Введение к работе
Актуальность проблемы. Еще совсем недавно фосфолипиды рассматривали как структурные компоненты биологических мембран, обеспечивающие последним барьерную функцию в отношении электролитов и служащие матриксом для мембрано-связанных ферментов и рецепторов. Однако исследования последних 20 лет свидетельствуют о том, что фосфолипиды и продукты их ферментативных и свободнорадикалышх превращений, кроме структурной, выполняют важнейшие регуляторные функции в клетке. В качестве иллюстрации к вышесказанному могут служить следующие примеры:
а) фосфолипиды и их производные необходимы для проявления
каталитической активности многих ферментов;
б) реакции гидролиза фосфоинозитидов и метилирования фосфатидил-
этаноламина являются ключевыми в процессе передачи внешнего сигнала на
"внутренний язык" клетки;
в) некоторые фосфолипиды и продукты их метаболизма обладают
гормоноподобной активностью и активностью факторов роста. К таким
соединениям в первую очередь следует отнести эйкозановды (простагландшш,
лейкотриены и липоксины), фактор активации тромбоцитов (1-алкил-2-ацетил-
.ул-глицеро-3-фосфохолин), фактор заживления ран (лизофосфатидная
кислота), гормон сна (амид олеиновой кислоты), эндогенные лиганды
каїшабиноидньгх рецепторов (этаноламид арахддоновой кислоты и 2-
арахидоноил-ли-глицерин) и церамиды.
Установление путей образования липидных биорегуляторов и механизмов их действия может стать основой создания эффективных лекарств нового поколения. Однако, несмотря на заметный прогресс в выяснении биологической роли фосфолипидов и продуктов их ферментативных и свободнорадикальных превращений, исследования в этом направлении далеки от своего завершения. В последнее время эффекторные свойства фосфолипидов и их производных начали интенсивно изучаться, а в начале выполнения работы (1978 г.) по этой проблеме были опубликованы лишь единичные сообщения.
Связь работы с научными программами. Изучение свойств фосфолипидов и их производных представляет одно из направлений исследований, проводимых в Институте биоорганической химии НАН Беларуси. Работа выполнялась в соответствии с плановыми темами института "Биофизическое исследование белок-белковых и липид-белковых комплексов и влияние на их структуру и свойства низкомолекулярных физиологически активных соединений" (1983-1985, N гос. регистрации 01811006577) и
"Исследовать липид-белковые взаимодействия в модельных мембраыа> содержащих мембранные белки (цитохром Р-450 и др.) и природные : модифицированные липиды с целью выяснения роли липидов и и метаболитов как биорегуляторов, эффекторов и медиаторов мембранны процессов" (1986-1990, N гос. регистрации 01860068359) в рамка: Общесоюзной научно-технической программы 0.74.05, "Изучени молекулярных механизмов действия лизофосфолипидов, жирных кислот и и производных на организацию, конформациошгую динамику и функциональны свойства гемоглобина и других гем-содержащих белков" (1991-1995, N гос регистрации 19941432) в рамках Программы фундаментальных исследованш НАН Беларуси по разделу "Биоорганическая химия", "Изучени биохимических, мембрано-активных и токсических свойств фосфатидил этанола - компонента клеточных мембран животных, находящихся н алкогольной диете" (1991-1995, N гос. регистрации 19941433) в рамка: Республиканской комплексной программы фундаментальных исследованиі "Метаболический гомеостаз". Автор диссертации являлся соруководителег всех указанных тем.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследовали являлось исследование эффекторного действия фосфолшшдов и не производных - продуктов ферментативных и свободнорадикальны превращений - на функциональную активность жизненно важных белков цитохрома Р-450, гемоглобина, фосфолипазы А2 и перорально введеннол инсулина. Для достижения поставленной цели были определены следующ» основные задачи:
-
Разработать методы выделения и очистки хроматографичесю индивидуальных фосфолшшдов из природных источников и реакционны: сред.
-
Разработать химические и ферментативные методы получение фосфолипидов и их производных с заданными свойствами.
3. Изучить эффекторные свойства фосфолипидов и их производных J
отношении реакции окисления ароматических субстратов гидроперекисьн
кумола при участии фенобарбитал-индуцированного цитохрома Р-45(
микросом печени кролика (форма LM2); исследовать влияние физической
состояния окружающих цитохром Р-450 фосфолипидов на конформациошгук
подвижность и функциональную активность гемопротеина.
-
Выяснить роль фосфолипидов и их производных в процесс! автоокисления гемоглобина.
-
Исследовать влияние продуктов свободнорадикальной деструкцш сфингомиелина и их синтетических аналогов на активность фосфолипазы А2.
6. Исследовать свойства фосфатидилэтанола и изучить возможность его іспользования при разработке липосомальной формы инсулина для іерорального введения.
Научная новизна полученных результатов. Разработаны новые методы іьістрого выделения фосфолипидов и их производных из биологических :каней и реакционных сред с помощью однофазной экстракции и флэш-хроматографии. С помощью химической модификации впервые получены и характеризованы производные фосфатидилэтаноламина - 1М-[2,4-динитро-5-2-аминоэтил)аминофенилфосфатидилэтаноламин и ЇЧ-(З-карбокси-пропионил) |)осфатидилэтаноламин. Впервые получены и использованы в флуоресцентных ісследованиях 1 -ацил-2-[4-( 1 -пйреішл)]бутироил-і«-глицеро-3-фосфохолин и -ацил-2-[4-( 1 -пиреішл)]бутироил-^«-глицеро-3-фосфоглицерин. Выявлены пгруктурные требования к субстрату при получении фосфолипидов с помощью росфолипазы D.
Совместно с сотрудниками Белгосуниверситета обнаружен новый путь явободнорадикальной фрагментации липидов, ключевой реакцией которого [вляется распад возникающих радикалов в гидрофильной части липидов, содержащих гвдроксильную группу в р-положеіши к сложноэфирной фосфоэфирной) или амидной связи. В результате такой фрагментации из росфатидилглицерина образуется фосфатидная кислота и оксиацетон, а фингомиелин распадается с образованием амидов жирных кислот.
Установлено, что лизофосфатидилхолин при низких концентрациях, а яионные фосфолипиды в широком диапазоне концентраций повышают :аталитическую активность цитохрома Р-450 (ЬМ2-форма) при окислении роматических субстратов гидроперекисью кумола. В формировании іктивного комплекса цитохрома Р-450 важное место принадлежит лектростатическим и гидрофобным силам. Обнаружена температурная стабилизация липидного бислоя при встраивании щггохрома Р-450 в липосомы, содержащие аішонньїе фосфолипиды. Получены новые данные о влиянии разового перехода "гель-жидкий кристалл" на конформационную подвижность щтохрома Р-450 и реакцию восстановления гемопротеина редуктазой. $первые в мембране микросом обнаружены низкоэнергетические фазовые сереходы, вызванные ионами магния.
Впервые найдены эффекторы автоокисления гемоглобина эндогенного фоисхождения. Гемоглобин быстро превращается в гемихром при действии шрных кислот, анионных лизофосфолипидов и фосфатидилхолинов, .цилированных двухосновными карбоновыми кислотами. В присутствии [енасыщенных фосфолипидов автоокисление гемоглобина сопровождается шициацией их перекисного окисления.
Впервые показана большая устойчивость фосфолипидов в состаї облученных липосом к действию фосфолипазы А2 при включении в ні сфингомиелшіа. Эффект связывается с образованием амидов жирных кислі при радиационно-индуцированной свободнорадикальной фрагментащ сфингомиелина. В качестве ингибиторов фосфолипазы А2 исследован насыщенные и ненасыщенные амиды жирных кислот с числом углероднь атомов от 10 до 20. Выявлен сильный ингибитор фосфолипазы - амі стеароловой кислоты.
Обнаружен эффект толерантности липидного бислоя, содержаще] фосфатидилэтанол, к действию этилового спирта. Так как фосфатидилэтанс образуется из фосфолипидов и этилового спирта при катализе фосфолипазой I выдвигается гипотеза об участии фермента в адаптации мембраны алкогольной интоксикации. Показано эффекторное действие фосфатиди, этанола на процесс транспорта инсулинсодержащих липосом из желудочні кишечного тракта в кровяное русло.
Практическая значимость работы. Разработан быстрый мете выделения и очистки фосфолипидов из биологических источников реакционных сред. Оптимизирован способ препаративного получеш фосфолипидов с помощью фосфолипазы D. На основе липидной смесі содержащей фосфатидилэтанол, получен липосомалышй препарат инсулин который при пероральном введении вызывает повышение уровг, иммунореактивного инсулина с одновременным снижением глюкозы в кров крыс с аллоксановым диабетом. Концентрационно-зависимое превращен» гемоглобина в гемихром при добавлении амфифильных липидов положено основу методов определения концентрации гемоглобина в крови, определена концентрации ионных поверхностно-активных веществ в воде и определени активности фосфолипазы А2. Указанные разработки защищены 4 авторским свидетельствами на изобретения.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Разработка усовершенствованных подходов к выделению и очисти фосфолипидов с использованием однофазной экстракции и флэп хроматографии на мелкодисперсном силикагеле, что позволяет с малым затратами времени и растворителей получать хроматографически чисты препараты. Оптимизация ферментативного способа получения фосфолипидо из природного или синтезированного по традиционным химическим метода фосфатидилхолина с помощью фосфолипазы D, что дает возможность придат фосфолипидам заданные свойства.
-
Установление особенностей проявления физико-химических свойств каталитической активности цитохрома Р-450 в различном липидної окружении, что позволяет выявить наличие специфичности гемопротеина
формировании прибелкового липидного слоя, установить значение фазового перехода гель-жидкий кристалл для конформационной подвижности молекулы цитохрома Р-450 и показать роль анионных фосфолипидов как активаторов этого фермента.
-
Инициирование жирными кислотами, анионными лизопроизводными фосфолипидов и продуктами перекисного окисления фосфатидилхолина превращения гемоглобина в гемихром, что позволяет обнаружить природные эффекторы автоокисления гемоглобина.
-
Установление особенностей проявления каталитической активности фосфолипазы Аг в присутствии амидов жирных кислот, что дает возможность установить и количественно охарактеризовать эффекторное действие этих продуктов радиационно-инициированиой свободнорадикальной фрагментации сфинголипидов.
-
Установление физико-химических особенностей поведения липидных мембран, содержащих фосфатидилэтанол, в присутртвии этилового спирта, что позволяет обнаружить лшшдный фактор стабилизации мембраны к действию этанола.
-
Включение фосфатидилэтанола в состав инсулинсодержащих липосом для обеспечения прохождения гидрофильной макромолекулы инсулина из желудочно-кишечного тракта в кровоток, что дает возможность предложить такую липосомальную форму инсулина для испытаний в качестве перорального лекарственного средства при компенсаторном лечении сахарного диабета.
Личный вклад соискателя заключался в выборе направления исследования, разработке конкретного плана проведения и корректировки экспериментальной работы, выборе методов реализации поставленных задач. Основная часть экспериментальной работы, интерпретация полученных данных, их обобщение и оформление в виде научных статей, обзоров и докладов выполнены лично соискателем. В диссертации изложены результаты, полученные соискателем лично и под его руководством сотрудниками руководимой им группы. Биофизические исследования автор проводил совместно с сотрудниками лаборатории механизмов и кинетики ферментативных процессов (зав. лаб. д.х.н. П.А.Киселев), радиапионно-химические исследования - совместно с сотрудниками кафедры радиационной химии БГУ (зав. кафедрой д.х.н. О.И.Шадыро), биологические испытания инсулинсодержащих липосом - совместно с сотрудниками кафедры эндокринологии БелГИУВ (зав. кафедрой проф. Е.А.Холодова)
Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены автором лично на Всесоюзных симпозиумах "Липиды биологических мембран" (Львов, 1978; Пущино-на-Оке, 1984), III
Республиканской конференции молодых ученых (Таллинн, 1979), Всесоюзном симпозиуме "Окисление физиологически активных соединений і биологических мембранах" (Одесса, 1980), Секции Всесоюзногс биохимического общества (Москва, 1982), Ш Советско-Шведском симпозиума по физико-химической биологии (Тбилиси, 1982), Всесоюзном симпозиуме "Цитохром Р-450. Структура и функция" (Минск, 1982), III и IV Советско-Швейцарских симпозиумах "Биологические мембраны. Структура и функция' (Ташкент, 1983; Рига, 1988), XVI Конференции Федерации Европейски? биохимических обществ (Москва, 1984), Всесоюзной конференции "Цитохро\ Р-450 и охрана внутренней среды человека" (Москва, 1985), ЕО Международной конференции по химии и биотехнологии биологичеси активных природных соединений (София, 1985), Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и окружающая среда" (Новосибирск, 1987), Щ Симпозиуме "Цитохром Р-450 и ксенобиотики" (Мюльхаузен, ГДР, 1989), Международное конференции "Наука и медицина - Чернобылю" (Минск, 1993) Международном семинаре "Инсулин: получение, производство, применение' (Минск, 1995), П Съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизикої (Минск, 1996), II Белорусско-Российском симпозиуме "Биохимические механизмы эндогенной интоксикации" (Гродно, 1997)
Опубликоваиность результатов. Изложенные в диссертации результаты составили предмет 63 публикаций, в том числе монографии, 1 обзоров, 46 статей в рецензируемых изданиях, 6 статей в сборника? конференций, 4 тезисов докладов и 4 описаний к авторским свидетельства*? СССР.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения общей характеристики работы, обзора литературы (глава 1), обсуждение полученных результатов (главы 2-6), экспериментальной части (глава 7) выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 20; страницах, содержит 25 таблиц, 47 рисунков и библиографию из 30' наименований.
Похожие диссертации на Эффекторная роль фосфолипидов и их производных в биохимических реакциях
