации Mg скорость перехода (ks) соответствующей кодону аа-тРНК в А участок составляет 7с"1, а не полностью соответствующей (образующей "запрещенную" пару с кодоном) - 0.1с"1 [119, 121-124]. Соответственно, скорость диссоциации комплекса рибосомы с аа-тРНК (ks) составляет 1с"1 для кодон-антикодоновых дуплексов содержащих "разрешенную" [120], и 6с" - "запрещенную" пару с кодоном [119,121-124]. Скорость ухода аа-тРНК, полностью соответствующей кодону мРНК, меньше пределов обнаружения. Итак, отсеивание несоответствующих кодону аа-тРНК осуществляется в два этапа, разделенных гидролизом GTP. Кодон-антикодоновое узнавание практически в одинаковой мере ускоряет два ключевых необратимых (в условиях проведения реакции) процесса — гидролиз GTP и полный переход аа-тРНК в А участок. Наличие "запрещенной" пары в кодон-антикодоновом дуплексе ускоряет реакции ухода аа-тРНК из рибосомы, как до, так и после гидролиза GTP. В отдельной работе изучили то, как отличаются кинетические параметры взаимодействия с А участком аа-тРНК, антикодон которой образует "запрещенную" пару с первым, вторым и третьим нуклеотидами кодона [123]. Оказалось, что ответ рибосомы на несоответствие кодона и антикодона достаточно унифицирован, с тем лишь отличием, что несоответствие второго нуклеотида антикодона "карается" более строго, чем первого и третьего.
Процесс декодирования служит мишенью нескольких антибиотиков. Тетрациклин и его производные не влияют на протекание всех стадий декодирования до стадии полного перемещения аа-тРНК в А участок [126]. Эта стадия блокируется антибиотиком. Молекула кирромицина взаимодействует с EFu, связанным с рибосомой, и предотвращает конформационное изменение фактора после гидролиза GTP. В результате, аа-тРНК оказывается застывшей в состоянии, когда ее антикодон спарен с кодоном в А участке 30S субчастицы, а аминоацилированный 3 -конец связан с EFu [127]. Большая группа антибиотиков снижают точность трансляции. Эти антибиотики можно разделить на две неравные группы по участкам их связывания с малой субчастицей рибосомы и деталям механизма действия. Одна группа состоит из единственного антибиотика стрептомицина [128], а в составе второй группы находятся паромомицин, канамицин и родственные им аминогликозиды [129]. Антибиотики оказались важнейшими инструментами, помогающими нам в понимании механизма декодирования. Мы рассмотрим их действие вместе со стадиями декодирования, на которые они оказывают влияние.
Как же происходит кодон-антикодоновое узнавание, и какие изменения структуры рибосомы, аа-тРЫК и EFu лежат в основе отдельных стадий декодирования? Связывание аа-тРНК EFu GTP с рибосомой на первом этапе не зависит от соответствия антикодона аа-тРНК кодону мРНК. Скорость этого связывания может уменьшаться в результате мутаций спирали D EFu и мутаций спиралей 4 и 5 N-концевого домена белка L7/L12 [131].
Участок L7/L12, предположительно взаимодействующий с EFu имеет сходство с участком EFs, взаимодействующим с фактором Ти [133]. L7/L12 — это весьма необычный белок, состоящий из двух доменов, соединенных подвижной частью (Рис. 12) [130,134,135]. В состав 50S субчастиц рибосом бактерий входят 4-6 молекул этого белка, организованных в димеры [130]. Димеры L7/L12 прикреплены к длинной С-концевой спирали 8 рибосомного белка L10 [130]. В свою очередь, белок L10 взаимодействует со спиралью 42 23S рРНК. Эта функционально важная спираль соединяет основу 50S субчастицы с GAC и белками L10 (L7/L12)2 и L11, взаимодействующими с трансляционными факторами - ЄТРазами. Как EFu, так и EF-G нуждаются в L7/L12 для осуществления гидролиза GTP [136, 137]. Столь необычная структура (Рис. 12) предположительно нужна для ускорения отбора соответствующих кодону мРНК тройных комплексов aaPHK EFu GTP. Нельзя забывать, что в клетке лишь один из нескольких десятков тройных комплексов может оказаться соответствующим кодону. Рибосоме необходимо иметь возможность быстро перебирать комплексы EFu и аа-тРНК и сродство EFu к L7/L12 может повышать эффективную концентрацию aaPHK EFu GTP вблизи А участка. L7/L12 "подставляет" аа-тРНК EFu GTP в А/Т участок рибосомы [92, 94]. Этот специализированный участок рибосомы образован декодирующим центром малой субчастицы и белком EFu, связанным как с малой, так и с большой субчастицами. Нуклеотидные остатки 16S рРНК, взаимодействующие с антикодоном аа-тРНК, были изучены с помощью химической модификации [56,138, 139], пришивок [140,141] и мутаций [67, 142, 143]. Основными компонентами малой субчастицы, окружающими кодон мРНК и антикодон аа-тРНК в А участке, служат спирали 18, 34 и 44 16S рРНК и белок S12. Их взаиморасположение можно было с неплохой точностью предсказать на основании результатов биохимических экспериментов [132](Рис. 13 а,б).
Особая роль в кодон-антикодоновом узнавании принадлежит спирали 44 16S рРНК. Нуклеотиды А1492 и А1493 этой спирали перестают модифицироваться диметилсульфатом при связывании аа-тРНК с А участком [56,138]. Антибиотики паромомицин, канамицин и родственные им аминогликозиды связываются со спиралью 44 16S рРНК [139]. В их присутствии аа-тРНК, неполностью соответствующие кодону мРНК, воспринимаются рибосомой как полностью соответствующие. В 10 раз возрастают скорости активации гидролиза GTP (кз) и полного перемещения аа-тРНК в А участок (ks). Одновременно в 5-6 раз падают скорости диссоциации комплекса рибосомы и аа-тРНК до и после гидролиза GTP [144]. Практически, аминогликозидные антибиотики типа паромомицина полностью имитируют "идеальное" кодон-антикодоновое узнавание.
