Содержание к диссертации
Введение
Модификация антрациклиновых антибиотиков, направленная на повышение избирательности противоопухолевого действия 8
Введение 8
Общие принципы создания про-лекарств 14
Создани е про-л екарств на основе антраци кл и новых антибиоти ков 15
Про-лекарства, использующие разниц в значении рН между нормальными и опухолевыми клетками 15
Про-лекарства, действующие на опухолевые клетки в состоянии гипоксии 17
Конъюгаты антрациклиновых антибиотиков с формальдегидом 19
Про-лекарства, активируемые протеазами, секретируемыми опухолевыми клетками 22
Катепсины 22
Плазмин 24
Антиген, специфичный для простаты (prostate specific antigen) 25
Про-лекарства, активируемые внутриклеточными ферментами в опухолях 26
Стратегия фермент - про-лекарство 27
ADEPT/GDEPT/VGEPT 27
ADEPT 29
Р-Лактамаза 30
Р-Глюкуронидаза 31
Абзимы 34
GDEPT/VDEPT 35
Другие варианты доставки ферментов 37
Модификация антрациклинов, направленная на изменение транспорта антрациклиновых антибиотиков 38
Производные антрациклиновых антибиотиков, взаимодействующие с рецепторами опухолевых клеток. 38
Ангиогенные факторы 38
Рецепторы к гормонам 40
Конъюгаты антрациклинов с макромолекулами 41
Конъгаты антрациклиновых антибиотиков с поли~[№-(2-гидроксшропил)- метилакриламидом)]. 42
Конъюгаты антрациклиновых антибиотиков с полиэтиленгликолем 45
Конъюгаты антрациклиновых антибиотиков с пептидными гормонами 46
Конъюгаты доксорубщина с эпидермальным фактором роста 48
Конъюгаты антрациклиновых антибиотиков с антителами 48
Другие способы доставки антрациклиновых антибиотиков 54
Обсуждение результатов 55
1. Разработка метода препаративного синтеза карминомицина 55
2. Конъюгаты антрациклиновых антибиотиков с квадратной кислотой 62
2.1 Синтез конъюгатов антрациклиновых антибиотиков с квадратной кислотой 62
2.2 Изучение антипролиферативной активности полученных производных в экспериментах in vitro 67
3. Получение новых производных антрациклиновых антибиотиков з'-n- алкильноготипа 68
3.1 Восстановительное алкилирование антрациклиновых антибиотиков DL-глицериновым альдегидом 69
3.2 Восстановительное алкилирование антрациклиновых антибиотиков моносахаридами 71
3.3 Синтез конъюгатов антрациклиновых антибиотиков с D-галактозой 73
3.4 Изучение антипролиферативной активности полученных производных в экспериментах in vitro 78
3.5 Изучение противоопухолевой активности полученных производных в экспериментах in vivo 81
4. Конъюгаты доксорубицина с галактоманнаном 85
Экспериментальная часть 94
Выводы 117
- Про-лекарства, использующие разниц в значении рН между нормальными и опухолевыми клетками
- Стратегия фермент - про-лекарство
- Рецепторы к гормонам
- Получение новых производных антрациклиновых антибиотиков з'-n- алкильноготипа
Введение к работе
Противоопухолевое действие антибиотиков впервые было обнаружено C.Hackraann в 1952 на примере актиномицина, выделенного в лаборатории S.Waksman еще в 1940 г. Это стимулировало поиски новых продуктов микробного метаболизма, представляющих интерес как потенциальные противораковые препараты. За прошедшие годы антибиотики-гликозиды стали широко использоваться в химиотерапии рака. Большое значение в группе противоопухолевых агентов имеют антрациклиновые антибиотики, блеомицетин, опивомицин, нашедшие широкое применение в онкологической медицинской практике [1]. Антрациклины, как и другие цитотоксические препараты, наряду с ценными свойствами имеют ряд недостатков, основным из которых является высокая токсичность, прежде всего кардиотоксичность. Кроме того, антрациклиновые антибиотики имеют сравнительно низкий терапевтический индекс, обладают высокой кумулятивной токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью, миело- и иммунодепрессивным действием. Другой важной проблемой является возникновение устойчивости опухолевых клеток к применяемым препаратам, в том числе по механизму множественной лекарственной устойчивости. Помимо этого, ряд опухолей, например карцинома кишечника, простаты и немелкоклеточный рак легкого, изначально не чувствительны к антрациклиновым антибиотикам. Особого внимания заслуживает оригинальный отечественный антибиотик антрациклиновой группы - карминомицин, который был открыт в НИИ по изысканию новых антибиотиков АМН СССР. Карминомицин был внедрен в практику отечественного здравоохранения для лечения сарком мягких тканей, острых лейкозов и некоторых других форм злокачественных опухолей. Карминомицин отличается от других антрациклинов меньшей кардиотоксичностью, способностью тормозить рост опухолей, устойчивых к доксорубицину, хорошей всасываемостью через желудочно-кишечный тракт. В начале 90-х годов по ряду экономических причин производство карминомицина было прекращено. Возобновление производства карминомицина, ценного для практической медицины средства, а также поиск препаратов из группы антрациклинов с улучшенными химиотерапевтическими свойствами, активных в отношении опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью, является актуальной задачей биоорганической и медицинской химии.
Целью настоящей работы являлась разработка методов синтеза и получение новых производных антрациклиновых антибиотиков, обладающих преимуществами перед исходными антибиотиками. Были поставлены задачи: разработать метод препаративного получения карминомицина исходя из даунорубицина, разработать методы синтеза различных производных антрациклиновых антибиотиков, модифицированных по З'-аминогруппе остатка даунозамина, а также изучить протовоопухолевую активность полученных соединений.
Про-лекарства, использующие разниц в значении рН между нормальными и опухолевыми клетками
Создание про-лекарств на основе антрациклинов (главным образом, на основе наиболее широко используемых в клинике доксорубицина и даунорубицина) направлено на повышение специфичности воздействия противоопухолевого агента (повышение селективности в отношении опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками) при одновременном снижении токсичности. С этой целью были получены про-лекарства, использующие такие специфические особенности опухолевых клеток, как пониженное значение рН, низкий уровень оксигенации опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками, наличие повышенного уровня определенных ферментов. Были также созданы про-лекарства, являющиеся частью двухступенчатой направленной терапии фермент - про-лекарство (DEPT). Про-лекарства, использующие разницу е значении рН между нормальными и опухолевыми клетками При нормальных физиологических условиях значение рН плазмы и тканей поддерживается несколько выше нейтрального. Во многих опухолях наблюдается локальное понижение значения рН на 0.7-1.0, связанное с гиперметаболической активностью и гипоксическим состоянием опухолевых клеток. Эта разница в значениях рН между нормальными и опухолевыми клетками была использована для создания более избирательных про-лекарств на основе даунорубицина (11) и доксорубицина (12) (Рис. 2). Про-лекарство на основе даунорубицина (11) было синтезировано Eillat and Arad-Yellin [17]. Это соединение устойчиво при значении рН 7.2, в диапазоне значений рН 4.0-7.0 подвергается циклизации, образуя 6-тичленный лактон и свободный даунорубицин. Противоопухолевая активность этого соединения при значении рН 6.0 в экспериментах ш vitro сравнима с активностью даунорубицина. Другой подход был выбран компанией Eli Lilly для создания про-лекарства на основе доксорубицина (12) [18]. Для синтеза про-лекарств, а также конъюгатов с антителами были использованы тритильные производные, лабильные при слабо кислых значениях рН. Стабильность тритильной связи можно контролировать, варьируя радикалы R в бензольных кольцах. Предпочтительным оказался вариант cR H или ОСНз. Время полураспада производного (12) при значении рН 7.4 составляло 150-180 часов, при значении рН 5.4 - 3,5 -17 часов. Про-лекарстеа, действующие на опухолевые клетки в состоянии гипоксии Во многих солидных опухолях есть участки с пониженной оксигенацией вследствии недостаточного развития сосудов микроциркуляторного русла.
Явление гипоксии в тканях опухоли создает серьезные проблемы для лечения раковых заболеваний, поскольку опухолевые клетки в отсутствие кислорода становятся более устончивьши к воздействию облучения и цитостатиков, Недостаточное кровоснабжение опухолевых клеток приводит не только к недостатку кислорода, но и к нехватке питательных веществ, что тормозит их пролиферацию. Поскольку большинство противоопухолевых препаратов наиболее эффективны в отношении быстро пролиферирующих клеток, на опухолевые клетки в состоянии гипоксии цитостатики действуют значительно слабее, чем на обеспеченные кислородом опухолевые клетки [19]. С другой стороны, низкий уровень оксигенации опухолевых клеток может быть использован в качестве мишени для создания про-лекарств. Компания Bristol-Myers Squibb разработала серию про-лекарств, нацеленных на опухолевые клетки в состоянии гипоксии [20]. Примером может служить дисульфид бензилкарбамата даунорубицина (13) (Рис.3). В экспериментах было показано, что в условиях гипоксии происходит расщепление (восстановление) дисульфидной связи в молекуле 13 и дальнейшая фрагментация молекулы с выделением свободного даунорубицина. Другим примером про-лекарства, активируемого в условиях недостатка кислорода, может служить соединение 14 (Схема 2). В условиях гипоксии может протекать восстановление ароматической нитрогруппы до аминогруппы, после чего самопроизвольно протекает 1,6-элиминирование карбомоильного фрагмента с выделением свободного до ксорубицина (Схема 2) [21]. Схема 2. Активация про-лекарства 14, протекающая в условиях гипоксии. В начале 90-х годов было установлено, что in vitro комплексы ДНК с антрациклиновыми антибиотиками в присутствии формалина претерпевают существенные изменения. В этих условиях взаимодействие антрациклинов с ДНК не ограничивается образованием комплекса ДНК — антибиотик за счет интеркаляции, а образуется сшивка между З -аминогруппой антрациклина и 4-аминогруппой 2 -дезоксигуанозина.
Открытие нового механизма алкилирования ДНК антрациклиновыми антибиотиками привело к созданию нового поколения антрациклиновых препаратов. Были получены димерные оксазолидиновые конъюгаты даунорубицина (15) (дауноформ), доксорубицина (16) (доксоформ) и эпирубицина (17) (эпидоксоформ) с формальдегидом, способные распадаться на исходные антибиотики и формальдегид (Схема 3) [22-25]. Производные 15-17 обладали значительно большей цитотоксичностью в отношении клеток рака молочной железы MCF-7, чем исходные антибиотики. Более того, было показано, что дауноформ (15), доксоформ (16) и эпидоксоформ (17) активны в отношении раковых клеток, устойчивых к доксорубицину (их цитотоксичность в отношении клеток MCF-7/Dox в 200,10000 и 120 раз выше активности даунорубицина (1), доксорубицина (2) и эпирубицина (4) соответственно) [22, 23]. Однако серьезными недостатками производных 15-17 являются крайне низкая растворимость в воде и высокая скорость гидролиза при физиологических условиях (время полураспада -10 минут). Кроме того, эксперименты in vivo показали, что доксоформ (16) обладает большей токсичностью по сравнению с доксорубицином [26]. В связи с этим исследовались другие подходы, направленные на активацию антрациклиновых антибиотиков формальдегидом. Например, изучалась возможность совместного применения даунорубицина, доксорубицина или идарубицина и гексаметилентетрамина [27]. Гексаметилентетрамин (уротропин) в кислой среде гидролизуется с образованием аммиака и б молекул формальдегида. Было показано, что при значении рН 6.4 in vitro при совместном применении уротропина и антрациклиновых антибиотиков происходит увеличение цитотоксичности антрациклинов и наблюдается значительное увеличение способности антрациклинов образовывать устойчивые аддукты с ДНК. Авторы предполагают, что применение гексаметилентетрамина в качестве про-лекарства, генерирующего формальдегид, совместно с антрациклиновыми антибиотиками является перспективным для лечения ряда солидный опухолей, обладающих более низким значением рН, чем нормальные ткани. Кроме того, использование формальдегида (например, в форме про-лекарства) для активации антрациклинового антибиотика, возможно, позволит снизить дозу цитостатика, что приведет к снижению общей токсичности. Данные об эффективности комбинации антрациклиновых антибиотиков с гексаметилентеграмином в экспериментах in vivo не опубликованы. Вторым поколением конъюгатов антрациклиновых антибиотиков с формальдегидом являются конъюгаты, в которых формальдегид в скрытой форме присутствует в виде основания Манниха, связывающего молекулу антрациклина с, например, салициламидом (18) или формилсалициламидом (19) (Схема 4) [26]. Схема 4. Активация доксалиформа (18) и доксо-5-формилсалиформа (19).
Стратегия фермент - про-лекарство
Для селективной активации про-лекарств в опухолевых клетках разработаны методы так называемой терапии фермент - про-лекарство [36]. Основная идея этих подходов такова: на первом этапе в опухолевые клетки селективно внедряется определенный фермент, на втором - вводится нетоксичное про-лекарство, являющееся субстратом для внедренного фермента. Про-лекарство селективно превращается в активный препарат, при этом достигается высокая локальная концентрация препарата внутри опухоли. Для того чтобы эта стратегия работала эффективно необходимо выполнение следующих критериев: (1) фермент, активирующий про-лекарство должен быть либо чужеродного для человека происхождения, либо отсутствовать или экспрессироваться лишь на очень невысоком уровне в нормальных тканях; (2) фермент должен экспрессироваться в опухолевых клетках на высоком уровне и иметь высокую каталитическую активность; (3) про-лекарство должно быть хорошим субстратом для внедренного фермента и не должно активироваться эндогенными ферментами в нормальных тканях; (4) про-лекарство должно хорошо проникать через клеточную мембрану для активации внутри клетки; (5) разница в цитотоксичности между про-лекарством и активным препаратом должна быть максимальной; (б) активный препарат должен хорошо проникать в соседние опухолевые клетки, не экспрессирующие фермент, для того чтобы обеспечивался так называемый bystand killing effect, эффект убийства соседа; (7) период полураспада активного препарата в организме должен быть оптимальным, для того чтобы проявился bystand killing effect и не началось повреждение нормальных тканей. Методы доставки ферментов к опухолевым клеткам могут быть разделены на два типа: доставка фермента с помощью антитела (antibody-directed enzyme prodrug therapy, ADEPT) и доставка в опухолевую клетку генов, кодирующих нужный фермент с помощью вирусов (virus-directed enzyme prodrug therapy, VDEPT) или методами физической трансформации опухолевых клеток (gene-directed enzyme prodrug therapy, GDEPT)(PHC. 10). Первый шаг стратегии ADEPT (antibody-directed enzyme prodrug therapy) заключается во введении в организм фермента, присоединенного к моноклональным антителам, специфичным к определенной опухоли. Моноклональные антитела обеспечивают адресную доставку фермента к опухоли.
На втором этапе происходит введение нетоксичного про-лекарства, которое под воздействием доставленного антителами фермента селективно расщепляется до активного цитостатика. Таким образом, реализуется главное преимущество применения стратегии ADEPT -достигается высокая локальная концентрация лекарства в опухолевых тканях. При использовании ADEPT терапии в клинике необходимо учитывать несколько важных факторов. Необходимо подобрать оптимальный интервал между введением про-лекарства и фермента, связанного с антителом, чтобы обеспечить клиренс не связавшихся с опухолевыми мишенями конъюгатов фермент+антитело и избежать проявлений общей токсичности. Специфический опухолевый антиген должен быть либо экспрессирован на мембране опухолевых клеток, либо находится в межклеточном пространстве опухолевых клеток. Антитела, используемые против этого антигена, должны обладать к нему высоким сродством (аффинностью). Используемый для расщепления про-лекарства фермент должен иметь высокую активность при значении рН среды, близком к значению рН, наблюдаемом в межклеточном пространстве в опухоли. Необходимо учитывать возможность возникновения иммунного ответа на введение конъюгата фермента с антителом. Для того чтобы исключить возможность активации про-лекарства вне опухоли используемый фермент в идеале должен быть чужеродного для человека происхождения и не иметь гомологии с каким-либо из ферментов человека [36]. Поскольку на поверхности опухолевых клеток и в межклеточном пространстве раковых опухолей обнаружено и охарактеризовано достаточное количество специфических антигенов, фактором, определяющим эффективность ADEPT терапии, является выбор подходящего про-лекарства и фермента для его активации. р-Лактамаза Бактериальный фермент р-лактамаза, вырабатываемый микроорганизмами, резистентными к р-лактамным антибиотикам, обладает высокой селективностью и относительно доступен. Были получены серии конъюгатов доксорубицина с различными цефалоспоринами, предназначенные для активации р-лактамазой (Рис. 11, (32)-(37)) [37, 38]. Наибольший интерес, по мнению авторов, представляет соединение 33, обладающее цитотоксичностью в 10 раз меньшей, чем у доксорубицина. Это производное активно изучалось in vivo, и в ряде экспериментов было показано преимущество комбинации про-лекарства 33 в сочетании с конъюгатом р-лактамазы с антителом, перед терапией доксорубицином, например, для лечения опухолей кишечника [19,38]. Р-Глюкуронидаза В отличие от большинства ферментов, использование которых предложено для AGEPT стратегий, р-глюкуронидаза является ферментом человека, локализованным внутри клеток и не присутствующем в плазме. Вытекающим отсюда преимуществом является отсутствие иммунного ответа на введение р-глюкуронидазы [19]. Для активацией В-глюкуронидазой синтезированы различные конъюгаты антрациклинов с глюкуроновой кислотой, например, производные 38-40 (Рис. 12) [19,21, 39-41].
Производные 38-40 обладали сниженной цитотоксичностью по сравнению с доксорубицином в отношении опухолевых клеток OVCAR-3, однако с разной скоростью гидролизовались р-глюкуронидазой. Среди про-лекарств 38-40 только производное, доксорубицина 39, в котором остаток глюкуроновои кислоты был присоединен через само-элиминирующийся бензилоксикарбонильный спейсер, с заметной скоростью гидролизовалось под действием фермента р-глгокуронидазы с выделением свободного доксорубицина (отщепление бензилоксикарбонильного спейсера после гидролиза р-глюкуроновоЙ кислоты протекает по схеме 2) [21]. Были изучены также производные, содержащие в ароматическом кольце другие заместители вместо нитрогруппы (F, С1, М(СНз)г, NHCOCH3, NHCOCF3), однако, производное 39 оказалось наиболее перспективным в этой серии соединений. Были получены также производные даунорубицина и доксорубицина, в которых остаток глюкуроновои кислоты был присоединен к ароматическому спейсеру карбаматной связью 41-48 (Рис. 13) [21]. Про-лекарства 41-47 значительно быстрее гидролизовались р-глюкуронидазой, по сравнению с про-лекарством 48. Введение заместителей в ароматическое кольцо (О, Вг) практически не влияло на скорость гидролиза про-лекарства ферментом и скорость элиминирования спейсера. Для дальнейших изучений были выбраны про-лекарство на основе даунорубицииа 41 и на основе доксорубицина 47 [21]. Они были протестированы для использования в качестве составной части ADEPT терапии в экспериментах in vitro и in vivo [39-43]. Было показано, что про-лекарства такого строения (41, 47) обладают гораздо меньшей цитотоксичностью, по сравнению с доксорубицином. В присутствии р-глюкуронидазы, свободной или в виде конъюгата с моноклональным антителом, соединения 41, 47 эффективно гидролизуются с образованием свободных родительских антибиотиков (даунорубицина (1) или доксорубицина (2) соответственно). В экспериментах in vivo было продемонстрировано преимущество терапии ADEPT с использованием р-глюкуронидазы и соответствующих про-лекарств на основе доксорубицина перед монотерапией доксорубицином [43]. Другим подходом при дизайне про-лекарств, активируемых р-глюкуронидазой, является получение производных антрациклиновых антибиотиков, в которых остаток глюкуроновой кислоты присоединен к 3 -аминогруппе даунозамина через алкильный спейсер (49), который после отщепления остатка р-глюкуроновой кислоты подвергается циклизация, образуя высоко токсичное производное антрациклинового антибиотика (50) (Схема б) [19]. Было показано, что производное 50 обладает в 10000 раз большей цитотоксичностью по сравнению с про-лекарством 49.
Рецепторы к гормонам
Для того чтобы повысить терапевтический индекс антрациклиновых антибиотиков, могут использоваться конъюгаты антрациклинов с пептидами, распознающими рецепторы к различным гормонам. Такие пептиды были присоединены к 14-гидроксигруппе доксорубицина и 3 -дезамино-3 -(2-пирролино)доксорубицина через спейсер - дикарбоновую кислоту (Рис.16). Были получены конъюгаты доксорубицина и 3 -дезамино-3 -(2-пирролино)доксорубицина с пептидными аналогами гормона, инициирующего выделение лютеинизирующего гормона (LH-RH) (соединения 55 и 56 соответственно), бомбесина (57 и 58 соответственно) и соматостатина (59 и 60 соответственно) [9, 19], Полученные производные 55-60 были достаточно : стабильны, обладали достаточно высокой антипролиферативной активностью и сохраняли способность связываться с соответствующими рецепторами. Конъюгаты, содержащие LH-RH пептид 55, 56, в эквимолярных концентрациях были более эффективны, чем родительские антибиотики (доксорубицин и З -дезамино-3 -(2-пирролино)доксорубицин) в экспериментах in vivo [19]. Конъюгаты, содержащие аналог бомбесина 57, 58, также показали хорошие результаты при лечении мышей с мелкоклеточным раком легкого. При более низкой токсичности производные 57, 58 по своей эффективности в эквимолярных концентрациях превосходили родительские антибиотики (доксорубицин и 3 -дезамино-3 -(2-пирролино)доксорубицин) [19]. Эффективность лечения раковых опухолей конъюгатами, содержащими аналог соматостатина 59, 60, была достигнута только для тех видов опухолей (например, глиобластомы), клетки которых экспрессируют рецепторы к соматостатину. [9]. Несмотря на многообещающие данные об эффективности производных 55-60 в экспериментах in vivo, хотелось бы отметить два потенциальных недостатка этих конъюгатов: во-первых, эти производные обладают высокой цитотоксичностьго, что может привести к повреждению нормальных клеток до того момента, когда эти конъюгаты свяжутся с соответствующими рецепторами, а во-вторых, эфирная связь в 14-положении антрациклина способна расщепляться под действием неспецифических карбоксиэстераз [48]. Конъюгаты антрациклинов с макромолекулами Одним из перспективных направлений модификации антрациклиновых антибиотиков является создание конъюгатов с различными макромолекулами.
В этом случае фармакокинетические характеристики конъюгатов изменяются коренным образом, поскольку абсорбция и распределение препарата в организме определяются уже физико-химическими свойствами макромолекулы, а не цитостатика. Этот подход может быть эффективен для направленной доставки препарата (в частности антрациклинов) и улучшения терапевтического индекса. Определенным недостатком использования макромолекул в качестве "переносчиков" для лекарственных препаратов, является то, что, при парентеральном введении возможно возникновение иммунного ответа, а при введении per os макромолекулы, как правило, не усваиваются. Обычно полимеры не способны проникать через клеточные мембраны, однако, они могут попадать внутрь клетки путем эндоцитоза, оказываясь, в конечном счете, в лизосомах. Поскольку считается, что деградация белков и других макромолекул происходит именно в лизосомах, то, таким образом, возможно расщепление конъюгата лекарственного вещества и полимера с высвобождением активного препарата. Помимо этого, есть данные о том, что кровеносные сосуды в опухолевых тканях обладают повышенной проницаемостью для макромолекул. Это, наряду с характерным для многих опухолей недостаточным лимфодренажом, приводит к тому, что до 10% введенных внутривенно макромолекул накапливаются именно в опухолевых тканях [49]. Приведенные выше доводы обусловили значительный интерес к созданию конъюгатов антрациклиновых антибиотиков с различными макромолекулами, в том числе синтетическими полимерами [9, 50-52], гормонами [53], факторами роста [54], альбумином [55], полисахаридами [56], антителами [57,58], иммуноглобулинами [59]. Коньгаты антраииклиновых антибиотиков с поли-[Ы-(2-гидроксипропил)-метилакриламидом) J Одним из самых удачных примеров использования синтетических полимеров для доставки антрациклинов в опухолевые ткани является конъюгат доксорубицина с поли-[М-(2-гидроксипропил)метилакриламидом)] (НМРА) (61) (Рис. 17) [9]. Доксорубицин через З -аминогруппу присоединен к олигопептидному спенсеру, который в свою очередь присоединен к НМРА. В конъюгате 61 содержится порядка 8.5 % (весовых) доксорубицина, молекулярная масса составляет приблизительно 24000 Да. Было показано, что конъюгат 61 накапливается в опухолевых тканях, и после протеолитического гидролиза пептидного спейсера происходит выделение свободного доксорубицина. В экспериментах in vivo конъюгат 61 оказался высоко активным в отношении ряда опухолевых линий, особенно солидных опухолей, при этом наблюдалось заметное снижение общей токсичности. Следует отметить, что конъюгат доксорубицина с НМРА 61 был активен при лечении мышей с MDR-резистентными опухолями [9]. Изучение фармакокинетических характеристик полимера 61 показало, что после его введения внутривенно, уровень доксорубицина в плазме находится на невысоком, но постоянном уровне, в то время как после внутривенного введения доксорубицина в плазме наблюдается резкое повышение концентрации доксорубицина с последующим быстрым ее падением [9]. Конъюгат 61 в настоящее время проходит первую фазу клинических испытаний. Описаны также различные модификации конъюгатов доксорубицина с НМРА. Например, изучались возможности присоединения доксорубицина к полимеру через другие пептидные спейсеры, в том числе присоединенные не к З -аминогруппе, а к 13-кетогруппе доксорубицина в виде гидразона [50].
Было показано, что конъюгаты, в которых доксорубицин присоединен через кислото-лабильную связь (гидразон по 13-кето-группе), обладают значительно большей цитотоксичностью по сравнению с конъюгатами, в которых доксорубицин присоединен к полимеру через протеолитически деградирующую связь. Для того чтобы повысить селективность накапливания конъюгата 61 в опухолевых тканях, в него дополнительно вводили различные био-распознаваемые группы, например, углеводные остатки или антитела [51, 52]. Было показано, что при введении в конъюгат 61 остатков моно-, ди- и трисахаридов (галактозамина, лактозы и /мры-Gal, соответственно), полученный конъюгат обладал значительно более высокой цитотоксичностью по сравнению с негликозилированным конъюгатом 61 в отношении клеток различных линий аденокарциномы человека (Colo-205, SW-480 и SW-620). Авторы объясняют это лучшим распознаванием гликозилированного конъюгата опухолевыми клетками и его проникновение внутрь клеток посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза [51]. Предполагается также, что за распознавание конъюгата доксорубицина с НМРА, несущим на себе дополнительные углеводные фрагменты, ответственны рецепторы типа галектинов, а также другие рецепторы, роль которых пока не установлена. Введение в конъюгат доксорубицина с НМРА (61) моноклональных антител, нацеленных на определенные эпитопы на поверхности опухолевых клеток, повысило эффективность лечения мышей с лимфомой EL4, по сравнению с "ненацеленным" конъюгатом 61 [52]. Конъюгат 61 испытывался также как часть двухступенчатой стратегии "фермент-про-лекарство". Пептидный спейсер Gly-Phe-Leu-Gly является субстратом для катепсина В. Были изучены различные возможности селективной доставки катепсина В в опухолевые клетки, в том числе, в виде конъюгата с антителами (ADEPT) или полимерами (PDEPT). В последнем случае катепсин В через пептидный спейсер Gly-Gly был присоединен к НМРА. Иммобилизованный катепсин В сохранял способность гидролизовать пептидный спейсер в конъюгате 61, однако его активность была значительно ниже, чем у свободного фермента. Комбинация иммобилизованного на полимере катепсина В и конъюгата 61 была изучена в экспериментах in vivo на мышах с меланомой B16F10. Было показано, что концентрация свободного доксорубицина в опухолевых тканях выше в случае введения 61 совместно с иммобилизованным катепсином В. В целом же повышение эффективности лечения мышей комбинацией иммобилизованного катепсина В и конъюгата 61 было крайне незначительным по сравнению с моиотерапией конъюгатом 61 [19].
Получение новых производных антрациклиновых антибиотиков з'-n- алкильноготипа
Синтез полусинтетических аналогов антрациклиновых антибиотиков имеет целью получение производных, которые были бы активны в отношении резистентных опухолевых клеток, обладали меньшей токсичностью и более широким спектром противоопухолевого действия. Одним из перспективных направлений химической модификации антрациклинов является получение производных З -М-алкильного типа. Целью работы было введение по 3 -аминогруппе остатка даунозамина гидрофильных полигидроксилированных фрагментов, например, остатков глицеринового альдегида или моносахарида. Особый интерес представляло получение производных карминомицина, поскольку ранее было показано, что карминомицин и его производные, в том числе 14-гидроксикарминомицин, активны в отношении резистентных опухолевых клеток линий рака молочной железы MCF7-Dox, и лейкоза Р388 [81]. Ранее было показано, что 4-деметил аналог доксорубицина, 14-гидроксикарминомицин, обладает высокой противоопухолевой активностью, однако, более детальное изучение этого производного было затруднено из-за его крайне низкой растворимости в воде. Поэтому, введение в молекулу 14-гидроксикарминомицина остатков глицеринового альдегида, моно- или дисахаридов было также направлено на повышение растворимости в воде этого соединения. Реакция карминомицина (11) с небольшим избытком DL-глицеринового альдегида (2 мольных эквивалента) в присутствии NaBtbCN приводила к образованию производного 13-(К,8)-дигидрокарминомицина - 3 -N-(2", 3"-дигидроксипропил)-13-(1 8)-дигидрокарминомицину (21) (Схема 5) ( Н ЯМР-спектр соединения 21, полученыи с использованием метода COSY, представлен в Приложении 8).Для того чтобы избежать восстановления 13-кетогруппы антибиотика в качестве исходных соединений были использованы 13-диметилкеталь-14-бромодаунорубицина (22) и 13-диметилкеталь-14-бромокарминомицина (23), полученные соответственно из даунорубицина (1) или карминомицина (11) описанным методом [82, 83]. Соединения 22 или 23 вводили в реакцию восстановительного алкилирования с DL-глицериновым альдегидом (Схема 6).
В результате гидролиза промежуточных алкилированных 13-диметилкеталей-14-бромодаунорубицина (24а) или 13-диметилкеталя-14-бромокарминомицина(25а) после хроматографической очистки на силанизированном силикагеле были получены соответствующие производные доксорубицина (24) или 14-гидроксикарминомицина (25) в виде смеси трех изомеров (Схема 6), Тот факт, что основными продуктами реакции восстановительного алкилирования были соответствующие диалкильные производные доксорубицина (24) и 14-гидроксикарминомицина (25) может быть объяснен, тем, что в реакции восстановительного алкилирования диметилкеталей 22 и 23 использовали большие избытки глицеринового альдегида, чем в случае восстановительного алкилирования карминомицина. 3.2 Восстановительное алкилирование антрациклиновых антибиотиков моносахаридами Аналогично случаю с глицериновым альдегидом, первоначально была проведена попытка прямого алкилирования антрациклинового антибиотика моносахаридами -альдозами. Как ив случае с глицериновым альдегидом, реакция даун орубицина (1) с моносахаридами (D-глюкозой и D-галактозой) в присутствии NaBI CN приводила к производным 13-(11,8)-дигидродаунорубицина. 3 -(1-Дезокси-0-глюцит-1 -M)-13-(R,S)- дигидродаунорубицин (26) и 3 -(1-дезокси-В-галактит-1-ил)-13-(11,3)- дигидродаунорубицин (27) были получены с выходом —20% (Схема 7). Для того чтобы избежать восстановления 13-кето-группы антибиотика в качестве исходных соединений бьши использованы ІЗ-диметилкеталь-14-бромодаунорубицина (23) и 13-диметилкеталь-14-бромокарминомицина (24), полученные соответственно из даунорубицина (1) или карминомицина (11) описанным методом [82, 83] (Схема 8). Соединения 22 или 23 вводили в реакцию восстановительного алкилирования с моносахаридами D-глюкозой и D-галактозой. После гидролиза промежуточных алкилиро ванных 13-диметилкеталей-14-бромодаунорубицина (28а, 29а) и 13-диметилкеталя-14-бромокарминомицина (30а) и хромато графической очистке на силанизированном силикагеле были получены соответствующие производные доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина: 3 -Ы-(1-дезокси-В-глюцит-1-ил)доксорубицин (28), 3 -М-(1-дезокси-Б-галактит-1-ил)доксорубицин (29) и 3 -N-(l-дезокси-В-галактит-1 -ил)-14-гидроксикарминомицин (30) (Схема 8). Интересно отметить, что в случае использования моносахаридов в реакции восстановительного алкилирования бьши получены соответствующие моноалкильные производные 28-30, в то же время алкилирование DL-глицериновым альдегидом в аналогичных условиях приводило к соответствующим диалкильным производным 24, 25. Вероятно, это можно объяснить большей активностью альдегидной группы в DL-глицериновом альдегиде по сравнению с альдегидной группой в моносахаридах -глюкозе и галактозе или меньшим объемом вводимого заместителя в случае DL-глицеринового альдегида. 3.3 Синтез конъюгатов антрациклиновых антибиотиков с D-галактозой Одним из перспективных направлений химической модификации антрациклинов является получение конъюгатов с различными углеводами. Были получены различные серии дисахаридных аналогов антрациклиновых антибиотиков, среди которых некоторые соединения, например, упоминавшийся в литературном обзоре MEN 10755 (стр. 14), обладали преимуществами перед родительскими антибиотиками.
Одной из задач нашей работы был синтез конъюгатов доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина, содержащих остаток D-галактозы, поскольку имеются литературные данные о наличии на опухолевых клетках галектинов - рецепторов к D-галактозе [84-86]. Это позволяет рассчитывать на повышение избирательности противоопухолевого действия антрациклиновых препаратов, содержащих остаток D-галактозы. Для синтеза конъюгатов доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина с D-галактозой, в которых остаток D-галактозы был присоединен к З -аминогруппе даунозамина через гидрофильный полигидроксилировшшый спейсер, была использована реакция восстановительного алкилирования 13-диметилкеталя-14-бромодаунорубицина (22) и 13-диметилкеталя-14-бромокарминомицина (23) дисахаридами, содержащими остаток D-галактозы - мелибиозой (31) и лактозой (32) (Схема 9). После гидролиза промежуточных алкилированных 13-диметилкеталей-14-бромодаунорубицина (33а, 35а) и 13-диметилкеталя-14-бромокарминомицина (34а) были получены соответствующие производные доксорубицина и 14-гидроксикарминомицина: 3 -г\Г-(-а-0-галактопиранозил-(1— 6)-0-І-дезокси-D-nnoцит-1 -ил)доксорубицин (33), 3 -К-(-а-0-галактопиранозил-( 1-+6)-0-1 -дезокси-Б-глюцит-1 -ил)-14-гидроксикарминомицин (34) и 3 -К-(-Р-0-галактопиранозил-(1— -О-І-дезокси-О-глюцит-І-ил оксорубицин (35) (Схема 9). В соединениях 33, 34 остаток D-галактозы имел ожонфигурацию аномерного центра, в соединении 35 - р-конфигурацию. В производном 35 полигидроксилированный спейсер, через который остаток D-галактозы был присоединен к З -аминогруппе даунозамина был разветвленным и более коротким (D-галактоза присоединена к 4-му атому углерода в спейсере), чем в соединениях 33,34 (D-галактоза присоединена к 6-му атому углерода в спейсере) (фрагмент 1Н ЯМР спектра соединения 34, получений с использованием метода COSY, представлен в Приложении 9).
Были получены также конъюгаты доксорубицина с D-галактозой, в которых остаток D-галактозы был присоединен к З -аминогруппе даунозамина через гидрофобный ароматический спейсер. Первой стадией синтеза этих конъюгатов было получение 3-метокси-4-0-[(2,3,4,б-тетра-0-ацетил-р-0-галактопиранозил)окси]бензальдегида (39) и 4-0-[(2,3,4,6-тетра-0-ацетил-р-0-галактопиранозил)окси]бензальдегида (40). Эти соединения были получены реакцией тетра-О-ацетил-ос-О-галактопиранозилбромида (38) с ванилином (36) или 4-гидроксибензальдегидом (37) соответственно (Схема 10).
