Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Биологические мембраны 9
1.1.1. Состав мембран 9
1.1.2. Структура мембран 12
1.1.3. Трансмембранная и латеральная гетерогенность мембран 15
1.2. Липосомы как модельные мембранные структуры 16
1.3. Биологические мембраны. Хлоропласты и тилакоиды: структура, основные свойства 17
1.3.1. Морфология и структура хлоропласта. Тилакоидные граны 17
1.3.2. Белково-липидный состав мембраны тилакоида 18
1.3.3. Роль катионов в структурной организации хлоропластов 20
1.3.4. Подвижность и упорядоченность молекул в липидной фазе тилакоидной мембраны под действием двухвалентных катионов 21
1.3.5. Ионная регуляция электронного транспорта в хлоропластах 22
1.4. Полиэлектролитные пленки 22
1.4.1. Планарные полиэлетролитные пленки на твердотельных подложках... 23
1.4.2. Полиэлектролитные мультислойные структуры на поверхностях коллоидов 25
1.5. Методы иммобилизации клеток и других биологических объектов 26
1.5.1. Включение клеток в гель 26
1.5.2. Адсорбция клеток на поверхностях твердых носителей 28
1.5.3. Иммобилизация микрокапсулированием 30
1.5.3.1. Методы микрокапсулирования 30
1.5.3.2. Микрокапсулирование ферментов и клеток 34
1.6. Взаимодействие поликатионов с мембранами отрицательно заряженных липосом 37
1.7. Компоненты фотосинтетического аппарата растений в составе полиэлектролит ных пленок и системы экологического мониторинга 42
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Материалы и реагенты 44
2.2. Приготовление спин-меченых образцов 46
2.3. Регистрация спектров ЭПР спиновых зондов 47
2.4. Обработка спектров ЭПР липидорастворимых спиновых зондов n-SASL 47
2.5. Исследование электростатических характеристик тилакоидных мембран в составе комплексов тилакоид/поликатион методом спиновых зондов 50
2.6. Исследование светоиндуцированного электронного транспорта в хлоропластах в составе комплексов тилакоид/поликатион 52
2.7. Получение комплексов тилакоид/полиэлектролит 54
Глава 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Исследование взаимодействия отрицательно заряженных липосом с поликатионами методом спиновых зондов 57
3.1.1. Выбор условий приготовления образцов, содержащих спин-меченые липосомы и поликатионы 57
3.1.1.1. Спектры ЭПР спиновых зондов на основе стеариновой кислоты в мембранах липосом 57
3.1.1.2. Влияние концентрации спинового зонда в суспензии липосом на форму линии сигнала ЭПР спиновых зондов 59
3.1.1.3. Локализация липидорастворимых спиновых зондов в водной суспензии, содержащей липосомы и полиэлектролит 61
3.1.2. Влияние поликатионов на параметры движения спиновых зондов в мембранах липосом, содержащих стеариновую кислоту 62
3.1.2.1. Спектры ЭПР спиновых зондов в мембранах липосом, содержащих стеариновую кислоту, в присутствии поликатионов 62
3.1.2.2. Температурные зависимости параметров движения спиновых зондов в мембранах липосом, содержащих стеариновую кислоту, в присутствии поликатионов 65
3.1.3. Влияние поликатионов на параметры движения спиновых зондов в мембранах липосом, содержащих кардиолипин 67
3.1.3.1. Влияние концентрации поликатионов на параметры движения спинового зонда 5-SASL в мембранах липосом, содержащих кардиолипин 67
3.1.3.2. Влияние поликатиона на спектры ЭПР спиновых зондов в мембранах липосом различных размеров, содержащих кардиолипин... 69
3.1.3.3. Температурные зависимости параметров движения спиновых зондов в мембранах липосом, содержащих кардиолипин, в присутствии поликатионов 70
3.2. Гибридные системы на основе полимерных материалов, включающие биологические компоненты: структура и свойства комплексов тилакоидов и полиэлектролитов 72
3.2.1. Электронно-микроскопическое исследование комплексов тилакоидов и полиэлектролитов 72
3.2.1.1. Планарные комплексы тилакоид/полиэлектролит иммобилизованные на поверхности твердотельной подложки 72
3.2.1.2. Комплексы тилакоид/полиэлектролит в водной фазе 75
3.2.2. Кинетика светоиндуцированных превращений Р700 в комплексах тилакоид/полиэлектролит 77
3.2.3. Исследование структурных характеристик тилакоидных мембран в составе комплексов тилакоид/полиэлектролит методом спиновых зондов... 79
3.2.4. Исследование электростатических характеристик тилакоидных мембран в составе комплексов тилакоид/полиэлектролит методом спиновых зондов... 81
Заключение 84
Выводы 86
Список литературы
- Трансмембранная и латеральная гетерогенность мембран
- Регистрация спектров ЭПР спиновых зондов
- Выбор условий приготовления образцов, содержащих спин-меченые липосомы и поликатионы
- Влияние концентрации поликатионов на параметры движения спинового зонда 5-SASL в мембранах липосом, содержащих кардиолипин
Введение к работе
Исследование физико-химических механизмов взаимодействия полиэлектролитов с биологическими и модельными липидными мембранами на протяжении ряда лет является предметом интенсивных исследований. Выяснение различных аспектов этих молекулярных механизмов необходимо для понимания фундаментальных принципов регуляции структурно-функциональных взаимосвязей в сложных мембранных структурах, и актуально ввиду постоянно растущего числа практических приложений результатов работ в этой области к медицине и биотехнологии. Актуально и создание новых гибридных систем, включающих синтетические макромолекулы (полиэлектролиты) и биологические компоненты. В частности, системы иммобилизованных ферментов, клеточных органелл и целых клеток.
Послойная адсорбция противоположно заряженных компонентов из раствора, предложенная Илером (Пег, 1966), получила широкое распространение для модификации свойств поверхностей и создания новых неорганических, органических, гибридных органико-неорганических, био-органических и полимерных многослойных пленок, микрокапсул и других систем, с контролируемыми на нано-уровне структурой и свойствами. Для создания такого рода пленок могут использоваться различные органические и неорганические соединения. Этот подход применялся для получения структур, включающих синтетические полиэлектролиты и биологические компоненты, такие как: молекулы ДНК, белки и целые клетки.
Поверхности клеточных мембран обычно имеют суммарный отрицательный электростатический поверхностный заряд при физиологических значениях рН, а многие сложные биологические соединения, такие как полипептиды, нуклеиновые кислоты, являются полиэлектролитами. Поэтому системы, включающие липосомы и молекулы поликатионов, являются удобными и эффективными моделями для изучения механизмов взаимодействия биологических соединений с поверхностями мембран клеток и клеточных органел.
Одной из важнейших задач современной экологии остается эффективный мониторинг загрязнения окружающей среды. В последние годы были разработаны биологические сенсоры для экологического мониторинга, которые имеют некоторые преимущества по сравнению с физико-химическими методами анализа (газовая и
жидкостная хроматография, масс-спектрометрия). К такого рода биосенсорам относятся, например, системы иммунохимического анализа, основанные на высокой специфичности иммуноглобулинов (антител) к конкретным антигенам. Сенсоры на основе антител характеризуются высокой эффективностью и чувствительностью детектирования отдельных соединений, однако, их применение для широкого анализа образцов на наличие различных, неизвестных заранее загрязнений, затруднено. Для решения такого рода задач альтернативой иммунохимическим биосенсорам могут являться биосенсоры на основе биологических систем, обладающих чувствительностью к широкому классу соединений.
Различные загрязнения окружающей среды влияют на протекание процессов фотосинтеза в растениях. Первичные процессы фотосинтеза протекают в тилакоидных мембранах хлоропластов растений. Тилакоиды, иммобилизованные в полимерном геле, использовались в качестве чувствительных элементов сенсоров на гербициды (Piletskaya et al., 1999). Актуальной представляется разработка новых сенсорных систем для экологического мониторинга, включающих иммобилизованные тилакоиды, обеспечивающих иммобилизацию тилакоидов и сохранение их функциональной активности.
Целью диссертационной работы является получение и исследование структуры и физико-химических свойств комплексов полиэлектролитов, включающих биологические и модельные мембранные везикулы. Выполнение работы было сопряжено с решением следующих основных задач.
1. Провести методом спиновых зондов исследование взаимодействия отрицательно
заряженных липосом с поликатионами, различающимися линейной плотностью заряда
молекулы.
2. Получить комплексы тилакоид/полиэлектолит в водной фазе и исследовать
структурные и электростатические характеристики тилакоидных мембран, а также
кинетику светоиндуцированных превращений Р700 в комплексах
тилакоид/полиэлектролит.
3. Изучить возможности создания планарных комплексов, включающих
синтетические полимеры и хлоропласты высших растений, иммобилизованных на
твердотельных подложках, методом последовательной послойной адсорбции противоположно заряженных компонентов.
Научная новизна диссертационной работы.
Методом спиновых зондов на основе стеариновой кислоты впервые исследовано взаимодействие отрицательно заряженных липосом с поликатионами, различающимися линейной плотностью заряженных групп в молекуле. Было показано, что взаимодействие поликатионов и анионных липосом приводит к изменениям структурных характеристик мембран липосом. При этом поликатион с большей линейной плотностью заряда молекулы в меньшей степени влияет на структурное состояние липидов вблизи поверхности бислоя, чем поликатион с меньшей линейной плотностью заряда молекулы.
В водной фазе были впервые получены и исследованы новые системы, включающие хлоропласта высших растений и синтетический полимер - комплексы тилакоидов и полиэлектолита. Установлено, что связывание поликатиона с мембранами тилакоидов не оказывает существенного влияния на их функциональные характеристики.
Разработан подход к созданию новых планарных гибридных систем, включающих биологические компоненты и организованные полимерные структуры: методом чередующейся последовательной адсорбции из водной фазы противоположно заряженных компонентов впервые получены планарные комплексы хлоропластов и полиэлектролитов, иммобилизованные на поверхности твердотельной подложки.
Представленные в работе результаты и методы получения новых гибридных полимерно-биологических структур, могут быть использованы для разработки функциональных компонентов сенсоров для систем экологического мониторинга нового поколения.
Трансмембранная и латеральная гетерогенность мембран
Процесс фотосинтеза у растений протекает в хлоропластах. Хлоропласт имеет размеры от 1 до 10 мкм. Хлоропласты окружены одинарной непрерывной наружной мембраной. Внутренняя мембрана также образует непрерывную систему (см. рис. 1-4). В ее пространстве, называемом матриксом, находятся около 1000 более мелких органелл -тилакоидов, размером около 500 нм [18]. В тилакоидных мембранах и протекают основные реакции световой стадии фотосинтеза. В хлоропластах тилакоиды плотно упакованы в стопки, называемые гранами. Между собой граны соединяются более крупными стромальными тилакоидами.
Свет в тилакоидной мембране поглощается специальным молекулярным антенным комплексом. В хлоропластах эти комплексы называются фотосистемами. Тилакоид включает в себя фотосистемы двух типов (ФС I и ФС II). Квант света, попадающий на антенну, затем мигрирует на реакционный центр (специальная пара молекул хлорофиллов), после чего происходит разделение зарядов, и электроны попадают в специальную полиферментную систему транспорта электронов, локализованную в тилакоидной мембране. В мембрану тилакоида включен также специальный белковый комплекс, осуществляющий фосфорилирование, — АТФ-синтетаза. Каждая фотосистема имеет свой характерный набор светопоглащающих пигментов [19].
В зрелых растительных клетках в нормальных физиологических условиях в строме обычно формируются граны, которые представляют собой стопки уплощенных и тесно прижатых друг к другу тилакоидов, имеющих форму дисков [17,19]. Известные из литературы эксперименты с хлоропластами, выделенными в мягких условиях (так, что тилакоидные граны сохраняются), свидетельствуют о том, что в основном катион Mg + ответственен за гранообразование в интактных хлоропластах [20].
Наличие гран в выделенных хлоропластах класса Б (хлоропластах с разрушенной внешней оболочкой, но содержащих неразрушеные тилакоиды), зависит от присутствия катионов металлов в среде инкубирования. Причем чем выше валентность катиона, тем выше его эффективность для процесса формирования гран: С3+ С2+ С+. Кроме того, не наблюдается какой бы то ни было значительной специфичности мембраны относительно катионов одной и той же валентности до тех пор, пока не произойдет связывания с поверхностью мембраны. Концентрации двух- и трехвалентных катионов, необходимые для данного эффекта, зависят от фоновой концентрации одновалентных катионов. В литературе это явление объясняется влиянием катионов на величину поверхностного потенциала тилакоидных мембран [20].
Белково-липидный состав мембраны тилакоида. Тилакоидные мембраны представляют собой сложную белково-липидную систему. Содержание белка в сформировавшихся хлоропластах относительно постоянно и составляет от 50 до 70 процентов сухой массы [19, 21].
По своей природе тилакоидная мембрана асимметрична. В ее основе, как и у всех биологических мембран, лежит липидный бислой с примыкающими к нему поверхностными белками, пронизывающими мембрану интегральными белками и находящимися внутри него внутренними белками. Гидрофильная область, содержащая ионные и полярные группы белков, располагается на мембранной поверхности, она находится в контакте с водной фазой, тогда как гидрофобная и неполярная область располагаются внутри самой мембраны. Количество липидов, связанных с белком и не участвующих в формировании бислойной мембраны, составляет около 28% от общего числа липидов в мембране. Основу мембраны составляют галактолипиды и сравнительно небольшое число фосфолипидов и сульфолипидов.
В соответствии с классификацией Дилли [21] соотношение различных липидов в тилакоидной мембране следующее: 48% - моногалактозил диацилглицерол, 25% -дигалактозил диацилглицерол, 13% - фосфатидилглицерол, 8% - сульфокиновозил диацилглицерид, 2% - фосфатидилхолин, 4% - другие фосфолипиды.
В мембране тилакоида преобладают два нейтральных галактолипида моногалакто-зилдиацилглицерол и дигалактозилдиацилглицерол [15]. Необходимо отметить, что фотосинтетическая мембрана имеет бислойную структуру, в то время, как очищенный ненасыщенный моногалактозил диацилглицерол не способен образовывать ламеллярных структур. (В избытке воды и при температурах от 15С до 80С он образует гексагональные структуры [22].) По сравнению с большинством других биологических мембран в тилакоидах содержание заряженных липидов не велико (менее 30%) [15].
Внутренние белки
Одними из самых важных супрамолекулярных структур в тилакоидной мембране являются хлорофилл-белковые комплексы. Проведенные разными авторами исследования показали, что хлорофилл-белковые комплексы непосредственно связаны с ФС I (комплекс 1) и ФС II (комплекс 2), причем обычно возникает связывание между одной молекулой хлорофилла и двумя молекулами полипептида. Это связывание происходит через дисульфидные мостики. Присутствие хлорофилла в комплексах является температурно-зависимым, при высоких температурах происходит их диссоциация [23]. Комплекс ФС I составляет около 20% от общей массы внутренних белков, комплекс ФС II, составляет около 50%.
Необходимо отметить тот факт, что гидрофобные молекулы с высоким сродством к фосфолипидному бислою: хлорофиллы, каротиноиды и пластохиноны не участвуют в образовании и формировании бислоя, а играют исключительно функциональную роль.
Внешние белки
Внешняя поверхность тилакоида находится в контакте с матриксом стромы и содержит большее, по сравнению с внутренней поверхностью, количество поверхностных белков. Значительную часть поверхностных белков на внешней части мембраны составляет белок CFi (фактор сопряжения фотофосфорилирования, часть АТФ-синтетазного комплекса) [15]. Присутствие или отсутствие во внешней мембране карбоксилдисмутазы (белок, необходимый для фиксации СОг) зависит от функционального состояния мембраны. Кроме этих белков существует еще большой класс белков, являющихся составными частями электронно-транспортных цепей которые тоже, в некоторой степени, могут быть отнесены к классу поверхностных белков.
Таким образом, тилакоидная мембрана представляет собой высоко асимметричное образование: некоторые белки экспонированы только с одной стороны, или разные части одного белка экспонированы с двух сторон. С внешней, стромальной, стороны мембраны находятся поверхностные белки - такие, как фактор CFi, ферредоксин, ферредоксин-НАДФ редуктаза [15]. Электрон-транспортные цепи обеих фотосистем локализованы в мембране тилакоида и фотоиндуцированный электронный перенос осуществляется от доноров электронов, которые находятся внутри тилакоида (молекулы воды), к акцепторам, находящимся на внешней стороне тилакоидной мембраны.
Регистрация спектров ЭПР спиновых зондов
Липидорастворимые спиновые зонды 5-SASL, 16-SASL и 16-MeSASL использовались для исследования структурных изменений, происходящих в липосомальных и тилакоидных мембранах под действием поликатионов. Для приготовления суспензии спин-меченых липосом, содержащих 5-SASL либо 16-SASL, к водной суспензии липосом добавлялся концентрированный ( 10" М) спиртовой раствор спинового зонда таким образом, чтобы обеспечить в образце стехиометрическое соотношение зонд/липид не более 1/70. При такой концентрации форма спектра ЭПР спинового зонда не зависит от концентрации зондов в образце, а амплитуда прямо пропорциональна ее концентрации (см. раздел 3.1.1.2). Окончательная концентрация этанола в суспензии не превышала 1-2% по объему. Образцы спин-меченных тилакоидов получали аналогичным способом, за исключением того, что вместо зонда 16-SASL использовался 16-MeSASL. Водорастворимый спиновый зонд САТ-9 добавлялся к суспензии тилакоидов из концентрированного водного раствора. Во избежание светоиндуцированного восстановления спиновых зондов, все манипуляции со спин-меченными образцами производились в затемненной комнате. Поликатионы добавлялись в водную фазу, в которой уже присутствовали спин-меченые липосомы или тилакоиды. 2.3. Регистрация спектров ЭПР спиновых зондов
Запись спектров ЭПР производилась на спектрометре Varian Е-4, сопряженном с IBM-совместимым персональным компьютером. Управление экспериментом и обработка результатов осуществлялись с применением оригинального программного обеспечения [100]. Варьирование температуры образцов осуществлялось потоком воздуха, подаваемого в резонатор компрессором. На пути распространения воздушного потока находился нагревательный элемент. Для контроля температуры использовался датчик температуры фирмы «Honeywell» серии HEL с чувствительным элементом на основе платиновой пленки, помещавшийся в резонатор спектрометра вместе с образцом. Для определения температуры использовался омметр, по показаниям которого, используя калибровочную зависимость, определяли температуру. Градиент температуры вдоль образца был незначительным, точность измерения температуры составляет ±2С. Последовательность операций при получении температурных зависимостей спектров спиновых зондов была следующей. Сначала записывали спектр ЭПР спинового зонда при комнатной температуре. Затем образец постепенно нагревали с шагом в несколько градусов. Таким образом были получены спектры ЭПР зондов при различных температурах. Последний спектр записывали снова при комнатной температуре. Этот спектр сравнивался с первым для выяснения обратимости термоиндуцированных изменений окружения спинового зонда и исключения из рассмотрения изменений в спектрах, обусловленных деструктивными термоиндуцированными изменениями образца.
Обработка спектров ЭПР липидорастворимых спиновых зондов n-SASL
Структурными характеристиками липидных мембранных систем, получаемыми из спектров ЭПР спиновых зондов, локализованных в мембране, обычно являются параметр порядка S и время корреляции вращения тс [2,101]. Вообще говоря, эти структурные параметры связаны с такими характеристиками мембран, как текучесть, микровязкость, однако в случае метода спиновых меток и зондов тот или иной параметр может нести информацию как о динамике так и о молекулярной упорядоченности системы [101]. Таким образом, с помощью какого-то одного параметра (S или тс) нельзя достаточно полно охарактеризовать физическое состояние мембраны, но об изменении этого состояния можно судить по изменению одного параметра. Исходя из конкретных предположений о характере движения нитроксильного радикала в исследуемой среде, параметр порядка можно связать с усредненными значениями углов между главными осями нитроксильного радикала и осью симметрии среды. В случае бислойной липидной мембраны параметр порядка определяется следующим образом [101,102]: S,. = l/2(3(cos26 ,.)-l) где 9j - угол между осями X, Y и Z системы координат, связанной с парамагнитным фрагментом зонда и соответствующими осями системы координат, связанной с липидным бислоем. Таким образом, параметр порядка характеризует среднюю по времени ориентацию парамагнитного фрагмента относительно системы координат, связанной с бислоем. В качестве системы координат, связанной с бислоем, обычно принимают систему, у которой ось Z перпендикулярна плоскости бислоя. У системы координат, связанной с парамагнитным фрагментом ось X направлена вдоль N-0 связи, а ось Z -вдоль 2р2-орбитали неспаренного электрона. Спиновые зонды на основе стеариновой кислоты обладают осью вращения, направленной вдоль углеводородной цепи стеариновой кислоты и приблизительно совпадающей с осью Z парамагнитного фрагмента [102]. Таким образом, для описания параметра порядка всей молекулы зонда n-SASL используется формула [ 101,102]: S = Sz=l/2(3(cos20)-l) где G - угол между нормалью к бислою и осью вращения молекулы спинового зонда. В случае плотной упаковки молекул в бислое и их одинаковой ориентации величина 0 близка к нулю, a S - близок к 1. По мере уменьшения плотности упаковки молекул в бислое и их разупорядочении диапазон значений 0 увеличивается a S уменьшается вплоть до нуля, что соответствует изотропному движению зонда в бислое (0 принимает значения от 0 до к). Необходимо отметить, что параметр порядка S служит мерой пространственной упорядоченности в случае тс 10" сек. (условия медленного вращения нитроксильного радикала).
Качественно, под временем вращательной корреляции тс нитроксильного радикала понимается среднее время, необходимое для изменения его ориентации в пространстве на угол ті/2 [103].
Выбор условий приготовления образцов, содержащих спин-меченые липосомы и поликатионы
Молекула спинового зонда на основе стеариновой кислоты (5-SASL, 16-SASL) представляет собой спин-меченую молекулу стеариновой кислоты (общее название n-SASL, см. рис. 2-3). Положение парамагнитного фрагмента в углеводородной цепи стеариновой кислоты варьируется у различных меток. В молекулах 5-SASL и 16-SASL он присоединен к 5-му или 16-му атому углерода соответственно, первым считается атом углерода карбоксильной группы.
Молекулы амфифильных липидорастворимых n-SASL специфическим образом взаимодействуют с липидными бислоями: гидрофобная углеводородная цепь стеариновой кислоты погружается вглубь бислоя, а гидрофильная карбоксильная группа СОСГ остается на поверхности бислоя, в контакте с гидрофильной водной средой [111]. Благодаря этому, парамагнитный фрагмент различных зондов попадает на различную глубину мембранного слоя. Таким образом, по спектрам ЭПР 5-SASL и 16-SASL можно судить о структурных характеристиках липидного бислоя на различной глубине, так как форма линии спектра ЭПР спинового зонда зависит от подвижности парамагнитного фрагмента [111].
На рис. 3-1 приведены спектры ЭПР спиновых зондов 5-SASL (А) и 16-SASL (Б) в липосомах, состоящих из фосфатидилхолина (мольная доля 80%) и стеариновой кислоты (мольная доля 20%). Данные спектры являются типичными спектрами ЭПР спиновых зондов в липидных мембранных структурах [111]. На рис. 3-1 отмечены параметры, которые применялись для количественного описания характеристик молекулярного движения спиновых зондов в мембранах липосом (см. раздел 2.4). Форма линии спектра ЭПР 5-SASL (рис. 1 А) является характерной для медленно, анизотропно вращающегося нитроксилыюго радикала [111]. Парамагнитный фрагмент 5-SASL локализован в области гидрофильных полярных групп молекул липидов [112] (в наружной области мембраны, на расстоянии =8А от ее поверхности) и для описания характеристик движения этого зонда оценивались параметры 27J и 2Т[, которые использовались для расчета параметра порядка S (см. формулу 1, раздел 2.4). Форма линии спектра ЭПР 16-SASL (рис. 1 Б) характерна для нитроксильного радикала, вращающегося сравнительно быстро и изотропно [111]. Парамагнитный фрагмент встроенного в мембрану зонда 16-SASL, находится в области гидрофобных фрагментов липидов - во внутренних областях бислоя, и подвижность его значительно больше, чем парамагнитного фрагмента 5-SASL. Для описания характеристик движения 16-SASL оценивались параметры /_/; 1о; ЛНо, которые использовались для расчета времени вращательной корреляции хс (см. формулу 2, раздел 2.4). Влияние концентрации спинового зонда в суспензии мембран липосом на форму линии сигнала ЭПР спиновых зондов
Концентрация спин-меченых молекул в исследуемом образце в значительной степени влияет на форму линии спектра ЭПР спинового зонда [111]. Известно [111], что в разбавленных растворах нитроксильных радикалов ширина линии спектра ЭПР практически не меняется с увеличением их концентрации в определенных пределах, а амплитуда увеличивается по линейному закону. Дальнейшее увеличение концентрации свободных радикалов сопровождается увеличением ширины линии, а рост амплитуды замедляется. Причиной такого изменения формы линии является взаимодействие неспаренных электронов нитроксильных радикалов в концентрированных растворах спиновых зондов. Неспаренные электроны нитроксильных радикалов могут взаимодействовать посредством двух механизмов: спинового обмена и диполь-дипольного взаимодействия.
Спиновый обмен проявляется в концентрированных растворах нитроксильных радикалов. Он обусловлен перекрыванием орбиталей двух неспаренных электронов и образованием бирадикального состояния, происходящим в момент столкновения. При частотах столкновений, сравнимых с частотным эквивалентом разности бирадикального и монорадикального состояний, происходит сильное уширение линии спектра. При еще более высоких частотах столкновений триплет вырождается в синглетный сигнал ЭПР [111].
Диполь-дипольное взаимодействие между магнитными моментами неспаренных электронов нитроксильных радикалов так же появляется в концентрированных растворах но, в отличие от спинового обмена, определяется не только расстоянием между электронами, но и их взаимной ориентацией. При быстрой переориентации радикалов в растворе диполь-дипольное взаимодействие не дает вклада в уширение сигнала ЭПР ввиду усреднения эффекта по времени [111].
Таким образом, важно правильно подобрать концентрацию спиновых зондов в образце чтобы с одной стороны - увеличить соотношение сигнал/шум, с другой стороны — не допустить искажения измеряемых параметров спектров ЭПР. Липидорастворимые спиновые зонды n-SASL хорошо растворимы в неполярных растворителях, например этаноле, однако суспензия липидных мембран - среда в значительной степени отличная от спиртового раствора. В первую очередь, значение играет концентрация липида в суспензии липосом. Мы использовали суспензии липосом с концентрацией 6,65x10"3 М (по липиду) к которым добавляли зонды из концентрированного спиртового раствора (10" М). Таким образом, был рассмотрен диапазон концентраций зонда в образце 2- 40x10"5 М, что соответствует диапазону стехиометрических соотношений зонд/липид -1/300- 1/20.
Влияние концентрации поликатионов на параметры движения спинового зонда 5-SASL в мембранах липосом, содержащих кардиолипин
Большинство биологических мембран, в том числе мембраны хлоропластов, при физионолических значениях рН имеют суммарный отрицательный электростатический поверхностный заряд, благодаря присутствию отрицательно заряженных липидов (например, фосфатидилглицерола [21]) и других, нелипидных, компонентов мембраны (например, интегральных белков). По этой причине, электростатические взаимодействия между поверхностью мембран тилакоидов и молекулами поликатиона может быть использовано для создания комплексов тилакоид/поликатион.
Планарные комплексы тилакоид/полиэлектролит иммобилизованные на поверхности твердотельной подложки Рис. 3-10. Планарные комплексы тилакоидов, иммобилизованных на поверхности твердотельной подложки (схема): (1) кремниевая подложка, (2) хлоропласты, (3) слой катионного полимера, (4) слой анионного полимера.
Для получения планарных комплексов тилакоидов и полиэлектролитов на поверхности твердотельной подложки использовался метод чередующейся последовательной адсорбции противоположно заряженных компонентов из раствора (см. табл. 5 раздел 2.7). Нами были изучены два типа планарных комплексов тилакоидов, иммобилизованных на поверхности кремниевой подложки (см. схему на рис. 3-10): (і) хлоропласты, иммобилизованные на поверхности кремния без последующего покрытия слоями полимеров («открытые хлоропласты», рис. 3-10 А), и (ii) иммобилизованные хлоропласты, покрытые четырьмя последовательно адсорбируемыми слоями полиэлектролитов РА АН и PSS («инкапсулированные хлоропласты», рис. 3-10 Б). СЭМ изображения этих образцов приведены на рис. 3-11. Иммобилизованные хлоропласты (рис. 3-11) характеризуются типичной округлой морфологией и размерами порядка 3-6 мкм. Поверхностная плотность (количество на единице поверхности) Рис. 3-11. Электронные микрофотографии хлоропластов, иммобилизованных на поверхности кремния без последующего покрытия слоями полимеров (А, Б), различима структура хлоропластов, представляющая собой округлые пузырьки или гранулы на поверхности хлоропласта размером порядка 500 нм; иммобилизованные хлоропласты, покрытые четырьмя последовательно адсорбируемыми слоями полиэлектролитов РААН и PSS (В, Г) - «инкапсулированные хлоропласты», видны складки полимерной пленки, образованной четырьмя слоями полимеров.хлоропластов на подложке составляет приблизительно 10 хлоропластов на см . На микрофотографиях, представленных на рис. 3-11 (А) и (Б) различима структура хлоропластов, представляющая собой округлые пузырьки или гранулы на поверхности хлоропласта размером порядка 500 нм. Эти пузырьки, вероятно, представляют собой стопки тилакоидов гран (см. для сравнения рис. 3-12). Микрофотографии представленные на рисунках 3-11 (А) и (Б) («открытые хлоропласта») и рисунках 3-11 (В) и (Г) («инкапсулированные хлоропласты») существенно отличаются. В случае инкапсулированных хлоропластов видны складки полимерной пленки, сформированная молекулами РААН и PSS.
Модель ламеллярной структуры хлоропласта, полученная Сталиным на основе анализа тонких срезов хлоропластов и изображений, полученных методом замораживания-скалывания из [17].
Известно, что полимерная пленка, сформированная молекулами полиэлектролитов, проницаема для низкомолекулярных соединений [114,115] и почти не проницаема для макромолекул (ферментов) [32,116] а так же для супрамолекулярных структур. Проницаемость такой пленки зависит от ее состава, толщины, структуры молекул полиэлектролита и может целенаправленно изменяться в широких пределах [110]. Таким образом, подход примененный в данной работе, позволяет получать иммобилизованные на поверхности твердотельной подложки хлоропласты (и другие функциональные биологические структуры такие как ферменты, органеллы, клетки) отделенные от окружающей среды тонким прочным полимерным барьером контролируемой проницаемости. Структуры такого рода могут представлять интерес для разработки новых биотехнологических [45] и биосенсорных систем, в частности систем экологического мониторинга [42 44,95]. 3.2.1.2. Комплексы тилакоид/полиэлектролит в водной фазе
Комплексы тилакоид/полиэлектролит в объемной водной фазе были получены посредством добавки РААН к водной суспензии тилакоидов. Концентрация РААН в образцах варьировалась в пределах 0,1 -1,0 мМ (в расчете на мономер), концентрация тилакоидов составляла 2-3 цМ Р700- Схема, изображенная на рис. 3-13, иллюстрирует формирование комплексов тилакоид/поликатион в водной фазе. На рис. 3-13 представлены электронные микрофотографии комплексов тилакоид/РААН, сформированные в водной фазе. Для этих комплексов характерно большое разнообразие форм и размеров в отличие от планарных комплексов иммобилизованных хлоропластов, характеризуемых типичной округлой морфологией и размерами порядка 3-6 мкм. Комплексы, полученные в водной фазе, представляют собой различные по форме продолговатые объекты, в составе которых различимы округлые объекты (размером 500-600 нм). Аналогичные пузырьки размера 500-600 нм различимы в составе комплексов тилакоид/РААН, сформированных на поверхности подложки (рис. 3-11). Довольно большие структуры, представленные на рисунке 3-14 представляют собой хлоропласты или их агрегаты, соединенные полимером, тогда как маленькие структуры (пузырьки размером 500-600 нм) по форме и размерам схожи с нативными тилакоидами при физиологических условиях [117,118]. Разнообразие форм и размеров комплексов, полученных в водной фазе, указывает на то, что поликатион, взаимодействуя с тилакоидными мембранами в водной фазе, нарушает ламеллярную структуру хлоропластов класса Б. Размеры комплексов поликатион/тилакоид зависели от концентрации РААН в суспензии. Этот факт согласуется с литературными данными [89,90]: размеры комплексов поликатион/липосома возрастают с увеличением концентрации поликатиона в суспензии. Этот результат может быть обусловлен уменьшением отрицательного поверхностного заряда на внешней поверхности тилакоидной мембраны в результате связывания поликатиона с мембраной и формированием межтилакоидных мостиков из молекул поликатиона. Таким образом, Рис. 3-14. Электронные микрофотографии комплексов тилакоид/РААН, сформированных в водной фазе. Для этих комплексов характерно большое разнообразие форм и размеров в отличие от планарных комплексов иммобилизованных хлоропластов. Комплексы, полученные в водной фазе, представляют собой различные по форме продолговатые объекты, в составе которых различимы округлые объекты (размером 500-600 нм). было показано, что комплексы тилакоид/поликатион могут быть получены в водной фазе, по средством добавки раствора поликатиона к суспензии хлоропластов.
