Содержание к диссертации
Введение
1. Интерференция РНК и ее применение в молекулярной биологии 9
1.1. Феномен интерференции РНК 9
1.2. Предлагаемые модели молекулярного механизма интерференции РНК 12
1.3. Особенности протекания процесса интерференции РНК в клетках млекопитающих 23
1.4. Роль интерференции РНК в жизнедеятельности клетки 29
1.5. Характеристика систем осуществления интерференция РНК в клетках высших эукариот 33
1.5.1. Химический синтез 35
1.5.2. Транскрипция in vitro 36
1.5.3. Получение интерферирующих РНК с помощью фермента Diser .37
1.5.4. Экспрессионные векторы 39
1.6. Примеры использования интерференции РНК в молекулярной биологии 45
2. Генетический "нокдаун" протимозина альфа человека методом интерференции РНК 51
2.1. Осуществление протимозин альфа-специфичной интерференции РНК в клетках человека 53
2.1.1. Конструирование плазмид для осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа в клетках человека 54
2.1.2. Оптимизация условий интерференции РНК протимозина альфа 58
2.2. Доказательства осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа методом интерференции РНК 65
2.2.1. Оценка снижения количества мРНК протимозина альфа в клетках HeLa, трансфицированных pSuperRNAi-ProTa 65
2.2.2. Специфичность использованных интерферирующих РНК 67
2.2.3. Оценка снижения экспрессии гена протимозина альфа на уровне белкового продукта 69
2.3. Специфичность эффекта снижения экспрессии гена протимозина альфа 79
2.4. Исследование участия протимозина альфа в ответе клетки на окислительный стресс 80
3. Экспериментальная часть 86
3.1. Используемые штаммы микроорганизмов, клеточные линии и реактивы 86
3.2. Используемые методы 88
3.3. Манипуляции с клетками млекопитающих 93
3.4. Конструирование плазмид 102
Выводы 105
- Предлагаемые модели молекулярного механизма интерференции РНК
- Химический синтез
- Доказательства осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа методом интерференции РНК
- Используемые методы
Введение к работе
Одной из наиболее интересных и сложных для решения задач в области молекулярной биологии является изучение функции генов. Появление всего лишь нескольких мутаций в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего, например, белок, вовлеченный в процесс регуляции деления клеток, может дать начало росту злокачественной опухоли. Поэтому изучение функции генов важно не только в связи с возможными фундаментальными открытиями, но также существенно для создания подходов, позволяющих воздействовать на биологические функции, например, подавлять рост опухоли или размножение вируса. К настоящему моменту некоторые гены достаточно полно охарактеризованы на молекулярном уровне -известны их полные нуклеотидные последовательности, известно какой белок они кодируют, как этот белок взаимодействует с другими белками. Но, несмотря, на это чаще всего детальные сведения об участии этих генов в тех или иных клеточных процессах и механизмах их регуляции чрезвычайно скудны. А функцию большинства генов генома еще только предстоит выяснить.
Путь от обнаружения гена к выяснению его функции сложен. Определение функции какого-либо гена в клетке и соответственно кодируемого этим геном белка основано на использовании методов молекулярной биологии, генетики и биохимии. В число этих методов входит, например, направленный мутагенез и его частный случай - "нокаут". Еще один способ понять, какую функциональную значимость несет тот или иной белок в клетке - это поиск его молекулярных партнеров. Искать
белки, взаимодействующие с исследуемым белком, позволяет мощный и широко используемый метод двугибридной системы. Этот список может продолжить открытое не так давно явление интерференции РНК, позволяющее осущертвить в клетке процесс генетического "нокдауна", т.е. специфически подавить уровень экспрессии избранного гена-мишени, но не выключить его работу полностью. Таким образом, интерференция РНК дает возможность изучать функцию жизненно важных для клетки генов, для которых генетический "нокаут" не может быть применим, так как в этом случае нокаутированные клетки будут нежизнеспособны.
Настоящая работа посвящена использованию явления
интерференции РНК для осуществления "нокдауна" гена
протимозина альфа. Протимозин, альфа является
высококонсервативным, жизненно важным белком. Это ядерный мультикопийный белок с молекулярной массой 13 кДа. Его первичная структура содержит половину остатков глутаминовой и аспаргиновой аминокислот. Протимозин альфа не имеет каких-либо элементов вторичной и третичной структуры [1]. Несмотря на значительное количество накопившихся к настоящему времени экспериментальных данных, касающихся возможной роли этого белка в жизни клетки, механизм его действия неизвестен. Было показано, что этот белок важен для процесса клеточного деления. Совсем недавно в нашей лаборатории было установлено, что протимозин альфа имеет на С-конце сигнал для узнавания каспазами-3 и -7 и является антиапоптотическим белком. Кроме того, посредством дрожжевой двугибридной системы был обнаружен один из молекулярных партнеров протимозина альфа. Им оказался белок Keapl - репрессор активатора транскрипции генов ответа на окислительный стресс Nrf2. Приведенные данные указывают на то, что протимозин альфа может выполнять в
организме несколько функций, т.е. он является белком многоцелевого назначения.
Цель данной работы заключалась в отработке метода интерференции РНК протимозина альфа в клетках человека. Используя этот метод, мы также попытались пролить свет на возможную роль протимозина альфа в механизме ответа клетки на окислительный стресс. Эти исследования,'несомненно, важны для понимания основных регуляторных путей молекулярного механизма защиты клетки от окислительного стресса, нарушение которых тем или иным образом может оказаться губительным для клетки. Детали же участия протимозина альфа в процессе регуляции ответа клетки на окислительный стресс, а также его возможное участие в других важных клеточных процессах, очевидно, еще только предстоит выяснить.
Предлагаемые модели молекулярного механизма интерференции РНК
Индукция генетического молчания в ответ на введение в клетку двуцепочечных РНК происходит на нескольких уровнях. Первые эксперименты на Caenorhabditis elegans указывали, на пост-транскрипционный уровень подавления экспрессии идентичных генов посредством дцРНК [10]. В этих работах введение в клетку искусственно синтезированных дцРНК, последовательность которых идентична участкам интронов информационных РНК, не оказывала никакого влияния на их экспрессию [11]. Подавление наблюдалось только в том случае, если последовательность таких дцРНК была идентична участкам кодирующей части матрицы-мишени, и сопровождалось резким снижением количества данной мРНК в клетке. Аналогично, в растительных клетках введение дцРНК, например в форме вируса, индуцировало утрату идентичной мРНК без заметного влияния на скорость транскрипции. Кроме того, происходила деградация самих вирусных транскриптов, которые синтезировались в цитоплазме путем транскрипции РНК-геномов [12]. Все эти исследования привели к выводу, что двуцепочечная РНК индуцирует нуклеазную деградацию идентичной мРНК. Эта гипотеза в дальнейшем была подтверждена биохимическими исследованиями. Но следует отметить, что существуют и другие механизмы влияния дцРНК на экспрессию генов [13,14,15]. В растениях дцРНК индуцирует метилирование идентичных промоторных областей хромосомной ДНК, что приводит к подавлению транскрипции данного гена. В дальнейшем было показано, что дцРНК также может влиять на экспрессию генов на уровне структуры хроматина в клетках Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster и грибов. Наконец, в геноме Caenorhabditis elegans закодированы так называемые микро-РНК, созревание которых происходит с помощью того же биохимического механизма, что и интерференция РНК [16]. При этом образуются короткие РНК, регулирующие экспрессию генов на уровне трансляции. Однако, в рамках настоящего обзора подробно будет рассмотрен только пост-транскрипционный уровень влияния дцРНК на экспрессию генов. Ключевым для понимания механизма интерференции РНК стали эксперименты, в которых было показано, что добавление дцРНК к бесклеточным экстрактам эмбрионов дрозофилы подавляет трансляцию идентичной мРНК, и это коррелирует с t деградацией данной мРНК [17,18,19]. Возникла гипотеза, что дцРНК индуцирует образование нуклеазного комплекса, специфически расщепляющего идентичную мРНК. Этот куклеазный комплекс, сейчас известный как RISC (от англ. RNA-Induced Silencing Complex), в последующих работах был выделен из бесклеточного экстракта дрозофилы [20, 21]. Возникает вопрос: как RISC узнает свой субстрат? Еще Мелло и коллеги предположили, что какое-то производное дцРНК может участвовать в узнавании идентичной мРНК посредством комплементарных взаимодействий.
Позднее в клетках растений, содержащих супрессированный трансген, были обнаружены короткие РНК длиной приблизительно 21 нуклеотидный остаток, которые были идентичны генам, подверженным ко-супрессии. Подобные короткие РНК были обнаружены и в процессе индуцированного вирусами генетического молчания в клетках растений [22]. Аналогичные малые РНК образовывались из дцРНК в экстрактах эмбрионов дрозофилы, и в процессе частичной очистки комплекса RISC оказалось, что они со-очищались с нуклеазной активностью. На основании этих и последующих экспериментов возникла следующая модель интерференции РНК. На первом этапе происходит узнавание дцРНК ферментом Diser, который превращает ее в малые РНК длиной 21-25 нуклеотидных остатков, так называемые siRNA (от англ. small interfering RNA). Входя в состав нуклеазного комплекса RISC, siRNA с помощью комплементарных взаимодействий опознает идентичную мРНК, в результате чего происходит ее нуклеазная деградация [23]. Основные этапы механизма интерференции РНК отражены на рисунке 1. Структуру siRNA определили, выделив их из клеток [24]. Установлено, что это короткие РНК размером 21-28 нуклеотидов (у млекопитающих 21-23 нуклеотида). Их характерной особенностью является то, что в отличие от всех остальных клеточных РНК и многих микро-РНК, состоящих из одной цепи нуклеотидов, данные РНК являются двуцепочечными. Эти РНК имеют выступающие 3 "концы длиной в два нуклеотида, и в ряде работ было показано, что такое строение важно для эффективного подавления уровня синтеза белка-мишени. На своем 5 -конце siRNA содержат фосфатную группу, а на 3-конце свободную гидроксильную группу. Посредством флуоресцентно меченых интерферирующих РНК и флуоресцентной микроскопии установлено, что после проникновения в клетки накопление siRNA происходит в цитоплазме в области мембраны ядра или рядом с ядерными порами [25]. Предполагается, что интерферирующие РНК концентрируются вокруг ядерных пор и как бы сканируют молекулы мРНК, транспортирующиеся в цитоплазму.
Когда специфичная мРНК мишень найдена, то она незамедлительно подвергается деградации. Также следует отметить тот факт, что все найденные на сегодняшний день немногочисленные белки-участники интерференции РНК локализованы преимущественно в цитоплазме. Кроме того, только цитоплазматические экстракты клеток HeLa проявляли RISC-активность, а в ядерных экстрактах этих клеток активность не была обнаружена. Исходя из перечисленных выше экспериментальных данных, можно утверждать, что основные события интерференции РНК протекают в цитоплазме. На сегодняшний момент найден ключевой белок интерференции РНК [26,27]. Им оказалась РНКаза Diser. При этом для дрозофилы, в отличие от клеток нематоды и человека, найдено две изоформы этого белка (DCR1 и DCR2) [28]. Белок Diser входит в так называемое РНКаза Ш-подобное семейство белков. Сама РНКаза III была выделена и впервые охарактеризована для клеток E.Coli [29]. Это высоко консервативный белок, присутствующий во всех организмах и ответственный за процессинг рибосомальных РНК и тРНК. Известно три класса РНКаза Ш-подобных семейств [30]. Первый класс включает белки, найденные в бактериях и дрожжах, обладающие одним высоко консервативным доменом с РНКазной активностью и доменом, ответственным за связывание дцРНК. Характерной особенностью белков, входящих во второй класс, является наличие в их составе одного домена на С-конце, ответственного за связывание молекул дцРНК, а также двух доменов, обладающих РНКазной активностью. Третий класс белков, помимо упомянутых выше мотивов, обладает дополнительным хеликазным доменом, расположенным на N-конце, и PAZ доменом. РНКаза Diser является членом третьего класса РНКаза Ш-подобного семейства. Клонирована и наиболее полно охарактеризована человеческая РНКаза Diser [31]. Это белок с молекулярным весом 218 кДа. Было показано, что дцРНК-связывающий домен и два рибонуклеазных мотива RJIIa (ERLEMLGDS) и Rlllb (QRLEFLGDA) находятся на С-конце, а на N-конце локализованы PAZ домен и хеликазный домен, внутри которого найдены АТР-связывающий мотив и DECH box мотив. Считается, что роль хеликазного домена может состоять в расплетании дуплекса дцРНК или в регуляции образования интерферирующих РНК. Продуктами РНКазной активности этого фермента являются дцРНК длиной 21-23 нуклеотида с 3 -выступающими концами. Для проявления РНКазной активности in vitro, как было показано, необходимы ионы Mg2+ и не нужны молекулы АТР, а для образования комплекса с дцРНК требуются высокие концентрации КС1. Локализована человеческая РНКаза Diser в эндоплазматическом ретикулуме [32]. Согласно описанной выше модели, белку Diser отведена роль в производстве малых интерферирующих РНК [33]. Для дрозофилы, Caenorhabditis elegans, растений, а также некоторых клеточных линий высших эукариот было показано, что введение в клетки длинных молекул дцРНК (размером 200-500 нуклеотидов) приводит к накоплению в клетках через определенное время характерных для белка Diser продуктов расщепления (малых интерферирующих РНК), а если ген РНКазы Diser инактивирован, то малые РНК не образуются и процесс интерференции РНК не происходит [26].
Химический синтез
Первые эксперименты по использованию интерференции РНК для подавления уровня экспрессии генов-мишеней были связаны с использованием молекул siRNA, полученных химическим синтезом [95]. Tuschl Т. и коллеги провели с использованием химически синтезированных дцРНК ряд исследований по влиянию на эффективность блокирования гена-мишени структурных особенностей siRNA, а именно ее нуклеотидной последовательности, введение в состав дцРНК модифицирующих групп, влияние длины 3 -выступающих концов. В настоящее время для дизайна интерферирующих РНК рекомендуется, чтобы состав GC пар интерферирующих РНК, составлял 50-70%, такие РНК должны содержать 3-выступающие концы длиной 2 нуклеотидных остатка. Было замечено, что наиболее эффективны siRNA с двумя остатками уридиновой кислоты на 3 концах. Также было обнаружено, что введение вместо в качестве нуклеотидов остатков уридиновой кислоты двух остатков дезокситимидиновой кислоты на 3-концы дцРНК увеличивает эффективность их действия, что может объясняться более высокой устойчивостью модифицированных дцРНК действию клеточных нуклеаз. Следует отметить, что метод химического синтеза дцРНК, как и всякий другой метод, имеет свои преимущества и явные недостатки, К плюсам данного подхода в получении молекул дцРНК для блокирования соответствующих мишеней можно отнести возможность использования для введения в клетку интерферирующих РНК высокой степени очистки и высоких концентраций. Кроме того, с помощью химического синтеза в последовательность интерферирующих РНК можно вводить любые заданные модификации, делая, к примеру, такие молекулы более липофильными и облегчая тем самым их проникновение в клетку. Химический синтез, как уже упоминалось выше, позволяет также вводить модификации, защищающие дцРНК от действия клеточных нуклеаз и, таким образом, увеличивать эффект их действия в клетке [94]. Но наряду с перечисленными выше достоинствами явными минусами этого подхода осуществления интерференции РНК является высокая стоимость и сложность получения таких препаратов РНК по сравнению, например, с созданием векторов для экспрессии дцРНК. 1.5.2. Транскрипция in vitro Альтернативой химическому синтезу молекул интерферирующих РНК может служить метод, основанный на Т7 транскрипции [96,97]. Схема получения молекул дцРНК при помощи Т7 транскрипции отражена на рисунке 4. В данном случае исходным материалом для получения двуцепочечных РНК служат молекулы двух дезоксиолигонуклеотидов, один из которых кодирует последовательность антисмысловой РНК, комплементарной соответствующей мРНК выбранного гена- мишени, а другой содержит информацию о смысловой РНК, идентичной мРНК данного гена.
Каждый из дезоксиолигонуклеотидов помимо этого содержит в своем составе на 5-конце последовательность из 8 нуклеотидных остатков, комлементарную Т7 промотору. С помощью Т7 промоторного праймера и ПЦР проводится достройка второй цепи, а Т7 ДНК-зависимая РНК-полимераза позволяет наработать in vitro соответствующие транскрипты антисмысловой и смысловой РНК. Следующим этапом является их очистка и гибридизация с целью получения желаемых молекул дцРНК. Отличительными особенностями данного метода является простота, более низкая стоимость и быстрота получения препаратов интерферирующих РНК по сравнению с химическим синтезом. Еще одним методом получения молекул интерферирующих РНК in vitro является подход, основанный на использовании РНКазной активности белков Diser или бактериальной РНКазы III [98,99,100,101]. В этом случае метод получения интерферирующих РНК состоит в расщеплении больших по размеру дцРНК соответствующими ферментами с образованием так называемых esiRNA (от англ. endoribonuclease-prepared siRNA). На настоящий момент данные белки клонированы и достаточно полно охарактеризованы. Для реализации данного подхода необходимо иметь функционально активные Diser или бактериальную РНКазу III, а также молекулы длинных дцРНК, идентичных выбранной матрице гена-мишени. Длинные молекулы дцРНК можно синтезировать химически или использовать транскрипцию in vitro. Во втором случае ДНК-вставку клонируют в вектор, кодирующий с обеих сторон от сайта клонирования последовательности ТЗ или Т7 промоторов. Следующим шагом является линеаризация полученной плазмиды и синтез соответствующих РНК продуктов транскрипцией in vitro.
Транскрипты содержат смысловую и антисмысловую РНК, которые в конечном итоге будут образовывать двуцепочечную РНК. Такие молекулы служат хорошим субстратом для белков Diser или бактериальной РНКазы III. В случае бактериальной РНКазы III, как было показано, продуктами ферментативной активности являются молекулы дцРНК длиной 15 нуклеотидных остатков [99]. Было установлено, что такие более короткие siRNA также активны в клетках высших эукариот. С помощью дцРНК, полученных таким способом, удалось снизить уровень экспрессии как экзогенных, так и эндогенных белков в клетках млекопитающих. Отличительной особенностью данного подхода является возможность быстрого синтеза целого набора молекул интерферирующих РНК, идентичных выбранной мРНК-мишени. Введение в клетку нескольких разных молекул siRNA может привести к более эффективному блокированию экспрессии гена-мишени. Кроме того, этот подход избавляет экспериментатора от длительной процедуры отбора наиболее эффективно работающих молекул siRNA. Однако нельзя не отметить, что метод имеет существенный недостаток. Для обеспечения специфического снижения уровня экспрессии гена-мишени основным требованием является отсутствие идентичности последовательностей введенных в клетку дцРНК нуклеотидным последовательностям других матричных РНК. Введение же в клетку смеси интерферирующих РНК, в которой могут содержаться дцРНК, идентичные не только выбранному гену - мишени, но и другим клеточным генам, может способствовать утрате специфичности интерференции РНК. Кроме того, этот способ, как и описанные выше метод химического синтеза и транскрипции in vitro, не дает возможности получения стабильных клеточных линий со сниженным уровнем экспрессии гена-мишени. 1.5.4. Экспрессионные векторы Другим способом осуществления интерференции РНК в клетках высших эукариот служит группа методов, основанная на использовании особого класса векторов, позволяющих синтезировать дцРНК за счет клеточных ферментов [102,103]. Отличительной особенностью этих векторов является то, что ДНК вставка, кодирующая специфичные гену-мишени дцРНК, находится под контролем промотора РНК-полимеразы III. Такой выбор обусловлен способностью РНК-полимеразы III синтезировать в клетке короткие молекулы РНК без полиаденилирования, размер которых ограничивается последовательностью ДНК, состоящей из 4-5 тимидиновых нуклеотидов. Таким образом, можно синтезировать молекулы РНК строго определенной длины. В качестве промоторов РНК-полимеразы III для осуществления интерференции РНК используются HI или U6. Известно, что с HI промотора в клетке синтезируется короткая РНК, входящая в состав рибонуклеопротеидного комплекса РНКазы Р и участвующая в процессинге предшественников тРНК [104J. С помощью U6 промотора синтезируется U6 малая ядерная РНК, являющаяся компонентом сплайсосом [105]. При этом следует отметить, что векторы с U6 промотором можно разделить на три типа - U6, U6+1 и U6+27. В векторах типа U6+1 после нуклеотидной последовательности самого промотора следует первый нуклеотидный остаток, соответствующий транскрипту U6 малой ядерной РНК. Введение после U6 промотора остатка гуанидиновой кислоты в +1 положении объясняется более эффективной инициацией транскрипции в этом случае.
Доказательства осуществления генетического "нокдауна" протимозина альфа методом интерференции РНК
При интерференции РНК снижение экспрессии гена-мишени происходит на пост-транскрипционном уровне, за счет направленного гидролиза соответствующей мРНК [17]. Подавление экспрессии гена протимозина в клетках линии HeLa, трансфицированных соответствующими векторами, исследовали с помощью блот-гибридизации РНК. Эксперимент строился следующим образом. Клетки линии HeLa трансфицировали вектором pSuperRNAi-ProTa по схеме, описанной выше. В качестве контроля использовали клетки, трансфицированные пустым вектором pSuper, не экспрессирующим двуцепочечные РНК. После процедуры двойных трансфекций клетки лизировали и выделяли из них суммарную РНК. Суммарную РНК, выделенную из трансфицированных клеток, разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле, переносили на мембрану Hybond N+ и гибридизовали с радиоактивно меченым зондом, специфичным к мРНК протимозина альфа. Для нормировки количества выделенной суммарной РНК использовали также радиоактивно меченый зонд, специфичный к мРНК /3-актина. После гибридизации с протимозин альфа-специфичным зондом мембрана разгибридизовывалась и повторно использовалась для гибридизации с зондом к мРНК /3-актина. Радиоавтограф получали с помощью прибора "Phosphorlmager", обсчет проводился посредством программы Image Quant 5.0. Результаты экспериментов по б лот-гибридизации РНК, представлены на рисунке 12. Радиоавтограф (А) и количественный обсчет (Б), приведенные на рисунке 12, иллюстрируют, что в ответ на введение в клетки HeLa генетической конструкции для осуществления протимозин альфа-специфичной интерференции РНК наблюдается уменьшение количества мРНК протимозина альфа примерно в 2 раза по сравнению с контрольными клетками, при этом количество мРНК jS-актина не меняется. Уже на данном этапе наших исследований можно сделать вывод, что сконструированная нами экспрессионная плазмида pSuperRNAi-РгоТа позволяет осуществить в клетках человека протимозин альфа-специфичную интерференцию РНК. Из литературных данных известно, что процесс интерференции РНК отличается высокой специфичностью. Введение в последовательность интерферирующих РНК точечных замен в некоторых случаях способно снимать эффект подавления экспрессии гена-мишени полностью [102]. Для того, чтобы продемонстрировать специфичность наблюдаемых эффектов снижения количества мРНК протимозина альфа, нами были получены две генетические конструкции, позволяющие экспрессировать в клетках человека два типа мутантных интерферирующих РНК, последовательность которых не полностью идентична соответствующему участку мРНК протимозина альфа.
Введенные замены указаны в таблице 3. В нуклеотидную последовательность одного из мутантов вводилась одна точечная замена, а другой мутант содержал четыре замены в своей нуклеотидной последовательности. Замены вводились нами исходя из литературных данных. Известно, что в ходе реализации механизма интерференции РНК гидролиз мРНК гена-мишени происходит строго в середине участка комплементарных взаимодействий между антисмысл овой цепью siRNA и соответствующего участка мРНК гена-мишени [50]. Мутации вводились нами именно в эти положения. На рисунке 13 представлены результаты РНК блот-гибридизации, свидетельствующие о неспособности мутантных интерферирующих РНК подавлять экспрессию гена протимозина альфа на уровне его мРНК. Протимозин альфа относится к числу не только мультикопийных, но и чрезвычайно стабильных белков. Поэтому мы задались вопросом: происходит ли снижение количества этого белка в ответ на введение соответствующей генетической конструкции? Для ответа на этот вопрос мы использовали метод электрофоретического анализа препаратов частично очищенного протимозина альфа. В силу того, что протимозин альфа является чрезвычайно кислым белком, он в отличие от других белков, при фенольной экстракции лизатов клеток переходит в водную фазу и совыделяется с нуклеиновыми кислотами [154]. Схема проведения ! эксперимента приведена на рисунке 14. Полученные таким способом препараты протимозина альфа, частично очищенного из клеток, трансфицированных плазмидой pSuperRNAi-ProTce и клеток, трансфицированных пустым вектором pSuper, анализировали в 8% денатурирующем ПААГ.
Для нормировки количества частично очищенного протимозина альфа использовалась тРНК, совыделяемая с этим белком. Рисунок 14 иллюстрирует снижение количества протимозина альфа в экспериментальных клетках по сравнению с контрольными. А. Схема выделений протимозина альфа Кроме того, на рисунке 14Б приведены результаты электрофоретического анализа препаратов частично очищенного протимозина альфа, полученного из клеток, трансфицированных конструкцией pU6+27RNAi-ProTa. Вектор на основе промотора U6+27 давал сравнимые результаты снижения количества протимозина альфа по сравнению с вектором на основе HI промотора, по этой причине все дальнейшие эксперименты проводились нами с использованием вектора на основе HI промотора. Следует отметить, что в силу нестабильности окрашивания протимозина альфа метиленовым синим, количественную оценку снижения уровня этого белка сделать не удается. Другим, более количественным методом оценки уровня экспрессии гена протимозина альфа, использованным в нашей работе, явился иммуноферментный анализ протимозина альфа в лизатах клеток HeLa. Для осуществления этого анализа нами использовались моноклональные антитела к двум разным эпитопам протимозина альфа, одни из которых было биотинилированых [155]. Схема эксперимента изображена на рисунке 15. На подложку сорбировались моноклональные антитела 2F11, узнающие в протимозине альфа эпитоп в области с 1 по 31 аминокислоту. Затем сорбированные антитела инкубировали с лизатами клеток, трансфицированных соответствующими плазмидами. Не связавшиеся белки удаляли. Следующим этапом являлось взаимодействие с биотинилированными моноклональными антителами 4F4 к С-концевой части протимозина альфа, узнающими в протимозине альфа эпитоп в области с 52 по 89 аминокислоту. Заключительной стадия состояла в образование комплекса биотина с коньюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена. Субстратом для пероксидазы хрена служила смесь пероксида водорода и ортофенилендиамина. Пероксидаза детектировалась колориметрически - поглощение света измеряли при длине волны 492 нм. Для оценки результатов иммуноферменного анализа поступали следующим образом. Первоначально уравнивали концентрации суммарного белка в лизатах клеток, взятых для иммуноферментного анализа. Для нормировки нами использовался метод Бредфорда, позволяющий измерить суммарную концентрацию белка в каждом из лизатов. На всех графиках приведены результаты ИФА лизатов клеток, для которых проводилось предварительное уравнивание по Бред форду. Для каждого из лизатов клеток строили концентрационные кривые в координатах Д492 (поглощение при 492 нм) - v (величина, обратная разведению лизата). На рисунке 16 приведены примеры двух концентрационных кривых, полученных для лизатов клеток, трансфицированных пустым вектором (Sb контрольные клетки) и вектором для экспрессии протимозин альфа-специфичных интерферирующих РНК (Rj, опытные клетки). Из рисунка 16 видно,
Используемые методы
Центрифугирование препаратов проводили на центрифуге 5415С фирмы Eppendorf. Высушивание образцов проводили на приборе " Speed-Vac Concentrator (Savant). Электрофорез проводили с использованием источников постоянной мощности: "LKB-2297" и 14173-2000-0.24 \ Для измерения оптической плотности использовали спектрофотометр HITACHI 200-20. Визуализацию радиоактивных полос на нейлоновой мембране и обсчет данных проводили при помощи прибора Molecular Dynamics Phosphorlmager SI (США), используя компьютерную программу Image Quantum 5.0. Для получения микроскопических фотографий использовали инвертированный флуоресцентный микроскоп Zeiss Axiovert200M Приготовление компетентных клеток E.coli [159] В 250 мл среды SOB скалывали 10-12 колоний E.coli штамма JM109 с чашки Петри (SOB+arap). Клетки растили при 18С до А600 -0.6. Инкубировали их 10 мин во льду, центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 мин при 4С, суспендировали в 80 мл буфера ТВ, охлажденном до 0С, и инкубировали 10 мин во льду. После центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10 мин при 4С, клетки суспендировали в 20 мл ТВ (0С). Добавляли ДМСО до 7%, инкубировали во льду 10 мин. Разносили аликвоты в стерильные пробирки, замораживали в жидком азоте и хранили при -70С. К 100 мкл компетентных клеток, предварительно размороженных во льду, добавляли 5мкл лигазной смеси. Инкубировали 30 мин во льду, затем 30 сек при 42С и 2 мин при 0С. Добавляли 900 мкл среды SOC и инкубировали 1 час при 37С и интенсивной аэрации. Затем 100 мкл смеси клеток втирали в чашки Петри с SOB-агаром и инкубировали при 37С в течение 16-18 часов. Составы сред, использующихся при приготовлении компетентных клеток, трансформации и культивировании клеток E.coli штамма JM-109: Все стандартные манипуляции с ДНК (выделение из клеток E.coli, гидролиз эндонуклеазами рестрикции, лигирование, клонирование и фракционирование в агарозном геле) проводили по стандартным методикам [160]. Во всех генно-инженерных манипуляциях использовали штамм E.coli JM109. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля. Элюцию фрагментов ДНК из агарозных гелей проводили с помощью набора фирмы QIAGEN [161].
Секвеннрование ДНК по Сэнгеру. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводилось на сверхспирализованной плазмидной ДНК по методике [162] с использованием модифицированной ДНК-полимеразы фага Т7. Для радиоактивного мечения использовали [a- P]dATP. Фракционирование продуктов проводили с помощью электрофореза в 6% акриламидном геле, с соотношением акриламида и Ы,К%-метиленбисакриламида 20:1, содержащем 7М мочевину, при 50-80 Вт. После электрофореза гель фиксировали в растворе, содержащем 10% уксусную кислоту и 10% этиловый спирт, переносили на бумагу, высушивали и радиоавтографировали. Фракционирование белков с помощью системы Лэммли Фракционирование проводили по стандартной методике [163] в ПААГ. Перед нанесением на гель добавляли к образцам буфер Лэммли и инкубировали в течение 3 мин при 100С. Гели прокрашивали раствором кумасси G-250 в течение 1 часа при покачивании, а затем отмывали. 5хбуфера Лэммли: 15%р-МЭ 15%SDS 1.5% ВРВ 50% глицерин Раствор кумасси G-250: 0,25% кумасси G-250 45% этанол 10% уксусная к-та Краситель кумасси G-250 растворяли при помешивании в течение 1 часа, после чего раствор фильтровали через бумажный фильтр. Раствор для отмывки: 30% этанол 5% уксусная кислота йммуноблоты Наносили на гель системы Лэммли одинаковые количества белковых экстрактов (50-200 мкгПосле проведение электрофореза гель инкубировали в течение 10 мин в буфере TGES и проводили электроперенос белков на нитроцеллю лозную мембрану Protran В А 83 в буфере TGES в течение 2 часов при ЮОмА (10В). После переноса мембрану прокрашивали раствором понсо, промывали водой, помечали дорожки и маркеры молекулярного веса и окончательно отмывали от краски в буфере PBS. Блокировали мембрану инкубацией в смеси 3% молоко/PBS при покачивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем блот инкубировали с первичными антителами, разведенными до нужной концентрации в смеси 3% молоко/PBS, при покачивании и +4С в течение ночи. Промывали мембрану трижды по 5 мин буфером PBS и инкубировали с вторичными анти-мышиными или анти-кроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Amersham), разведенными в 7000 раз в буфере PBS, в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем промывали мембрану три раза по 5 мин буфером PBS. Подсушивали мембрану на листе фильтровальной бумаги и проводили детекцию по стандартной методике (набор ECL, Amersham). Для иммуноблотинга использовали первичные антитела к прокаспазе-3, любезно предоставленные Y.Lazebnik (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY), а также антитела к гистону НІ (АЕ-4), 3-актину (С-2), IkBa(C-21) (Santa Cruz Biotechnology). Клетки лини HeLa или HepG2 выращивали на среде DMEM, содержавшей 10% сыворотки (FBS), при 37С, 5%С02. За день до трансфекции клетки пересевали на чашки диаметром 35 мм в количестве 3x103 и растили в 2 мл среды DMEM с 10% FBS. Для оценки эффективности трансфекции клетки трансфицировали тремя разными способами. В одном из случаев перед трансфекцией среда заменялась новой средой, содержавшей 30% сыворотки; во втором случае такая замена не производилась. И, наконец, в третьем случае среда сливалась перед трансфекцией и к клеткам добавляли 1 мл DMEM без сыворотки. В случае использования в качестве трансфицирующего реагента LF2000 поступали следующим образом. Смешивали 8 мкг экспрессионной плазмиды и 0,2 мкг плазмиды pEGFP-Cl (Promega) в 250 мкл DMEM и разные количества LF2000 в 250 мкл DMEM (см. таблицу 2). Инкубировали 5 мин при комнатной температуре.
После чего к раствору ДНК в DMEM по каплям добавляли раствор LF2000, тщательно перемешивали и инкубировали смесь 20 мин при комнатной температуре. Затем раствор комплекса ДНК и трансфицирующего реагента раскапывался на чашки с клетками. В случае трансфицирования клеток третьим способом спустя 3 часа к клеткам добавляли 500 мкл DMEM с 40% сыворотки. Для осуществления РНК интерференции протимозина альфа использовали третий способ трансфицирования - на чашку диаметром 35 мм бралось 8 мкг экспрессионной плазмиды и 10 мкл LF2000.Кроме того, клетки подвергали двойным трансфекциями. Для этого спустя 48 часов после добавления сыворотки в среду процедуру трансфицирования без добавления сыворотки повторяли вновь. Анализ полученных трансформантов производился спустя 48 часов после второй трансфекции. Трансфекцию клеток Unifectin 56 производили согласно методике производителя [ 164]. Оценка эффективности трансфекции Для получения непермеабилизованных фиксированных клеток и оценки эффективности трансфекции, клетки выращивали на покровных стеклах. Клетки котрансфицировали плазмидой pEGFP-Cl (Promega) и экспрессионной плазмидой тремя разными способами, описанными выше. После процедуры трансфицирования клетки трижды промывали буфером PBS. Всю обработку клеток проводили при +4С. Фиксирование клеток производили 4% ГІФА/PBS в течение 30 минут, после чего клетки трижды промывали холодным PBS. Затем клетки обрабатывали 0,5 М NH4CL/PBS, снова 2 раза промывали холодным PBS. Затем клетки обрабатывали буфером PBS, содержащим пропидий йодид (50 мкг/мл) в течение 30 минут, промывали 3 раза PBS. Стекло с клетками помещали в каплю глицеринЛМ Трис рН 8,9 (9:1) на предметном стекле. Для приготовления ПФА поступали следующим образом. Готовили 8% ПФА в PBS и растворяли его в течение 5-6 часов при +60С. Сток 8% ПФА хранили при -70С. Пред началом фиксации клеток сток разбавляли до концентрации 4% буфером PBS. Все микроскопические фотографии получали с помощью флуоресцентного микроскопа и программы LSM510. Выделение суммарной РНК из клеток HeLa Сливали из чашек среду, промывали клетки раствором Версена. Затем каждую чашку обрабатывали 500 мкл раствора Версена в течение 20 мин при 37С, после чего снимали клетки путем встряхивания. Полученные клеточные суспензии переносили в пробирки для микроцентрифугирования.
