Введение к работе
Актуальность темы. Исследования химических моделей и механизмов действия ферментов традиционно занимают одно из центральных мест в биоорганической химии. Также важным является изучение закономерностей регуляторного действия ферментов на разных этапах метаболизма растительной клетки, что дает возможность вести поиск новых технологий выращивания культурных растений в направлении воздействия на ферментные процессы.
В зтой работе основное внимание сосредоточено на двух ферментах фосфорного обмена клетки - кислой фосфатазе и неорганической пирофосфатазе. В последние годы встал вопрос о том, что кислая фосфатаза, фермент с широкой субстратной специфичностью, участвует в процессах регуляции метаболизма (Duff 1989, Plaxton 1994). Однако, в большинстве работ, проведенных с кислой фосфатазой, были использованы синтетические субстраты. Поэтому важным заданием является исследование гидролиза кислой фосфатазой природных субстратов, что позволяет установить истинные закономерности действия фермента. На ранних стадиях прорастания семян ключевую роль в обеспечении клетки углеродными соединениями и неорганическим фосфатом играет фосфоенолпируват (ФЕП), в гидролизе которого участвует кислая фосфатаза. Молекулярный механизм распада ФЕП на ферментах привлекает внимание исследователей, однако четкого представления о нем нет. Для решения этого вопроса нами была исследована модель фотохимического гидролиза ФЕП под действием ультрафиолетового облучения.
Другое соединение, которое занимает важное, но недостаточно установленное место в регуляции обмена веществ и транспорте электронов в энергопреобразующих органеллах - неорганический пирофос-фат (РРі). Наряду с АТФ, это соединение участвует как в биосинтетических, так и в окислительно-восстановительных процессах ( Гулая, 1970, Baltcheffsky, 1985, Аваева, 1990). Перенос электронов в электронтран-
спортных цепях хлоропластов и митохондрий происходит через ПОСЛ( довательность одно- и двухэлектронных переносчиков. Не установле механизм и значение такого чередования, поэтому разработка пробле мы сопряжения одно- и двухэлектронных путей транспорта электроне является актуальной.
Связь работы с научными программами. Понимание механи: мов регуляции фосфорного и углеводного обмена, а также транспорт электронов при фотосинтезе очень важно для рационального использе вания регуляторов роста и средств защиты растений, создание которы является одной из приоритетных задач биоорганической химии. Работ выполнена в рамках общей тематики отдела химии фотосинтеза Инсті тута "Биомиметика процессов фотосинтеза и механизмы взаимодеі ствия биологически активных соединений с модельными системами т реноса электронов".
Цель и задачи исследования. Целью работы было определени функций кислой фосфатазы, РРі и пирофосфатазы в регуляции отделі ных участков углеродного и энергетического обмена растительной клеї ки.Исходя из поставленной цели, в работе решались такие задачи:
исследовать кинетику гидролиза кислой фосфатазой из зародыше пшеницы субстратов, которые содержат макроэргическую фосфе эфирную связь;
определить влияние неорганического фосфата и РРі на реакции кис л ой фосфатазы;
разработать химическую модель, поясняющую механизм расщепле ния ФЕП на ферменте;
-исследовать участие РРі и пирофосфатазы в сопряжении одно-двухэлектронных стадий в хлоропластах;
- изучить влияние физиологически активных соединений, которые ВЗс
имодействуют с системами вторичной передачи сигнала в клетке, н
модельный транспорт электронов в хлоропластах.
Научная новизна полученных результатов. Результаты иселє дований расширяют взгляд на роль кислой фосфатазы и пирофосфг
газы, а также PPi в метаболизме растительной клетки. Найдено, что <ислая фосфатаза в гидролизе ФЕП действует в ассоциированной форме как PPi-зависимый фермент, небольшие концентрации РІ стимулирует гидролиз субстратов с макроэргической фосфоэфирной связью. Опи-:ана фотохимическая модель ФЕП-зависимых ферментов, установлены промежуточные стадии активации фотовозбужденного состояния ФЕП, показано фосфорилирование некоторых ионов при высоких температурах при УФ-распаде ФЕП. Найдено, что пирофосфатаза участвует в сопряжении одно- и двухэлектронних стадий при восстановлении НАДФ+ з хлоропластах при отсутствии ферредоксин-НАДФ-редуктазы. Показано влияние PPi на реакции Хилла (акцептор Fe(CN)63~) и Мелера [акцепторы ФМН и метилвиологен). Обоснована новая гипотеза о регу-пяторных механизмах кислой фосфатазы и PPi во время развития растительного организма.
Практическое значение полученных результатов. Результаты исследований фотохимического гидролиза ФЕП могут быть основой для дальнейшего развития систем неферментативного фосфорилирования ;убстратов. Кислая фосфатаза как фермент, участвующий в регуляции углеродного и фосфорного метаболизма, является перспективным объ-эктом для поиска новых регуляторов роста растений, влияющих на активность этого фермента. Определение влияния физиологически активных веществ на транспорт электронов в хлоропластах может быть эазвито в систему тестирования способности биоактивных соединений Л<аствовать в окислительно-восстановительных реакциях клетки.
Личный вклад соискателя. Все основные практические результаты, которые приведены в работе, получены лично автором. Соавторы публикаций принимали участие в определении направления исследований, а также обсуждении результатов.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на VI Конференции молодых ученых "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики", юсв. 50-й год. основания Института физиологии растений и генетики
HAH Украины (Киев, 1996), на XII Научной конференции по биоорганич еской и нефтехимии (Киев,1997), на III Симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология" (Москва, 1997), на III Ев ропейском конгрессе по катализу (Краков, 1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печат ных работ, из которых 4 статьи и 4 тезисов конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 стр печатного текста, состоит из введения, литературного обзора, где со держится анализ работ, посвященных проблемам фотосинтеза, образо вания и утилизации макроэргических фосфатов, роли кислых фосфата; в клетке. В разделе "Материалы и методы" изложены методики экспери ментов, далее в четырех главах приводятся результаты исследований t их обсуждение. Данные опытов представлены в 23 рисунках и 6 табли цах. Список литературы насчитывает 120 наименований.
