Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1. Семейство трехпетлевых (трехпальцевых) белков из яда змей 11
2. Структурные исследования цитотоксинов 15
Глава 2. Результаты и обсуждение 23
1. Исследование структуры ЦТ I методом ЯМР 23
1.1. Приготовление образцов и сбор ЯМР данных . 23
1.2. Отнесение сигналов и расчет структуры 25
1.3. Поиск прочно связанных молекул воды в ЦТ I . 36
2. Исследование ионогенных групп ЦТ I и ЦТ II 41
2.1. Анализ данных по рН-зависимости химических сдвигов цитотоксинов 41
2.2. Ионогенные группы боковых цепей цитотоксина I . 41
3. Исследование динамического равновесия в системе цито токсин/мицелла ДФХ 45
3.1. Модель для анализа химического сдвига в системе белок/мицелла 45
3.2. Модель для анализа коэффициента трансляционной диффузии белка в комплексе с мицеллой 50
3.3. Модели для кп и Мп 55
3.4. Эксперименты по измерению зависимости химических сдвигов и трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II от концентрации ДФХ 63
3.5. Анализ изменений химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II 65
4. Связывание спин-меченого ЦТ II с модельной липидной мембраной 73
4.1. Материалы и методы
4.2. Модель Гуи-Чапмена
4.3. Связывание СМЦТ II с
Заключение
Выводы
Список иллюстраций
Список таблиц
Список сокращений
Литература
- Структурные исследования цитотоксинов
- Отнесение сигналов и расчет структуры
- Ионогенные группы боковых цепей цитотоксина I
- Эксперименты по измерению зависимости химических сдвигов и трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II от концентрации ДФХ
Введение к работе
Актуальность темы. Яды змей семейства Elapidae - сложная смесь биологически активных полипептидов, которая включает нейротоксины, цитотоксины, фосфолипазы и другие биологически активные компоненты. Нейротоксины взаимодействуют с ацетилхолиновыми рецепторами, блокируя передачу нервного импульса. Цитотоксины гомологичны ней-ротоксинам по аминокислотной последовательности и пространственной структуре, но отличаются широким спектром биологической активности.
Различные представители семейства цитотоксинов способны усиливать сердцебиение при низких концентрациях и вызывать остановку сердца при высоких концентрациях (за что они получили другое название кардиотоксины), вызывать деполяризацию мышечных клеток. В больших концентрациях цитотоксины вызывают лизис фосфолипид-ных везикул и клеточных мембран, дестабилизируют структуру липид-ного бислоя, вызывают межмембранное смешивание липидов. Цитотоксины способны связываться с гепарином, который способствует проникновению цитотоксинов в мембрану. Цитотоксины обладают повышенной токсичностью по отношению к раковым клеткам. Большинство исследованных цитотоксинов вызывают гибель клеток по механизму цитолиза, за исключением цитотоксина III Naja at га, для которого показана апоптотическая активность по отношению к клеткам лейкемии человека К562, клеткам рака кишечника Со1о205, а так же CD8+ лимфоцитам человека. Считается перспективным создание противораковых средств на основе природных или модифицированных цитотоксинов.
Цитотоксины представляют собой /3-структурные амфифильные од-ноцепочечные белки длиной 59-62 аминокислотных остатка и массой 6-7 кДа. В настоящий момент известны аминокислотные последовательности 81 цитотоксина из яда змей рода Naja, из них только для 11 цитотоксинов проводились структурные исследования и получена пространственная структура методом ЯМР или рентгеноструктурного анализа. Все известные цитотоксины имеют высокую степень гомологии по амино-
кислотной последовательности и пространственной структуре. Пространственная структура цитотоксинов включает два /3-слоя по два и три (5-тяжа в каждом, а так же три функционально важных «петли» цитотокси-на. Структура стабилизирована четырьмя консервативными дисульфид-ными связями. Небольшие различия в аминокислотной последовательности и пространственном строении трех петель цитотоксинов определяют различие в спектре их биологической активности.
В настоящий момент не представляет сомнений, что биологическое действие цитотоксинов на клетку включает взаимодействие с липиднои мембраной, в частности, с плазматической мембраной клетки. Изучение структуры и функции мембранных белков наталкивается на целый ряд методических трудностей. Мембраносвязанный белок не дает спектра ЯМР высокого разрешения и не может быть закристаллизован, что затрудняет использование стандартных методик определения пространственной структуры белка. Один из путей преодоления данной трудности — использование детергентных мицелл, как систем моделирующих мембранное окружение. Вследствие меньшей молекулярной массы детергент-ные мицеллы позволяют наблюдать спектр ЯМР высокого разрешения и во многих случаях делают возможным расчет пространственной структуры белка.
Несмотря на наличие соответствующих методик, в настоящий момент детали взаимодействия цитотоксинов с липидными мембранами недостаточно изучены и вызывают разногласия между различными группами исследователей. Пространственная структура в комплексе с мицеллой получена только для одного цитотоксина, это структура цитотокси-на II из яда Naja охіапа, все остальные структуры получены в водном растворе (методом ЯМР) или в кристалле (методом рентгеноструктур-ного анализа). За исключением того же цитотоксина II не изучено влияние липидного окружения на пространственную структуру цитотоксинов, недостает прямых данных об участках цитотоксинов, вовлеченных в непосредственное взаимодействие с мембраной/мицеллой. Различные исследователи предполагают существование функционально важных комплексов из нескольких молекул цитотоксина на поверхности мембраны, однако прямых подтверждений существования таких комплексов в мем-бранах/детергентных мицеллах в настоящий момент не получено.
Цель исследования. Данная работа ставит целью комплексное изучение двух цитотоксинов из яда кобры Naja охіапа: цитотоксинов I и II методами ЯМР и ЭПР спектроскопии. Данная цель подразумевает:
Получение пространственной структуры цитотоксина I из яда Naja охіапа в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ методом ЯМР высокого разрешения.
Измерение рКа боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков, анализ влияния липидного окружения на структуру и свойства заряженных аминокислотных остатков цитотоксина I.
Изучение взаимодействия цитотоксинов с мицеллой/липидной мембраной. Мониторинг связывания цитотоксинов с мицеллой методом ЯМР и с липидной мембраной методом ЭПР с использованием спин-меченого аналога цитотоксина П.
Методы исследования. В работе применяются методы гомоядерной одномерной и двумерной 1Н ЯМР спектроскопии высокого разрешения. Для моделирования мембранного окружения при расчете структуры цитотоксина I использованы дейтерированные мицеллы додецилфосфа-тидилхолина (ДФХ). Отнесение сигналов белка производится методом последовательного отнесения сигналов, водородные связи выделяются на основе скоростей дейтерообмена амидных протонов. Ограничения на торсионные углы определяются из значений констант спин-спинового взаимодействия. Связанная молекула воды идентифицируется при помощи NOESY и ROESY спектроскопии, ее наличие проверяется методом молекулярной динамики в явно заданном растворителе. Структура белка рассчитывается на основе ограничений, полученных из двумерных NOESY спектров белка и констант спин-спинового взаимодействия минимизацией штрафной функции в программе CYANA.
Константы рКа депротонирования боковых цепей отрицательно заряженных аминокислотных остатков определяются по изменению химических сдвигов в двумерных спектрах ЯМР.
Взаимодействие цитотоксинов с мицеллой ДФХ изучается мониторингом химических сдвигов в двумерных спектрах белка и коэффи-
циента трансляционной диффузии белка методом градиентного спин-эха. Для анализа полученных данных разрабатывается оригинальная математическая модель, которая позволяет одновременно анализировать изменения химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии белок/мицеллярного комплекса.
Взаимодействие цитотоксина II с модельной липидной мембраной изучается методом ЭПР спектроскопии с использованием спин-меченого аналога цитотоксина. Кривая связывания с липидной мембраной анализируется в рамках модели Гуи-Чапмена.
Основные задачи исследования.
Получить гомоядерные ^-ЯМР спектры высокого разрешения, произвести полное отнесение сигналов и рассчитать пространственную структуру цитотоксина І в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, моделирующей мембранное окружение;
Провести титрование цитотоксинов I и II в диапазоне рН 2.0-7.0 и определить рКа отрицательно заряженных ионогенных групп цитотоксинов и изменения химических сдвигов А5 близлежащих атомов для обоих цитотоксинов в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ;
Проанализировать связывание цитотоксинов с мицеллой ДФХ по данным об изменении химических сдвигов и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов для различного соотношения белок/детергент. Выявить наличие/отсутствие кооперативное связывания молекул цитотоксина, определить количество молекул цитотоксина, способных связаться с мицеллой и оценить константу связывания.
Изучить связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с липидной мембраной методом ЭПР. Получить кривую связывания, проанализировать в рамках модели Гуи-Чапмена и определить константу связывания и эффективный заряд цитотоксина. Сравнить данные, полученные для взаимодействия с мембраной с данными по взаимодействию с мицеллой ДФХ.
Научная новизна и практическая ценность работы. Все результаты, изложенные в настоящей работе, получены впервые.
Получена структура высокого разрешения для цитотоксина І в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Обнаружена связанная молекула воды в составе второй петли цитотоксина І в водном растворе. Показано, что при связывании с мицеллой ДФХ происходит сильное изменение структуры второй петли цитотоксина. Факт существенного изменения структуры цитотоксина при связывании с мицеллой показан для цитотоксинов впервые.
Анализ рН—зависимостей химических сдвигов цитотоксина I показал высокую консервативность свойств заряженных остатков Asp40 и Asp57 и выявил особую роль остатка Asp29 в конформации второй петли молекулы.
По данным об изменении химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии построена модель связывания токсинов с мицеллой. Согласно данной модели цитотоксины связываются с мицеллой ДФХ антикооперативно, что говорит против формирования комплекса из нескольких молекул токсина. Константа связывания первой молекулы с мицеллой согласуется с константой связывания спин-меченого цитотоксина с липидным бислоем. Показано, что для корректного описания диффузионных данных необходимо учесть вытеснение части детергента из состава мицеллы при связывании молекулы цитотоксина.
Изучено связывание спин-меченого аналога цитотоксина II с модельной липидной мембраной, кривая связывания описана моделью Гуи-Чапмена и определена константа связывания цитотоксина с липидной мембраной.
Разработанные в настоящей диссертации методики представляют самостоятельный интерес и могут быть применены к исследованию других мембраносвязывающихся белков. Модель динамического равновесия в системе белок-мицелла может быть использована при анализе ЯМР данных для определения количества молекул белка, связанного с мицеллой, выявления кооперативности/антикооперативности связывания бел-
ков с мицеллой, а так же для оценки объема белка, погруженного в мицеллу через способность белка вытеснять часть детергента при связывании с мицеллой. Несмотря на то, что изменение химических сдвигов и трансляционной диффузии традиционно используются при изучения формирования белок/белковых и белок/лигандных комплексов, изучение формирования комплекса белка с мицеллой на основе аналогичных данных является новым подходом.
Основные результаты работы опубликованы в реферируемых журналах [1,2,3,4,5,6] и тезисах конференций [7,8,9,10].
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав включая литературный обзор, заключения, выводов и списка литературы.
Первая глава содержит обзор литературы, состоящий из двух частей. В первой части проводится обзор семейства «трехпальцевых» («трехпетлевых») белков из ядов змей, обсуждается широкое разнообразие функций белков со сходной структурной организацией. В качестве обобщения сделан вывод о том, что наиболее значимые аминокислотные остатки для каждого из видов токсинов находятся в трех функционально важных петлях молекулы. Во второй части приведен обзор структурных и функциональных исследований цитотоксинов. Отмечается надостаточ-ная изученность структуры цитотоксинов в липидном окружении.
Во второй главе изложены основные результаты диссертации. Первый раздел посвящен определению структуры цитотоксина І в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ. Во втором разделе подробно анализируются рН-зависимости химических сдвигов цитотоксина І в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, обсуждается структурная и функциональная роль заряженных остатков цитотоксинов. В третьем разделе изложена математическая модель взаимодействия белка с мицеллой детергента и показана ее применимость к взаимодействию цитотоксинов с мицеллой ДФХ. Последний раздел посвящен взаимодействию спин-меченого аналога цитотоксина II с липидной мембраной.
Описание использованных экспериментальных методик приведено в начале каждого раздела. Заключение и выводы приведены в конце диссертации.
Структурные исследования цитотоксинов
На рисунке 2 показаны аминокислотные последовательности цитотоксинов, структура которых была исследована методом ЯМР и/или рентгеноструктурного анализа. Структура некоторых цитотоксинов была определена несколько раз разными методами, что будет указано ниже при рассмотрении структурных исследований каждого цитотоксина.
Первые пространственные структуры цитотоксинов были получены в начале 1990-х годов методом рентгеноструктурного анализа для кар-диотоксина V" из яда Naja mossambica [39] (PDB код 1CDT) и методом ЯМР для кардиотоксина ПЬ из яда той же кобры [40] (PDB код 2ССХ). Методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.5 А установлена трехпетлевая структура цитотоксина V", гомологичная структурам постсинаптических нейротоксинов, выделена непрерывная гидрофобная область, охватывающая вторую и третью петлю цитотоксина, установлен необычный характер первой петли, окончание которой содержит фрагмент Зю спирали.
Методом ЯМР было произведено полное отнесение сигналов основной цепи цитотоксина ПЬ, произведено стереоспецифическое отнесение большинства резонансов, измерены константы 3JH -H« И Н -Н/3» идентифицированы водородные связи. Полученный в результате набор структур характеризуется СКО по атомам основной цепи элементов /3-структуры 0.51 А, общее СКО по всем тяжелым атомам 1.16 А. Охарактеризованы элементы вторичной структуры цитотоксина: малый и большой /3-слои, близость N- и С- концевого фрагмента, /3-поворот типа II соединяющий двух- и трех-тяжевый /3-слои. Показано, что наибольшее различие с рентгеновской структурой кардиотоксина V4 локализовано в области первой и второй петель токсина.
Структура цитотоксина 7 из яДа Naja nigricollis получена методом ЯМР [41] (PDB коды 1СХ0, 1CXN). По сравнению со структурой ПЬ N. mossambica в данном цитотоксине наблюдались дополнительные NOE контакты между остатками первой (Leu6) и второй (Val34, Lys35) петель, что говорит о большей сближенности петель в токсине 7- После анализа структуры боковых цепей молекулы была высказана гипотеза о наличии в цитотоксине сайта связывания фосфолипида, который образован боковыми цепями трех остатков лизина Lysl2, Lysl8 и Lys35.
Структура этого же цитотоксина была получена годом позже методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1.5 А [42] (1TGX). Три молекулы цитотоксина в кристаллической ячейке представляют из себя тример, который был предложен авторами как модель поры, образуемой токсином на поверхности мембраны. Сходство ЯМР и трех рентгеновских структур наблюдалось везде за исключением конформации петель I и II, плохо определенных методом ЯМР и слабо структурированных в рентгеновских структурах. В центре второй петли обнаружена молекула воды, которая удерживается тремя водородными связями с атомами HN Met26, СО А1а29 и СО Val32.
Последнее исследование цитотоксина 7 N. nigricollis было проведено методом ЯМР в присутствии мицелл ДФХ [43]. Было произведено отнесение сигналов и анализ вторичной структуры белка, но расчет пространственной структуры выполнен не был. По изменению химических сдвигов белка в водном растворе и в комплексе с мицеллой сделан вывод о том, что с мицеллой взаимодействуют три петли цитотоксина, которые образуют непрерывную гидрофобную область на его поверхности.
Структура цитотоксина I из яда Naja atra была определена в водном растворе методом ЯМР спектроскопии [44] (2CDX). Набор структур характеризуется СКО 0.53 А по тяжелым атомам основной цепи и 1.69 А по всем тяжелым атомам. Данный цитотоксин отличается всего тремя аминокислотными заменами от цитотоксина I Naja oxiana, структура которого исследуется во второй главе настоящей работы.
Цитотоксин II из яда Naja atra был исследован методом ЯМР [45] (1CRF, 1CRE), полученная структура характеризуется СКО 0.44 А по ато мам основной цепи элементов вторичной структуры и 1.37 А по всем тяжелым атомам. Отмечена большая длинна сегмента второй петли (остатки 26-34 вместо 25-34 в других токсинах), так же авторы подтверждают возможность образования сайта связывания фосфолипида боковыми цепями остатков лизинов 12, 18 и 35. Отмечен меньший угол закручивания /3-слоев по сравнению с кристаллической структурой цитотоксина Vj Naja mossambica.
В работе [46] показано, что цитотоксин II N. atra связывает нуклеотидтри- и монофосфаты с константой связывания от 14 мкм (гу-анидинтрифосфат) до 87 мкм (аденозинмонофосфат). Методами ЯМР и молекулярной динамики установлен сайт связывания нуклеотидтрифос-фатов: остатки Leul, Lys2, Asn4, Lys23, Thr56, Arg58 и Asn60. Данный сайт отличен от предложенного ранее сайта связывания фосфолипидов и находится на противоположной поверхности молекулы.
В последствии динамика данного цитотоксина II N. atra была исследована методом 13С ЯМР-релаксации Са атомов с использованием естественного содержания магнитного изотопа углерода [47]. Показано, что значения параметра порядка S2 для петель цитотоксина (0.78, 0.77 и 0.79 для петель I, II и III, соответственно) достоверно меньше, чем для остатков в составе /3-слоев (в среднем 0.84), что говорит о повышенной подвижности петель цитотоксина. Данное обстоятельство может играть роль при связывании цитотоксина с гипотетическим рецептором на поверхности мембраны эритроцитов или с плазматической мембраной клетки. Вполне вероятно, что подвижность остатков окончаний трех петель облегчает формирование комплекса, понижает энергетический барьер и увеличивает связывания токсина. Данные по ЯМР релаксации были независимо сопоставлены с подвижностью молекулы, наблюдаемой методом молекулярного моделирования, и обнаружено качественное, а для некоторых остатков и количественное согласие значений параметров порядка S2 [48].
Отнесение сигналов и расчет структуры
В процессе отнесения сигналов цитотоксина в водном растворе были обнаружены два набора спиновых систем для аминокислотных остатков 4-13 (первая петля цитотоксина) и остатка Gly37 (рис. 3(a)). Две формы белка представлены в растворе в соотношении 5:1. Аналогичное явление ранее наблюдалось для ЦТ II N. охіапа в водном растворе. Конформационная гетерогенность обусловлена изомеризацией пептидной связи Val7-Pro8: для основной формы белка данная пептидная связь имеет транс-, а для минорной — цис- конформацию (рис. 4(a)). Из предыдущих исследований ЦТ II известно, что минорная форма цитотоксина не взаимодействует с мицеллой ДФХ, аналогично не взаимодействует с мицеллой ДФХ и минорная форма ЦТ I. Расчет структуры производился только с использованием сигналов основной формы цитотоксина.
Последовательное отнесение сигналов, идентификацию спиновых систем и выявление элементов вторичной структуры проводили по методике [73,74] с использованием программы XEASY [69]. Данные последовательного отнесения приведены в таблице 3 для основной формы цитотоксина в водном растворе и в таблице 4 для цитотоксина в комплексе с мицеллой ДФХ. Анализ разницы химических сдвигов основной формы цитотоксина (таблица 3 на стр. 33) и комплекса ЦТ І/ДФХ (таблица 4 на стр. 35) выявляет наибольшие различия в области трех функциональных петель цитотоксина (рис. 4(6)), что позволяет предположить, что цитотоксин погружается в мицеллу окончаниями всех трех петель. Этот вывод подтверждается данными по уширению сигналов цитотоксина встроенными в мицеллу липидными спиновыми метками: как видно из рисунка 4(в), при встраивании 5-ДС/16-ДС в мицеллу наиболее сильно подавляются сигналы окончаний трех петель цитотоксина.
При расчете структуры цитотоксина в комплексе с мицеллой ДФХ возникла дополнительная трудность, связанная с сильным ослаблением сигналов в области окончания второй петли цитотоксина, поэтому однозначного отнесения сигналов основной цепи остатков Ser28 и Asp29 получить не удалось. Такое ослабление сигналов по-видимому объясняется наличием конформационного перехода, скорость которого удовлетворяет условию «промежуточного обмена» в шкале времени ЯМР, при котором скорость обмена между двумя конформациями молекулы близка к разнице резонансных частот протонов. Для корректного определения конформации второй петли цитотоксина сигналы NOESY спектра второй петли (аминокислотные остатки с Met26 по Пе32) калибровались отдельно от остальных NOE кросс-пиков. Такой подход позволил извлечь достаточно информации из ЯМР спектра для определения конформации второй петли молекулы.
Ближние и дальние ограничения на расстояния, полученные из NOESY спектров, ограничения на торсионные углы из констант спин-спинового взаимодействия, ограничения на водородные связи, определенные по скоростям 2Н-обмена (рис. 5(a)) и выявленным элементам вторичной структуры вместе с данными по стереоспецифическому отнесению сигналов протонов использовались для расчета структуры цитотоксина в водном растворе и в комплексе с мицеллой ДФХ, таблица 1.
Полученные в результате расчета структуры цитотоксина І в водном раствор и в комплексе с мицеллой ДФХ обладают низким значением СКО, низким значением штрафной функции CYANA и практически
Данные по дейтерообмену и последовательным NOE-контактам ЦТ I (основная форма), (а) Скорость дейтерообмена Нж протонов ЦТ І в водном окружении (верхний ряд, 10 С) и в комплексе с мицеллой ДФХ (нижний ряд, 30С). Светлые окружности соответствуют Н -протонам, сигналы которых отсутствовали в первом спектре, снятом через 20 минут после растворения образца в 2Н20, черные окружности соответствуют амидным протонам, сигналы которых наблюдались через 24 часа после растворения, полузакрашенные окружности соответствуют промежуточной ситуации, (б),(в),(г) Карта последовательных d-связей ЦТ I (верхний ряд для каждого типа контактов) и комплекса ЦТ І/ДФХ (нижний ряд). Для ЦТ І в водном окружении (основная форма) использовался спектр NOESY-50 мс (30 С), для ЦТ І в комплексе с мицеллой ДФХ спектр NOESY-ЗОмс (50С). Эллипсами обозначены перекрытые в NOESY-спектре кросс-пики. Для остатков Pro роль Нж-протонов играют Н -протоны пролина.
Анализ ROESY спектров ЦТ І в водном окружении при трех температурах (10, 30 и 50 С) выявил интенсивный отрицательный ROE кросс-пик с сигнала И Met26 на сигнал воды (рис. 3(б)-(г)). Согласно [75], данный сигнал может быть интерпретирован либо как признак существования долгоживущей связанной с белком молекулы воды, либо как присутствие лабильной гидроксильной группы боковой цепи белка в непосредственной окрестности от HN Met26. Предварительные расчеты пространственной структуры ЦТ I показали, что ближайший к HN Met26 лабильный протон (ОН Ser28) удален на расстояние более 5 А. Медленная скорость дейтерообмена Нж Met26 (рис. 5(a)) говорит о наличии водородной связи с его участием, однако в ходе предварительных расчетов структуры ЦТ I подходящий акцептор водородной связи обнаружен не был. Все приведенные данные однозначно свидетельствуют о наличии связанной воды в петле II ЦТ I. Связанная вода в аналогичном положении наблюдалась в структурах цитотоксинов, полученных как методом рентгеноструктурного анализа [42,52,59], так и методом ЯМР-спектроскопии [56,55,58].
Водородные связи вида СО НОН не могут быть установлены экспериментально ни методом рентгеноструктурного анализа (поскольку невозможно восстановить положение протонов в молекуле воды), ни методом гомоядерной -ЯМР спектроскопии. Однако моделирование структуры цитотоксина A3 Naja atra методом молекулярной динамики с явно заданным водным окружением [58] показало, что связанная молекула воды во второй петле цитотоксина A3 образует водородные связи не только с Нж группой Met26, но и с СО группами остатков Thr29 и Val32. Выравнивание структуры второй петли пяти цитотоксинов Р-типа, для которых экспериментально доказано существование связанной воды во второй петле [58], показало высокую консервативность в пространственном расположении групп атомов Нж 26, СО 29 и СО 32. Данные по структуре цитотоксина A3 Naja atra в комплексе с мицеллой SDS, полученной методом рентгеноструктурного анализа [59], так же подтверждают выводы работы [58].
Ионогенные группы боковых цепей цитотоксина I
Цитотоксин ЦТ I содержит четыре аминокислотных остатка, боковые цепи которых изменяют ионогенное состояние в диапазоне рН2.0 - 8.0, это остатки Glul6, Asp29, Asp40 и Asp57. Значения рКа этих аминокислот были определены по изменению химических сдвигов близлежащих протонов в серии двумерных ЯМР-спектров, как описано в разделе 2.1. Полученные значения рКа и изменения химических сдвигов приведены в таблице 5. Все перечисленные титрующиеся группы пространственно удалены друг от друга, поэтому каждая кривая титрования хорошо описывается одним значением рКа, уравнение (2.1).
Изменение рКа титрующихся группировок вместе с данными об изменении химических сдвигов (рис. 4) при связывании с мицеллой ДФХ дают информацию о том, какие участки цитотоксина взаимодействуют с мицеллой. Сравнение рисунка 4 и таблицы 5 показывает, что остат ки Glul6, Asp40 и Asp57 локализованы в области ЦТ I, удаленной от мицеллы, так как ни химические сдвиги, ни значения рКа не изменяются существенно при встраивании цитотоксина в мицеллу. В то же время значительное изменение рКа Asp29 (более единицы рН) в совокупности с сильным изменением химических сдвигов в данной области белка позволяет сделать вывод о том, что боковая цепь Asp29 находится в области белка, взаимодействующей с мицеллой ДФХ. Как было показано выше методом молекулярной динамики, в водном растворе боковая цепь Asp29 участвует в формировании водородной связи с прочно связанной молекулой воды. Значение рКа Asp29 в водном растворе мало отличается от значения свободной аминокислоты (3.70), что говорит об экспонировании боковой цепи в водное окружение. Данный вывод согласуется с полученной пространственной структурой второй петли цитотоксина, рис. 8(a). После связывания с мицеллой ДФХ цитотоксин теряет связанную молекулу воды, а вместе с ней исчезает и водородная связь с карбоксильной группой Asp29. Значение рКа Asp29 в комплексе ЦТ I/ ДФХ значительно превышает значение рКа боковой цепи свободной ас-парагиновой кислоты, что свидетельствует о стабилизации незаряженной формы карбоксильной группы в гидрофобном окружении мицеллы.
Обращает на себя внимание большое изменение химического сдвига Hw Lys2 при титровании боковой цепи Asp57, таблица 5. Следует заметить, что С7 атом карбоксильной группы аспарагиновой кислоты находится на продолжении N-H вектора Lys2 на расстоянии 3.3 А, что в совокупности с медленным дейтерообменом HN Lys2 говорит в пользу существования водородной связи Lys2 Нж О6 Asp57. В работах [76,77] показано, что положительное изменение химического сдвига HN протона при титровании карбоксильной группы определяется относительным времени существования водородной связи. Стабильная водородная связь, которая существует 70-90% времени, должна приводить к изменению химического сдвига на +1.5.. [77] при переходе от кислых значений рН к нейтральным. Если изменение химического сдвига меньше данной величины, то можно сделать вывод о временном характере водородной связи. Следовательно, водородная связь Lys2 RN ---03 Asp57 должна существовать приблизительно 50% времени. Анализ депонированных структур в банке данных PDB показывает, что гомологичная водородная связь присутствует в рентгеновских структурах других цито-токсинов [42,39,52,59]. Данная водородная связь была введена в расчет структуры ЦТ I и ЦТ І/ДФХ (таблица 1).
Аналогично можно показать, что боковая цепь аспарагиновой кислоты Asp40 образует водородные связи с атомами Нж Asp40 и Нж Val41. Большое положительное изменение химического сдвига А5 этих атомов при переходе через рКа (таблица 5) соответствует водородным связям, которые существуют 40/60% (Нж Asp40) и 20/30% (RN Val41, раствор/ мицелла ДФХ). Гомологичные водородные связи наблюдаются в рентгеновских структурах других цитотоксинов [42,39,52,59].
Низкое значение рКа аспарагиновых кислот Asp40 и Asp57 по сравнению со значением рКа свободной аспарагиновой кислоты (3.70) связано с присутствием вблизи каждой из них положительно заряженных групп белка. Положительный заряд боковой цепи остатка Lysl8 пространственно сближен с отрицательным зарядом Asp40, а положительные заряды боковых цепей Lys2 и Arg58 пространственно сближены с отрицательным зарядом Asp57. Глутаминовая кислота Glul6 экспонирована в водное окружение, не образует никаких водородных связей и пространственно удалена от других заряженных групп белка, значение рКа Glul6 близко к значению для свободной аминокислоты в водном растворе (4.28).
Эксперименты по измерению зависимости химических сдвигов и трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II от концентрации ДФХ
Зависимость химических сдвигов цитотоксина I от соотношения детергент/белок (L/P) определяли по серии двумерных TOCSY и NOESY спектров при температуре 30 С. Титрование проводили добавлением к 1.5 мМ раствору ЦТ I раствора ДФХ-дз8- Для соотношений L/P = 0,3,6 и 9 были сняты спектры TOCSY-бОмс и NOESY-IOOMC; для соотношений L/P = 12,15 и 18 спектры TOCSY-50MC И NOESY-80 мс и для соотношений L/P = 27,36,45 и 60 спектры TOCSY-40MC И NOESY-60 мс. Спектры снимались с разрешением 4096x256 точек, затем линейное предсказание использовалось для увеличения разрешения до 4096 х 1024 точек, затем спектры преобразовывались с окончательным разрешением 4096 х 2048 точек. Серии двумерных TOCSY и NOESY спектров были собраны в два трехмерных массива данных для дальнейшего анализа. После отнесения сигналов атомов основной цепи были выделены 56 атомов, сигналы которых сдвигаются в процессе титрования более чем на 0.05 м.д., в том числе 27 Нж, 24 На и 5 В.6 Pro атомов. Химические сдвиги этих атомов были использованы при вычислении 5а11 в соответствии с уравнением (3.2).
Трансляционную диффузию ЦТ I измеряли на спектрометре Varian Unity-600 при помощи градиентного спин-эхо эксперимента с подавлением сигнала воды (Water-sLED, [89]) как описано в [56]. Титрование производили добавлением раствора ДФХ к 1.0 мМ раствору ЦТ I. Трансляционная диффузия была измерена при тех же соотношениях L/P, что и эксперименты по измерению химического сдвига.
Зависимость химических сдвигов и трансляционной диффузии цитотоксина II от концентрации ДФХ была исследована ранее [56]. Однако в работе [56] были накоплены только одномерные спектры цитотоксина для каждого соотношения L/P, что позволило проследить за изменением только двух не перекрытых сигналов HN Leu 9 и HN Met 26. Поэтому для ЦТ II было проведено новое титрование аналогично тому, как это было описано выше для ЦТ I. Для титрования использовался раствор ЦТ II концентрации 2.63 мМ, к которому добавляли раствор ДФХ до соотношения детергент/белок 0,2.5,5.0,7.5,10,15,20,25,30 и 45 (моль/моль). При каждом из указанных соотношений был снят двумерный NOESY-170 мс спектр с разрешением 4096x256 точек. Далее спектры были преобразованы и проанализированы как описано выше для ЦТ І, в результате были выделены 26 атомов основной цепи с изменением химического сдвига более чем на 0.05 м.д., в том числе 14 HN и 12 На атомов. Химические сдвиги этих атомов были использованы при вычислении 5а11 в соответствии с уравнением (3.2).
Для анализа трансляционной диффузии цитотоксина II использовались данные работы [56]. 3.5. Анализ изменений химического сдвига и коэффициента трансляционной диффузии цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II
Данные по трансляционной диффузии и химическому сдвигу цитотоксинов I и II, полученные, как описано в разделе 3.4, были проанализированы с помощью моделей, описанных в разделе 3.3 с учетом и без учета эффекта вытесненного объема.
Анализ проводили методом наименьших квадратов с минимизацией общей штрафной функции, учитывающей как химический сдвиг, так и трансляционную диффузию: X2 = xV) + X2(A) (3.50)
Результаты нелинейной регрессии (минимизации штрафной функции (3.50)) в рамках различных моделей приведены в таблицах 6 и 7 для цитотоксинов ЦТ I и ЦТ II, соответственно. При минимизации варьировались следующие параметры: суммарное изменение химического сдвига А5а11, коэффициент трансляционной диффузии в отсутствие липида Df$, константа связывания первой молекулы белка с мицеллой ко, отношение объема молекулы детергента к объему молекулы белка /І (уравнение 3.19), количество молекул белка, связанных с мицеллой N (только для моделей А и В), коэффициент вытеснения детергента связанным белком AM (только для моделей В и D) и коэффициент антикоопера-тивности связывания р (уравнение 3.45а, только для моделей С и D). Во всех моделях был фиксирован параметр MQ\ количество молекул детергента приходящихся на одну мицеллу в отсутствие белка было принято равным 60.
В таблице 6(a) и 7(a) приведены значения штрафной функции и значения варьируемых параметров для моделей с непрерывным N с учетом (модели А и В) и без учета (модели Аф=о и Д/,=о) эффекта вытесненного объема ф. Как видно из таблицы 7(a), учет вытесненного объема приводит к значительному уменьшению штрафной функции по трансляционной диффузии х2(А) (на 30 единиц для модели Л и на 8 единиц для модели Б). В то же время значение штрафной функции для химического сдвига х2( а11) остается достаточно высоким (более 28 единиц). Таким образом, введение вытесненного объема в модель для трансляционной диффузии представляется оправданным, но не достаточным для описания всех экспериментальных данных. Заметим, что для цитотоксина I введение вытесненного объема в модели А и В не дает столь заметного уменьшения штрафной функции (таблица 6(a)), однако в целях единообразия в анализе данных вытесненный объем был введен в модели для обоих цитотоксинов (таблицы 6(б)-(в) и 7(б)-(в)). Заметим, что значение непрерывно изменяемого параметра N варьировалось от наименьшего 2.75 (модель В для ЦТ I) до наибольшего 4.95 (модель А для ЦТ II).
Дальнейший анализ экспериментальных данных проводился при помощи моделей с дискретным N, а именно моделей С и D. Для каждой из моделей параметр N был зафиксирован на одном из четырех значений: N = 3,4,5 или 6. Напомним, что модель С учитывает антикооператив-ность связывания белка с мицеллой р (р ф 1), но не учитывает вытеснения детергента из мицеллы (AM = 0). Как видно из сравнения таблицы 7(a) и (б), модель С по сравнению с моделью В позволяет незначительно уменьшить значение общей штрафной функции %2 для ЦТ II (30.07 для наилучшей модели класса С: Сдг=5 по сравнению с 36.78 для модели В)
