Введение к работе
з
Актуальность проблемы. Бактерии рода Yersinia относятся к грамотрицательным бактериям, обладающим уникальными адаптивными возможностями: они могут существовать в природе как вне живого организма, так и в теплокровном организме (включая человека), сочетая сапрофитный и паразитический образ жизни. В адаптации бактериальной клетки к постоянно меняющимся условиям среды обитания ключевую роль играют порообразующие белки (порины), являющиеся одним из основных компонентов наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий и названные так в соответствии с их специфической функцией. Они образуют в НМ водонаполненные каналы (поры) для пассивной диффузии низкомолекулярных (около 600 Да) питательных веществ и продуктов жинедеятельности бактериальной клетки. Регуляция проницаемости НМ грамотрицательных бактерий при изменении температуры, осмомолярности или величины рН среды осуществляется с помощью переключения биосинтеза поринов с одного типа на другой. В случае Escherichia coli такими белками являются неспецифические OmpF и ОтрС порины, образующие в бактериальной мембране поры различного диаметра и отличающиеся активностью по отношению к фагам и колицинам".
К настоящему времени накоплен огромный массив информации о поринах НМ грамотрицательных бактерий, включая порины патогенных для человека иерсиний (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica): установлены первичные и пространственные структуры этих белков, изучены их иммунобиологические свойства. Несравнимо меньшее количество публикаций, в основном статистически-экологической направленности, посвящено непатогенным (или "редким") видам иерсиний. Несмотря на это обстоятельство, возможность участия "редких" видов иерсиний в патогенезе человека и животных не исключается и подтверждается публикациями последних лет.
В связи с этим, исследования структурно-функциональных особенностей поринов НМ бактерий рода Yersinia, как патогенных, так и непатогенных видов, вносят, во-первых, вклад в фундаментальные представления о свойствах белков-поринов НМ грамотрицательных бактерий в целом. Во-вторых, они весьма важны для практической медицины, поскольку изучение иммунобиологических свойств поринов НМ разных видов иерсиний открывает новые возможности для разработки высокоэффективных и специфичных способов диагностики и профилактики заболеваний, обусловленных иерсиниями.
Изучение взаимосвязи структурной организации, функциональной и антигенной активности белков-поринов НМ разных видов иерсиний, отличающихся степенью патогенности для человека, с помощью современных биохимических, молекулярно-генетических и теоретических методов (компьютерное моделирование) позволит понять особенности и природу их структурно-функционального разнообразия, обусловленного постоянно меняющейся средой обитания.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа является частью систематического исследования структуры и функции поринов бактерий рода Yersinia и посвящена выделению и сравнительной характеристике пространственной структуры, функциональной активности и антигенных свойств поринов НМ Y. enterocolitica, патогенной для человека, и филогенетически близких ей непатогенных Y. intermedia, У. kristensenii и У. frederiksenii, культивируемых при температуре 6-8 ("холодовой" вариант) и 37С ("тепловой" вариант), что соответствует сапрофитным и паразитическим условиям существования иерсиний.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1) выделить и охарактеризовать физико-химические свойства поринов из Y. enterocolitica и филогенетически близких V. enterocolitica-поАобиых видов, культивируемых при различной температуре; 2) провести сравнительное изучение функциональной активности поринов НМ иерсиний; 3) провести сравнительный анализ пространственной структуры разных молекулярных форм поринов НМ иерсиний; 4) изучить влияние способа экстракции и природы солюбилизирующего агента на пространственную структуру функционально
активной формы (тримера) поринов иерсиний разных видов; 5) установить первичную структуру OmpF- и OmpC-подобных поринов из У enterocolitica и выявить особенности пространственной структуры разных типов поринов с помощью теоретических моделей; 6) изучить иммуногенные и антигенные свойства поринов иерсиний; 7) показать возможность использования поринов НМ иерсиний (на примере порина из У. enterocolitica) в качестве диагностических антигенов.
Научная новизна исследования. Впервые проведено систематическое исследование неспецифических OmpF- и OmpC-подобных поринов НМ бактерий рода Yersinia, отличающихся степенью патогенности для человека: У. enferoco/i'f/ca и филогенетически близких У. епйгосо//г/'са-подобных видов (У. intermedia, У. kristensenii и У. frederiksenii).
Установлено, что температура культивирования является одним из главных факторов, определяющих структуру и функциональную активность неспецифических поринов НМ бактерий рода Yersinia: изменение температуры культивирования иерсиний сопровождается экспрессией разных типов (OmpF и ОтрС) поринов, различающихся эффективностью неспецифической диффузии через бактериальную мембрану.
Впервые установлены различия в первичной и пространственной структуре, порообразующих и антигенных свойствах OmpF и ОтрС поринов НМ У. enterocolitica, У. intermedia, У. kristensenii и У. frederiksenii.
Установлено, что стабильность пространственной структуры поринов иерсиний определяется как типом порина, так и видом микроорганизма.
Показано, что пространственная структура изолированных поринов из НМ исследованных видов иерсиний зависит от способа экстракции порообразующего белка и природы солюбилизирующего агента, используемого для перевода порина в раствор из мембраносвязанного состояния. Обнаружена конформационная пластичность поринов в растворе на уровне третичной структуры белка.
Практическая значимость работы. Впервые показано, что неспецифические порины НМ У. enterocolitica, У. intermedia, У. kristensenii и У. frederiksenii иерсиний являются видо- и родоспецифическими белками этих бактерий и могут быть использованы в качестве диагностических антигенов.
Впервые на основе OmpF порина из У. enterocolitica разработана иммуноферментная тест-система (ИФА тест-система), позволяющая достоверно и эффективно идентифицировать иерсиниоз на разных стадиях инфекционного процесса независимо от серотипа возбудителя. Данная тест-система может быть использована как для дифференциальной диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза, так и для выявления вторично-очаговых форм этих заболеваний. Разные молекулярные формы OmpF порина из У. enterocolitica могут быть использованы для оценки некоторых показателей гуморального иммунного ответа больных с острыми и вторично-очаговыми формами иерсиниозов.
Результаты и положения работы, выносимые на защиту.
1. Порообразующие белки НМ бактерий рода Yersinia в зависимости от способа экстракции
могут быть выделены в 3-х различных молекулярных формах: тример, мономер и
термостабильный мономер.
2. Способ выделения и способ солюбилизации порина влияют на стабильность
пространственной структуры тримера - функционально активной формы белка.
3. Подобно неспецифическим поринам Є. со//, в НМ исследованных видов иерсиний при
различной температуре культивирования экспрессируются разные типы (OmpF и ОтрС)
поринов: каналы, образованные OmpF и ОтрС поринами иерсиний в модельной
бислойной липидной мембране (БЛМ), отличаются величиной и характером распределения
наиболее вероятных уровней проводимости.
4. Пространственная структура OmpF и ОтрС поринов из разных видов иерсиний
существенно различается на уровне третичной структуры, но сохраняет высокую степень
структурного подобия на уровне вторичной структуры. Вторичная структура OmpF и ОтрС
поринов иерсиний отличается устойчивостью к действию денатурирующих агентов.
5. Конформационная стабильность структуры поринов иерсиний определяется как типом
порина, так и видом микроорганизма.
6. Порообразующие белки НМ иерсиний являются родо- и видоспецифическими
антигенами и могут быть использованы как диагностические препараты.
-
ИФА тест-система на основе порина НМ V. enterocolitica позволяет выявлять иерсиниоз независимо от стадии инфекционного процесса и сероварианта возбудителя.
-
ИФА тест-система может быть использована для верификации как острых кишечных, так и вторично-очаговых форм иерсиниозов (различных иммунопатологии иерсиниозной этиологии).
9. Использование в ИФА тест-системе разных молекулярных форм (тример и
термостабильный мономер) порина из У. enterocolitica позволяет выявить различия в
гуморальном иммунном ответе у больных с острыми кишечными и вторично-очаговыми
формами иерсиниозов.
Апробация результатов работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены автором на следующих Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференциях: 2-ом Биохимических съезде (Москва, Россия, 1997); Симпозиумах по химии белков и пептидов (Москва, Россия, 2003; Москва, Россия, 2007); International Symposiums on Yersinia (Tokyo, Japan, 1995; Turku, Finnland, 2003); II и III Съездах биофизиков России (соответственно Москва, Россия, 1999 и Воронеж, Россия, 2004); XIX Pacific Science Congress (Sydney, Australia, 1999); Международной научно-практической конференции "Проблемы иерсиниозов и других актуальных инфекций" (Санкт-Петербург, Россия, 2000); 7-th International Congress on Endotoxin (Washington, USA, 2002); International Congress "Progress in Fundamental and Applied Sciences for Human Health" (Sudak, Ukraine, 2004); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Россия, 2005); Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, Россия, 2006); V Симпозиуме с международным участием «Физиология иммунной системы. Перспективные подходы к диагностике и терапии иммунопатологии и аллергических заболеваний» (Москва, Россия, 2006); VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, Россия, 2007).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 17 статей в отечественных и международных журналах и 52 тезиса докладов в сборниках трудов Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференций. Способы диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза защищены патентами РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав изложения результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 279 источников. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 49 рисунков и 16 таблиц.
