Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Применение облепихи в качестве лекарственного сырья в народной медицине и официнальной медицине 8
1.2. Основные биологически активные вещества плодов и листьев облепихи 10
1.3. Биохимическая характеристика плодов облепихи и облепихового масла 31
2. Химическое изучение облепихи,произрастающей на Западном Памире 40
2.1. Описание условий произрастания изучаемых форм облепихи на Западном Памире 40
2.2. Химическая характеристика плодов и масла облепихи Западного Памира 41
2.3. Флавоноиды листьев и плодов облепихи Западного Памира 81
2.4. Активность суммарных препаратов из плодов и листьев облепихи Западного Памира 105
3. Экспериментальная часть 108
Выводы 116
- Основные биологически активные вещества плодов и листьев облепихи
- Биохимическая характеристика плодов облепихи и облепихового масла
- Флавоноиды листьев и плодов облепихи Западного Памира
- Активность суммарных препаратов из плодов и листьев облепихи Западного Памира
Введение к работе
Конец XIX, начало XX веков ознаменовались новым направлением в медицине: лечением синтетическими лекарственными препаратами. Особенного развития это направление получило за последние 50 лет. Однако, колоссальный научно-технический прогресс, интенсификация жизненного ритма, широкое вовлечение достижений химии, сильное загрязнение окружающей среды привели к изменению заболеваний у человека, к исчезновению и уменьшению процента одних болезней, усилению других, значительно возросли аллергические заболевания, появились лекарственные болезни, лечение которых столь же сложно, как и лечение самих болезней человека. И хотя арсенал лекарственных средств значительно увеличился, число больных людей не уменьшилось.
Организм человека - сложная саморегулирующая система. Лечение монолекарствами является мощной лекарственной атакой как на больные органы, так и на здоровые, которая приводит к подавлению и снижению общих защитных свойств организма.
Лечение лекарственными растениями, особенно сборами, представляющими собой набор биологически активных веществ, которые проявляют многоплановое действие с общим мягким положительным эффектом, не нарушая иммунохимических реакций организма, является более щадящим методом лечения, который позволяет сохранить мобилизационные свойства организма.
Поэтому в последнее время вновь возрос интерес к лекарственным препаратам из растений. В фармакопеи мира увеличился их процент, цена на препараты из лекарственных растений во всем мире растет.
Ведутся широкие исследования по выделению, установлению химической структуры и свойств природных веществ, ответственных за фармакологическую активность лекарственных растений. Эти исследования позволяют поставить на научную основу знания народной медицины, проводить синтезы этих веществ и модификацию их с целью усиления фармакологического действия и последующую замену лекарственных препаратов из растений на их синтетические аналоги.
В постановлении общего собрания АН GCGP и общего собрания АМН СССР от 20 ноября 1980 г. "О дальнейшем развитии фундаментальных исследований для медицины" рекомендуется наряду с синтетическими препаратами сосредоточить усилия научных учреждений на поиске и получении биологически активных и лекарственных веществ из сырья растительного и животного происхождения, разработке биологических основ введения в культуру перспективных видов растений и животных, изучении запасов и составлении карт лекарственных растений ряда регионов страны.
Облепиха, как лекарственное растение, известна в народной медицине давно. С 1956 г. официнальной фармакопеей GGGP разрешено применение облепихового масла в качестве противоязвенного препарата. Однако, до настоящего времени не выяснены вещества, ответственные за специфическую биологическую активность облепихового масла, которая позволила бы провести более точную дозировку при использовании лекарственного препарата и создать новые лекарственные средства из другого сырья.
Учитывая, что получение облепихового масла идет в промышленных масштабах, закономерной является постановка вопроса об изучении биологически активных веществ, как самого облепихового масла, так и веществ нелипидного характера, т.к. сведения народной медицины о лекарственном действии отваров из листьев, плодов, веток дают возможность предположить наличие биологически активных веществ, проявляющих противовоспалительный и иммунный эффект.
Все это послужило основанием для постановки данного исследования.
Актуальность проблемы. Плоды облепихи являются сырьем для получения ценного лекарственного препарата - облепихового масла. В настоящее время промышленное получение облепихового масла осуществляется на единственном в Советском Союзе предприятии - Бий-ском витаминном заводе Минмедпрома, который удовлетворяет 10-15% потребности органов здравоохранения в облепиховом масле, что связано с ограниченными сырьевыми ресурсами облепихи.
Поэтому расширение производства масла за счет использования новых регионов произрастания облепихи является важной задачей. Одновременно, весьма существенной задачей является комплексная переработка облепихи с поиском путей использования других биологически активных веществ в плодах и листьях облепихи.
В 1977 г. СМ Таджикской ССР принял постановление " Об увеличении производства ягод облепихи и организации их переработки".
Таджикистан имеет естественные заросли облепихи, значительная часть которых сосредоточена в Горно-Бадахшанской области на высоте 2000-3500 м над уровнем моря. Экстремальные условия произрастания облепихи (высокая инсоляция с большим процентом ультрафиолета, резкая смена температур, пониженное содержание кислорода и т.д.) могут влиять на содержание, соотношение, а, возможно, и на природу биологически активных веществ в ней.
Поэтому химическая характеристика облепихи и оценка ее с точки зрения лекарственного сырья позволят решить вопрос о возможности использования этого региона в качестве источника ресурсов для получения облепихового масла, а изучение химии веществ нелипидной природы позволит наметить пути возможного использования этих соединений.
Работа выполнялась по теме ГКНГ GM СССР, постановление № 169 от І2.У.І976 г. № госрегистрации 77021407 "Проведение химической и биологической оценки форм облепихи Памира, составление рекомендаций по оптимизации выделения облепихового масла по химическому составу и определение по этим показателям перспективных сортов для селекции и введения в культуру". Она входит в состав Республиканской программы по решению научно-технической проблемы 0.03:"Изучить лекарственные растения флоры Таджикистана с целью создания новых эффективных лечебных средств" на І98І-І985 гг. и комплексной научно-технической программы Минмедпрома и НПО "Витамины" на І98І-І985 гг. "По увеличению выпуска облепихового масла и созданию лекарственных средств на его основе".
Исследования выполнялись совместно с Памирским Биологическим институтом АН Таджикской ССР, сотрудники которого проводили биологическую характеристику форм облепихи.
Цель работы. Изучение содержания биологически активных веществ в формах облепихи, произрастающей на Западном Памире с целью оценки их как лекарственного сырья и с точки зрения введения в культуру и для селекции, а также выделение и идентификация веществ фенольной природы, в частности, флавоноидов для поиска путей их практического использования.
Научная новизна. Впервые дана химическая характеристика облепихи, произрастающей на Западном Памире по поймам рек Ванч, Пяндж, Гунт, Шахдара. Показаны отличия этой облепихи от форм облепихи, произрастающей в других регионах Советсткого Союза. Дана химическая характеристика флавоноидов листьев и плодов этой обле- -пихи, проведено сравнение по формам и в зависимости от высоты произрастания, дано сравнение с другими районами.
Практическая ценность. Памирская облепиха, как лекарственное сырье, вполне пригодна для промышленной переработки. Дана оценка форм как селекционного материала: три формы отобраны для введения в культуру (ШХ-І9, ИК-І6, B-I4). Сумма флавоноидов из листьев и плодов облепихи практически не токсична, относится к витаминным препаратам, проявляет слабый гипотензивный и противовоспалительный эффекты.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на:
1. Всесоюзном координационном совете по облепихе и облепи-ховому маслу І-ІУ (Новосибирск, 1978-1979; Душанбе, 1981; Барнаул, 1983);
2. I съезде фармацевтов Таджикистана (Душанбе, 1979);
3. Ш конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Душанбе, 1981);
4. ІУ Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям (Ташкент, 1982);
5. У конференции молодых ученых (Душанбе, 1980, 1981, 1982).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 7 тезисов.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах, содержит 39 таблиц и 4 рисунка. Список использованной литературы включает 141 наименование.
Диссертация состоит из введения, трех глав, списка литературы и приложения.
Основные биологически активные вещества плодов и листьев облепихи
Биологически активные вещества в облепихе изучались, главным образом, в ее плодах, в околоплоднике которых содержится масло, не имеющее себе аналогов в практической медицине. А в последние годы пояаились исследования биологически активных веществ, выделенных из листьев облепихи [24,25] . Биологически активные вещества плодов и листьев облепихи разделяются на две группы: а) водорастворимые, б) липидорастворимые. а) К водорастворимым биологически активным веществам плодов облепихи относится прежде всего аскорбиновая кислота. Это одна из наиболее важных сахарных кислот, представляющая V -лактон гексо- новой кислоты с ендиольной формой структуры Ср и Со [2б] . Аскорбиновая кислота обладает ярко выраженными восстановительными свойствами. Она участвует в каталитических процессах, протекающих в тканях живого организма, в виде компонентов сложных ферментных систем - коэнзимов, благодаря наличию в молекуле ендиоль-ной группы (-0HG = G0H-). Есть предположения, что аскорбиновая кислота участвует при взаимодействии ядра и цитоплазмы [27,28] . В больших дозах 50 мг/кг аскорбиновая кислота оказывает гемолизи-рующее воздействие на кровь собак, кроликов и морских свинок, вызывает явление анемии и подавляет сопротивляемость организма, понижая фагоцитарную активность лейкоцитов. Установлено, что аскорбиновая кислота оказывает защитное действие при С-авитаминозах [із] . По содержанию аскорбиновой кислоты плоды облепихи превосходят почти все плодово-ягодные культуры, за исключением плодов шиповника [29-31] . Установлено, что содержание витамина С зависит от разнообразия форм облепихи крушиновидной и степени зрелости ее плодов. В зрелых плодах облепихи аскорбиновой кислоты почти в три раза меньше, чем во время созревания плодов [32] . Колебания в содержании витамина С могут зависеть и от места произрастания облепихи. Рядом авторов показано, что плоды облепихи, собранные по побережью Балтийского моря и в горных районах (Тироле, Баварских Альпах, Верховьях Рейна), содержат витамина С до 900 мг% и по его содержанию превосходят алтайские формы [l9,33,34] . В Средней Азии плоды облепихи содержат 150-200 мг% витамина С, на Урале - ІІ4-ІЗЗ мг%, в Литовской ССР - 367 мг%, в Латвии -139 мг% [35-38] . В облепихе, произрастающей в Талды-Курганской области, среднее содержание витамина С колебалось от 54,0 мг% (в пойме реки Коксу) до 284 мг% (река Усек) [зэ] . В то же время облепиха, произрастающая на Кавказе, бедна витамином С - 25 мг на 100 г свежих плодов 40 . Этими же авторами исследовалась облепиха, произрастающая в дельте реки Дунай, где они наблюдали большие различия в содержании аскорбиновой кислоты - от 20 мг до 229 мг на 100 г.
Однако содержание аскорбиновой кислоты здесь было выше, чем в формах облепихи из Северного Азербайджана и Приэльбрусья [40,41] . В плодах алтайской облепихи при исследовании ее на содержание витамина С в разные годы обнаружили колебания в содержании аскорбиновой кислоты (табл.1) [42J . Работами Девятнина В.А. и Захаровой М.Н. показано, что в соке облепихи находится больше витамина С (500 мг%), чем в плодах (303,4 мг%), причем количество витамина С уменьшается в мороженом соке и плодах приблизительно в два раза [43] . Таким образом, содержание витамина С в плодах облепихи может являться характеристикой сорта облепихи, и на его величину оказывает влияние время сбора плодов и регион произрастания. б) В группу липорастворимых витаминов, содержащихся в плодах и листьях облепихи и обладающих биологической активностью, входят пигменты, которые в настоящее время по международной номенклатуре объединяются в группу витаминов, называемых каротино-идами. К липорастворимым витаминам относятся также токоферолы, жирные кислоты, фосфолипиды, витамин К. Холин, бетаины, стерины, высокомолекулярные жирные спирты, терпенолы относятся к биологически активным веществам. В состав каротиноидов входит каротин. При детальном изучении каротина были выделены: L -каротин, Ь -каротин и Т -каротин [44J . Все они имеют сходное строение и состоят из р -ионо-нового кольца и цепочки изопреноидного характера: Причем, из р -каротина образуется две молекулы витамина А, а из d - и У -каротина - по одной молекуле. В печени рыб был найден витамин Ар, отличающийся от витамина А наличием двух двойных связей в р -иононовом кольце [45J . Есть предположение, что изомер X -каротина - ликопин является провитамином Ag [4б] . Исследованиями показано, что каротиноиды проявляют антигиста-минные свойства, которые нормализуют многие патологические реакции продуктов обмена гистидина [47] . Балоховский С.Д. с сотрудниками обнаружил, что продукты распада витамина А обладают противоспазма-тическим и противовоспалительным действиями 48J . В сетчатке глаза обнаружены каротиноиды и витамин А [45] . Каротиноиды связаны с углеводным обменом, потому что при А-авитаминозе уменьшается содержание гликогена в тканях и накопление монофосфатных эфиров в митохондриях. Леутский К.М. показал, что при А-авитаминозе нарушается липидный обмен 49 . Витамин А стабилизирует минеральный обмен. Для удержания калия в клетках необходимы фосфорные соединения, например, крео-тин-фосфат. При А-авитаминозе эти фосфорные и липидо-белковые комплексы разрушаются, и калий уходит из клеток. Каротиноиды являются важными факторами роста, они предохраняют эпителий от кера-тинизации. Витамин А влияет на кроветворение через содержание фо-лиевой и фолиновой кислот [45І . Даже этот далеко не полный перечень роли каротиноидов в организме человека и животных дает представление о ценности каротиноидных препаратов, роль которых до конца еще не выяснена, хотя практическая их ценность несомненна.
Облепиха рассматривается как источник витамина А, и тестирование облепихового масла, выпускаемого Бийским витаминным заводом, производится по содержанию в нем каротиноидов. В плодах облепихи содержание каротина коррелирует с окраской плодов: чем интенсивнее окраска, тем процент каротина выше [50-5IJ . Однако, исследованиями Шишкиной Е.Е. показано, что "о существовании корреляции между цветом плодов облепихи и содержанием каротина можно говорить пока лишь предположительно" [52І . Хотя автором было замечено, что формы с светло-желтой окраской плодов имели, как правило, наименьшее количество каротина. Содержание каротина зависит от места произрастания облепихи. В плодах алтайской облепихи содержание каротина колебалось от 1,1 мг% до 10,9 мг% и от 0,57 мг% до 1,64 мг% по данным разных авторов [50,52І . Годовое наблюдение за содержанием каротина в плодах алтайской облепихи в зависимости от окраски плодов показало некоторое колебание в данных (табл.2 шевского района Азербайджанской ССР, сумма каротиноидов в сырых плодах колебалась в пределах 1,80 - 9,52 мг% [53] . В свежих плодах облепихи, собранных в Кирдманчайской долине Азербайджана, сумма каротиноидов составляла 4,51 мг%, в том числе JL -каротина - 0,71, -каротина - 0,91, ликопина - 1,35 [54І . Облепиха, произрастающая на территории Казахстана, содержала -каротина в плодах - 8,0 - 9,5 мг%, но попадались и малокаротин-ные формы с содержанием каротина 1,3 - 1,7 мг%[5б]. В листьях облепихи Алтая содержится 12 - 16 мг% $ -каротина (на сырой вес) [56 J . Учитывая, что -каротин является провитамином А, большинство исследователей считали, что наибольшего внимания заслуживает определение каротина в плодах облепихи, хотя, исходя из последних данных о биологической активности каротиноидов, целесообразно для лекарственных растений давать сумму каротиноидов. Свободные жирные кислоты содержатся в большинстве клеток и тканей лишь в следовых количествах, но они играют роль строительных блоков для липидов нескольких классов, таких как нейтральные жиры, фосфоглицериды и др [26J . Известно более 70 жирных кислот. Почти все жирные кислоты липидов высших растений и животных содержат четное число атомов углерода от 14 до 22, чаще всего 16 или 18. В липидах высших организмов двойная связь находится в большинстве случаев между 9-м и 10-м углеродом. В жирных кислотах, содержащих две или более двойных связей, эти связи никогда не находятся в сопряжении. Двойная связь природных ненасыщенных жирных кислот имеет цис-конфигурацию за исключением вакценовой кислоты.
Биохимическая характеристика плодов облепихи и облепихового масла
Облепиха произрастает в различных районах Советского Союза. Условия произрастания лекарственных растений нередко влияют на накопление в них биологически активных веществ. Поэтому на I Всесоюзном совещании по витаминам из природного сырья было принято решение об углублении и расширении сравнительного изучения форм облепихи в географическом разрезе. Наиболее широко исследования по облепихе ведутся в НИИ садоводства Сибири им.Лисовенко. Работами Шишкиной Е.Е. показано, что плоды облепихи, произрастающей в различных географических зонах, содержат неодинаковый процент масла на 100 г сырого веса:Алтайская - 3,28-6,95$, Чулышманская - 2,84-4,03$, Саянская - 2,50-3,87$, Тяныпанская - 1,91-4,41$, Даурская - 2,23-3,27$ [б2] . Облепиха изучалась довольно подробно. Наиболее полно и для всех форм в плодах определялись масличность, влажность, содержаниє аскорбиновой кислоты, каротина или каротиноидов. Изучалось также содержание в плодах различных групп фенольных соединений (лейкоантацианов, катехинов, флавонолов, хлорогеновой кислоты) и тритерпеновых кислот. Так как наибольшую ценность представляет облепиховое масло, то рядом авторов приводятся его биохимические показатели и в некоторых случаях выделяются его отдельные компоненты [I02-I04J . Ручкин В.Н. дал следующий состав плодов облепихи: воды - 83,8%, сухих веществ - 16,2%, в которых - 9,68% семян, 6,52% мякоти, 2%.масла. Те же соотношения воды и сухих веществ приводятся Евтушенко А.Ф. В сибирских формах воды содержится в основном 82,5%, масла - до 8,8%. В облепихе Северного Азербайджана влажность плодов составляет 82-88%, сухих веществ - от 18% до 22%, вес ста плодов - от 17,2 до 26,0 г, масла - от 3,49% до 4,75% [40] . При исследовании формового разнообразия облепихи в Северо-Западном Азербайджане было найдено, что вес 100 плодов колеблется от 19,9 до 41,1 г, что свидетельствует о формах с крупными плодами (вес одного плода до 0,411 г). Содержание масла в Азербайджанской облепихе составляло 1,89-3,6%. К сожалению, авторы не приводят содержание сухих веществ в плодах, а содержание масла определяли нестандартным, термическим методом [I05J . Формы облепихи, собранной в Абхазии в долине реки Гумиеты Сухумского района, содержали воды 74,4%, сухих веществ - 25,6%; в прибрежном районе близ селения Крмоловское Гагринского района воды - 73,88%, масла - 5,03% [іОб] . По данным Ободовской Д.А., плоды облепихи Алтая, собранные в 1949-1950 гг в низовьях реки Катунь, общим количеством 84 образца имели влажность от 83,6% до 86,4%, масличность - от 3,4% до 6% [ы].
Автором было отобрано 49 форм на Селенгинском массиве Бурятской АССР, которые в среднем содержали 315 мг% аскорбиновой кислоты (максимально - 625 мг%), каротина - 3,15-7,16 мг%, масла - 4,94--6,19%. В настоящее время выработаны определенные требования к новым сортам. Они должны содержать не менее 7% масла [I07J . Сорта облепихи Алтайской опытной станции (Новость Алтая, Масличная, Дар Катуни, Витаминная), высаженные в ЦБС АН БССР, имели влажность 84,02-86,06%, содержание масла - 3,38-4,60%. При изучении химического состава плодов семи форм облепихи из Монголии установлено, что влажность их колеблется от 81,4% до 84,4%, а мас-личность - от 2,51% до 7,16% [їв] . Содержание сухих веществ в облепихе Западного Памира колеблется от 27,3% до 42,6%, а влаги - от 57,4% до 72,7%, соответственно, аскорбиновой кислоты - от 182 до 807 мг%, каротина - от 3,8 до 15,1 мг% на 100 г сырых плодов [108] . В облепихе, собранной в Кирмандчайской долине Азербайджанской GCP, содержится влаги 81,4%, масла - 4,4%, сумма каротино-идов - 4,5 мг% [54 . С сожалению, авторы ссылаются на работу-Асланова СМ. [109 , в которой указан другой район сбора облепихи, что вызывает некоторую неясность в результатах работы. Таким образом, формы облепихи, произрастающие в Средней Азии и на Кавказе имеют пониженное содержание влаги (до 74%) по сравнению с облепихой Алтая и БССР (80%-84%). Облепиха Западного Памира также содержит пониженное количество влаги(57,4-72,7%). Масла из различных растений имеют свои определенные биохимические показатели, которые являются интегральными показателями качественного состава масла. Начиная с работ Ручкина В.Н., ведутся биохимические исследования облепихового масла. Им же проведена сравнительная характеристика масла, полученного двумя способами: из сухих плодов экстракцией эфиром (выход 5,7%) и прессованием плодов (выход 1%) Полученные результаты показали по основным показателям масла идентичные результаты [102] . Щугам Н.Д., [17J , изучая масло облепихи, полученного методом прессования из сорта "Дар Катуни", приводит результаты, которые по основным своим показателям, кроме йодного числа, близки к данным Ободовской Д.Н. [ 5IJ , которая работала с плодами облепихи, собранными в пойме реки Катунь (табл. 9). В таблице 9 приводится физико-химическая характеристика масла из плодовой мякоти облепихи, полученной разными авторами.
Масло плодов облепихи, собранной в конце августа начале сен тября в долине р.Палтау (Чаткальский хр) Уз.ССР [iio] , получали экстракцией смесью хлороформ-метанол (1:2), хлороформную часть су шили сульфатом натрия, хророформ отгоняли, масло растворяли в гек сане, осадок отфильтровывали, полученное таким образом масло слу жило для дальнейших исследований. Оно имело: показатель преломления - 1,4646, кислотное число - 14,2, каротиноиды - 1089 мг на 100 г, токоферолы - 300 мг на 100 г. Судя по коэффициенту преломления, масло, полученное экстракцией, имеет в себе вещества, понижающие его по сравнению с прессовым нативным маслом. Масло из жома облепихи, собранной в Варташев-ском районе Аз.ССР, полученное экстракцией петролейным эфиром (40-60), имело следующие показатели [I09J : удельный вес, г/см3 - 0,9217-0,9231, коэффициент преломления - 1,4590-1,4660, кислотное число мг КОН/г - 9-12, число омыления мг КОН/г - 200, йодное число, % - 112,5, родановое число, % - 86,6, содержание фосфолипидов, % - 0,89, неомыляемая часть, % - 3,3, число нейтрализации, мг КОН/г - 211,7, общее содержание жирных кислотД-95,6. Быков Ю.С. с соавт. работали в 1972 г. с маслом, полученным на Бийском заводе методом прессования [IIIJ . Масло имело следующие константы: удельный вес , г/см3 - 0,9160, коэффициент преломления - 1,4685, кислотное число мг КОН/г - 2,4, число омыления мг КОН/г - 198, йодное число $ - 75, ацетильное - 22,2. Таким образом, физико-химические показатели облепихового масла, полученного из плодов облепихи различных районов произрастания, имеет, в основном, следующие показатели: удельный вес порядка 0,9210-0,9243 показатель преломления порядка 1,4700 и только у экстракционного масла он ниже - 1,4590-1,4660 ; кислотное число колеблется от 3,2 до 14,0 (Высокое кислотное число, с одной стороны, может свидетельствовать, что плоды облепихи были собраны в незрелом состоянии, с другой стороны, о частичном закисании ягод при транспортировке); йодное число колеблется от 65 до 75 и только по данным Щугам и Жамъянсана,оно - 78-83 Йодное число для масла по данным Ободовской Д.Н., совпадает с данными Ручкина В.Н. и составляет 75,7; у Шугам Н.Д. для сорта "Дар Катуни" - 83; Жамъянсан Я. для сорта "Селенга" - 81, для сорта "Тэс-1" - 78; у Вигорова Л.И. - для масла из плодов, собранных в Калининградском районе по берегу Балтийского моря - 70; а для масла из плодов Забайкальских образцов облепихи - 65; по Быкову Ю.С. в усредненном масле Бийского завода йодное число равно 75 17-19,102, III] . Несколько завышены результаты Асланова, которые, вероятно, ошибочны [l09J . Интерес к облепихе, как плодовой культуре, растет с каждым годом. Основное внимание уделяется селекционной работе по выведению сортов с повышенным витаминным составом и т.д. ІІІ2І . Большую работу в этом направлении проводит Научно-исследовательский институт садоводства Сибири им. Лисовенко, где получены ценные сорта облепихи lI3,II4j . Наибольшее распространение в культуре в настоящее время имеют сорта "Новость Алтая", "Дар Катуни", "Золотой початок", "Витаминная", "Масличная".
Флавоноиды листьев и плодов облепихи Западного Памира
Памир относится к району с высокой солнечной инсоляцией и прозрачной атмосферой. На долю УФ-радиации в районе Хорога (2000 м над уровнем моря) приходится пять и более процентов в общем солнечном потоке. Поэтому следует ожидать накопление фенольних соединений в растениях, произрастающих на Памире. Действи- тельно, работами, выполненными на Памире, показано, что УФ-ради-ация вызывает торможение процессов роста и развития растений за счет накопления в них эндогенных факторов роста, которые почти нацело состоят из фенольных соединений типа флавоноидов, кофейной, хлорогеновой кислот [ют] . Плоды и листья были исследованы на содержание суммы флавоноидов. Материал был собран в различных районах Западного Памира по поймам рек: Шахдары (ШХ-), Ванч (В-), Гунт (Г-), Пяндж (ИК-) и Памир (ІШ-). Из таблицы 31 следует, что содержание флавоноидных веществ в листьях по формам было различным и колебалось в широком диапазоне от 310 мг до 2138 мг на 100 г воздушно-сухой массы. Из 21 формы, изученных в 1979-1980 гг., 310-570 мг содержится в 7 формах (33, от 629-788 мг - в 5 формах (23,9$) и от 927 до 978 мг - в б формах (28,5%). Свыше ІІІ0 мг - в 3 формах (14,2$). Содержание флавоноидов в плодах облепихи колеблется от 117 до 846 мг на 100 г сырых плодов (табл.31). Из 20 изученных форм в 5 содержится II8-29I мг флавоноидов (5%), от 309 до 449 мг - в 7 формах (35%), от 615 до 854 - в 8 формах (40%). Коэффициент корреляции между содержанием флавоноидов в листьях и высотой произрастания облепихи над уровнем моря выражен величиной-0,89 и имеет обратную зависимость: чем выше над уровнем моря произрастает облепиха, тем ниже содержание флавоноидов в ее листьях, а содержание флавоноидов в плодах облепихи не зависит от высоты произрастания облепихи над уровнем моря. Содержание флавоноидов в плодах и листьях облепихи колебалось по годам (табл.32). Качественный анализ, флавоноидных гликозидов и их фракционирование проводили следующим образом: флавоноиды из 5,0 г воздушно-сухих измельченных листьев облепихи экстрагировали трижды по 50 мл 96% спиртом на водяной бане в течение I часа. Объединенные извлечения сгущали до 5 мл и использовали для хроматографи-ческого анализа. Для анализа применяли двухмерную хроматографию на бумаге марки "С ленинградской фабрики им.Володарского в хроматографи-ческих камерах высотой 500 мм. В этих камерах производили нисходящее и восходящее хроматографирование. Вещества разделяли в первом направлении в системе н-бута-нол:уксусная кислота:вода (4:1:2) и во втором - в системе 15% уксусная кислота.
В предварительном хроматографическом исследовании (судя по окрашиванию пятен, Rf и т.д.) нами показано, что в листьях облепихи содержатся агликоны и гликозиды флавоноидов. Для выделения суммы флавоноидов «7 кг воздушно-сухих листьев облепихи экстрагировали трижды десятью литрами горячего этанола. Экстракт упаривали в вакуумном испарителе марки ИР-10 при температуре 50-60G, Осадок (900 г) растворяли в горячей дистиллированной воде, объем доводили до 5 л, хлорофилл выпадал в осадок и отделялся центрифугированием. Водный остаток (2л) последовательно экстрагировали растворителями в порядке возрастания полярности: петролейный эфир, бензол, диэтиловый эфир, хлороформ, этилацетат и н-бутанол порциями по 00 мл до осветления растворителя. Фракции концентрировали в вакууме и разделяли на хромато-графических колонках с полиамидным сорбентом. Вещества, полученные из колонок (смесь 2-3 веществ), повторно хроматографировали в системе этиловый спирт:вода. Полученные вещества подвергали дальнейшему исследованию. Одним из этапов такого исследования был кислотный гидролиз с последующим анализом агликонового и углеводного состава. 3-5 мл спиртового концентрата смешивали с 2-3 мл 5% соляной кислоты и смесь кипятили на водяной бане в течение 2-3 часов в колбе с обратным холодильником, гидролизат упаривали досуха и остаток растворяли в этиловом спирте. Пятна агликонов и флавоноидных гликозидов обнаруживали по поглощению или флуоресценции в фильтрованном УФ-свете (360 нм) до и после проявления. Проявление проводили парами аммиака, 2$ раствором хлорида цирконила в метаноле с последующей обработкой парами аммиака или 10% водным раствором едкого калия. Для флавоноидов, выделенных хроматографией на колонках с полиамидом, проводили спектральный анализ с использованием дифференциальной УФ-спектроскопии Гі28І . Растворы флавоноидов для УФ--спектроскопии подбирали в таких концентрациях, которые обеспе- чивали бы поглощение в области 250-270 нм и 330-370 нм. В качестве растворителя применяли метанол.
Диагностическими добавками служили: 10% спиртовый раствор едкого калия, сухой безводный ацетат натрия, борная кислота, 2% раствор хлорида цирконила в метаноле. Запись УФ-спектров нейтральных растворов производили на спектрофотометре СФ-І6 в области 230-380 нм, а с диагностическими добавками - 230-500 нм. В последнем случае спектр записывали на фоне метанольного раствора анализируемого флавоноида в равной концентрации. В результате препаративного разделения на колонках нами получено 7 веществ флавоноидного характера. Вещество I. Кристаллы желтого цвета, полученные из серно-эфирного экстракта. После перекристаллизации в этиловом спирте имели т.пл. 306-309G. На основании физико-химических констант, данных УФ- и ШР-спектроскопии (табл.33,-35) вещество I идентифицировано как изорамнетин (I). Получено из этилацетатного экстракта при промывании колонки водно-спиртовой смесью, повышая концентрацию спирта: 20,30,40,50 и 80$. Выделение вещества наблюдалось при десорбции 30$ этиловым спиртом. После двухкратной перекристаллизации в этиловом спирте получены кристаллы желтого цвета, физико-химические свойства приведены в табл.33. Положение основных максимумов поглощения вещества Ш в УФ-спектре (табл.34) характеризует его как производное группы флавонола. Вещество является гликозидом, о чем свидетельствует положение и окраска его на хроматограмме, наличие оптического вращения и полос поглощения спиртовых гидроксилов в ИК-спектре, а также образование при кислотном гидролизе агликона (вещество I) и углеводного компонента глюкозы. Гликозидная природа вещества Ш подтверждается и данными ШР-спектроекопии. В ПМР-спектре вещества Ш (табл.35) сигнал ано-мерного протона проявляется при о »5,78 м.д. Количество углеводных остатков определено по интегральной интенсивности и равно одному на молекулу. Сигналы протонов углеводной части находятся в области 0=:2,9 - 3,8 м.д. Положение заместителей в исследуемом веществе следует из данных УФ-спектроекопии с ионизирующими и комплексообразующими добавками (табл.34). Образование гипсохром- ного сдвига П полосы с борной кислотой в присутствии ацетата натрия указывает на то, что в положении Сд и G в В кольце не наблюдается орто-гидроксильных групп. Кроме того, в ПМР-спектре ясно виден сигнал метоксильной группировки (табл.35). Образование большого батохромного сдвига на УФ-спектре в присутствии хлористого цирконила указывает на замещение 3-оксигруппы, что характерно для изорамнетиновых производных, имеющих углеводный остаток при Сд. Присутствие свободной оксигруппы при С обнаружили по батохромному сдвигу на 45 нм. при добавлении безводного ацетата натрия. При добавлении едкого калия наблюдается батохромный сдвиг, обусловленный присутствием ОН-группы при Cg. Для установления размера цикла углеводной части был снят дифференцированный ИК-спектр гликозида в сравнении с его агликоном (вещество І) в мольном соотношении. Наличие двух сильных полос поглощения в области 1068, 1020 см"" указывает, что глюкоза находится в фуранозной форме и связана с агликоном р -гликозидной связью (табл.36). Из полученных данных следует, что вещество Ш содержит свободные гидрокеильные группы при Сг,, С и С , метоксильную группу в положении Gg , углеводный компонент - глюкозу при Gg.
Активность суммарных препаратов из плодов и листьев облепихи Западного Памира
Фармакологическому скринингу были подвергнуты суммарные препараты флавоноидов из листьев облепихи (условный шифр СФЛ) и плодов облепихи (условный шифр СФО). Суммарный препарат флавоноидов из листьев облепихи (СФЛ) - - медообразная масса зелено-коричневого цвета, прекрасно раствори ма в воде. Препарат вводили в виде 1-10% растворов, которые гото вили ex tempore . Суммарный препарат флавоноидов из плодов облепихи (СФО) представляет собой массу, напоминающую по консистенции сухой экстракт красно-коричневого цвета. Практически не растворим в воде. Препарат вводили перорально, внутрибрюшинно и внутривенно в виде 1-10% гомогенной взвеси на 0,5-1% крахмальном клейстере. Во всех сериях взвесь готовили ex tempore . При пероральном введении изучаемых препаратов в дозах 500- - 2500 мг/кг массы животного не отмечали изменений в поведенческих реакциях, были сохранены все рефлексы и нормальная нервно-мышеч ная возбудимость. Максимально переносимой дозой была доза 2500 мг/кг. Согласно классификации токсичности веществ, при введении пд кожу и в брюшную полость такие препараты считаются практичес ки не токсичными. Внутривенное введение СФЛ и СФО в дозах 10-25-50 мг/кг вызывало снижение артериального давления. Действие препаратов начиналось через 10-15 сек после введения и быстро нарастало. Степень гипотензивной активности возрастала с увеличением доз. Снижение артериального давления продолжалось от 15 до 30 мин, затем восстанавливалось до нормы. Частота и амплитуда сердечных сокрщений и дыхательных движений при этом не изменялись. Проведенные эксперименты на изолированных отрезках кишки крыс показали, что СФЛ и СФО даже в концентрациях I 10 не оказывали влияния на повышенный тонус изолированного кишечника крыс. Это свидетельствует о том, что оба препарата не обладают спазмолитической активностью. Оба суммарных препарата вызывают у животных в дозах 5-Ю мг/кг торможение секреции желчи продолжительностью до трех часов. При выявлении противовоспалительной активности обоих суммарных препаратов исследованиями установлено, что введение (Ж) и (Ж в дозах 10-25 мг/кг не оказывает влияния на развитие формалинового отека. С увеличением дозы до 100 мг/кг оба суммарных препарата ослабляют интенсивность развития формалинового воспалительного отека.
Однако, по силе противовоспалительного эффекта изученные препараты уступают бутадиону. Таким образом, на основании проведенных экспериментов установлено, что суммарные препараты флавоноидов из листьев и плодов облепихи относятся практически к нетоксичным веществам, обладают гипотензивным и противовоспалительным эффектами. Фармакологическому изучению была подвергнута неомыляемая фракция облепихового масла. Через два месяца после лечения неомыляемой фракцией в области ожоговой раны отмечается полная эпителизация. Эпителиальный пласт утолщен, под эпителиальным слоем появляются новообразованные дериваты кожи, в частности, хорошо выражены волосяные луковицы, в отличие от групп контрольных животных, на которых проводилось лечение подсолнечным маслом, маслом облепихи Бий-ского витаминного завода, а также пальмитатом и олеатом J3 -сито-стерина и их смесью. Примечание. ПМР-спектры сняты и расшифрованы в Институте химии АН Тадж.ССР к.х.н., с.н.с.Исобаевым М.Д. ИК-спектры сняты и расшифрованы в Институте химии АН Тадж.ССР к.х.н., сн.с. Григиной И.Н. Фармакологические исследования проводились в лаборатории фармакологии в Институте химии АН Тадж.ССР под руководством профессора Хайдарова К.Х. Индивидуальность выделенных из облепихи веществ проверялась на хроматографической бумаге марки "Ленинградская средняя". В работе были использованы следующие системы: А - 1 уксусная кислота; Б - 60% уксусная кислота; В - н-бутанол:уксусная кислота:вода = 4:1:5; Г - пиридин:бутанол:вода = 6:4:3. Проявителями служили: 1% спиртовый раствор хлористого алюминия; 1% спиртовый раствор хлористого цирконила; пары аммиака. Образцы для анализа перекристаллизовывались в этиловом спирте и предварительно сушились при 50-60 над пятиокисью фосфора в течение 8-Ю час.
Температура плавления определялась на столике Боэтиуса. Для доказательства строения выделенных веществ были использованы физико-химические методы анализа: Ж - спектры сняты на спектрометре ив-20 , в таблетках из бромистого калия; УФ - спектры регистрировались на приборе Specord VIS ; оптическая плотность определялась на-ФЭК-56 и VSU-2; ПМР - спектры снимались на приборе В-487 "с" фирмы Tesla с рабочей частотой 80 мгц в растворе четыреххлористого углерода; оптическое вращение полученных веществ определено, на поляриметре Їегкіп-Elmer. Растворители готовили следующим образом: I. Хлороформ промывали дистиллированной водой в отношении 2:1, высушивали с помощью сернокислого натрия и перегоняли. Хранили в темной посуде; 2. Петролейний эфир очищали встряхиванием с концентрированной серной кислотой. После отделения серной кислоты петролейний эфир промывали насыщенным раствором перманганата калия в 10%-ной серной кислоте до исчезновения окраски водного слоя. Затем петро-лейный эфир промывали водой, сушили над хлористым кальцием, перегоняли и хранили над металлическим натрием; 3. Для очистки серного эфира от перекисей к 500 мл эфира добавляли 50 мл 4%-го раствора перманганата калия и 5 мл 40%-го раствора едкого натра или едкого калия. Смесь встряхивали и оставляли на сутки в защищенном от света месте. Затем смесь переносили в делительную воронку, нижний слой сливали, а эфир промывали 5-6 раз дистиллированной водой. Затем эфир обезвоживали в течение суток и перегоняли; 4. Абсолютированный спирт приготовляли добавлением к 500 мл спирта 80 г безводного медного купороса. Колбу несколько раз встряхивали и нагревали на водяной бане с обратным холодильником до тех пор, пока осадок не принимал светло голубую окраску. После отделения осадка спирт перегоняли; 5. Метанол для УФ-спектроскопии готовили следующим образом: кипятили над магниевой стружкой один час. Спирт перегоняли, собирали фракцию, кипящую при 63С. Процент влажности облепихи определяли высушиванием навески свежих плодов в вакуумном сушильном шкафу при 50-60G и давлении 90 мм рт ст до постоянного веса. Средний процент влажности определяли из 3-х навесок по 50 г. Содержание масла в плодах облепихи определяли по весу обезжиренного остатка после экстрагирования навески в аппарате Сокслетта серным эфиром в течение 24 часов. Средний процент мае-личности определяли из трех навесок по 10 г. Количественное определение флавоноидовв листьях и плодах велось по Вильсону С. в модификации Гусева А.Р. и Не-стюк М.Н. ЇІ29І .
