Содержание к диссертации
Введение
I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 7
I СЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН 7
1.1. Слияние мембран в физиологических условиях ...... 7
1.2. Слияние биологических мембран под действием вирусов, химических соединений и электрического поля 9
1.3. Взаимодействие липидных бислоев как основа
слияния биологических мембран 13
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ ДЛЯ- ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ СЛИЯНИЯ МЕМБРАН 16
2.1. Слияние липосш между собой , 16
2.2. Слияние липосом с БЛМ .. 25
2.3. Взаимодействие БЛМ между собой 28
3. СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ В ЛИПИДНЫХ ЕИСЛОЯХ ПРИ СЛИЯНИИ 33
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37
I. Материалы 37
2. Конструкция измерительной ячейки и визуальный контроль за взаимодействием БЛМ, 38
3. Измерение электрических параметров и
. натяжения БЛМ 40
4. Емкостный метод контроля за основними. стадиями слияния. 46
. 5. Получение БЛМ, не содержащих, растворителя 48
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 56
I ОСНОВНЫЕ СТАДИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПВДНЫХ . БИСЛОЕВ 56
2. ЦЛ(ХЗКШАРАДЕЛЕЛЬНЫЙ КОНТАКТ БЛМ. . 61
2.1. Теоретический анализ модели.... 64
2.2. Результаты 67
2.3. Обсуждение 71
3. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА МСНОСЛОИНОГО СЛИЯНИЯ МЕМБРАН 73
3.1. Постановка задачи 73
3.2. Результаты 80
3.3. Обсуждение 88
4. РОСТ КОНТАКТНОГО СЛОЯ 95
4.1. Емкостные измерения. 95
4.2. Скольжение монослоев друг относительно друга 100
4.3. Обсуждение 101
5. СЛИЯНИЕ ЕИСЛОЙНЫХ ЛШЩНЫХ МЕМБРАН 103
5.1. Электростимулируемое слияние БЛМ 104
5.2. Са +-индуцируемое слияние БЛМ,
не содержащих растворителя 106
6. ИССЛЕДОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ МИЛБРАННОЙ ТРУБКИ. 119
6.1, Теоретический анализ устойчивости
мембранной трубки 119
6.2, Результаты. 122
6.3, Обсуждение , 125
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 129
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 131
ЛИТЕРАТУРА 133
- Слияние мембран в физиологических условиях
- Слияние липосш между собой
- СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ В ЛИПИДНЫХ ЕИСЛОЯХ ПРИ СЛИЯНИИ
- ОСНОВНЫЕ СТАДИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПВДНЫХ . БИСЛОЕВ
- ЦЛ(ХЗКШАРАДЕЛЕЛЬНЫЙ КОНТАКТ БЛМ.
Слияние мембран в физиологических условиях
Слияние мембран играет важную роль в физиологии клетки и в межклеточном взаимодействии, являясь ключевым событием в таких процессах, как эндо- и экзоцитоз, слияние клеток между собой /2, 3,5, 24-26/.
Нормальное функционирование клетки невозможно без многочисленных актов слияния. Захват.внеклеточных веществ приэндоциго-. зе и расщепление их вследствие слияния эндоцитированного пузырька с лизосомой, секреция белков, гормонов,-нейромедиаторов, удаление продуктов жизнедеятельности клетки,- обновление и достройка плазмалеммы - вот неполный перечень процессов, протекающих в клетке путем слияния мембран /1,2/.
Слияние клеток наблюдается в эмбриогенезе при образовании -миофибрилл в результате слияния миобластов /5/,,в.процессе оплодотворения (слияние сперматозоида с яйцеклеткой) /26/. Некоторые патологические процессы, например, вирусная инфекция, также могут вызывать слияние клеток /II/.
Слияние мембран - универсальное явление, реализующееся как. на клеточном, так и на субклеточном уровнях. Очевидно, что регу -лирующие его факторы, механизмы "узнавания" участков, с которыми должно произойти слияние, и предшествующие этому структурные перестройки в биологических мембранах представляют собой сложный комплекс взаимосвязанных процессов. Мы ограничимся рассмотрением лишь той части обширной литературы, посвященной проблеме слияния, которая касается структурных переотроек мембран, приводящих непосредственно к их слиянию.
Несмотря на большое количество данных по феноменологии слияния биологических мембран, о молекулярных механизмах этого явления известно довольно мало. На самых разнообразных объектах в настоящее время установлено, что слиянию предшествует агрегирование так называемых внутримембранных частиц (IMP) /2,6,7,27-30/, которые исходно равномерно расположены на поверхности плазмалем-мы или секреторной везикулы.
Люси и сотрудники /10/ предположили, что агрегирование ВІР связано с латеральным перемещением и агрегированием мембранных белков, приводящим к.образованию в мембране. липидных доменов. Именно эти домены, по предположению авторов, участвуют в акте слияния. Нередко IMP образуют упорядоченные скопления в виде "розеток" вокруг липидного домена /6,19,31/. Сатиром и соавт. показа-г НО, ЧТО такие "розетки" У Tetrahymena pyriformis ЯВЛЯЮТСЯ.участками слияния мукоциста с плазмалеммой /32,33/. Таким образом, окружающие липидный пятачок белковые частицы могут быть ответственны за "узнавание" секреторной везикулой специфического участка плазмалеммы, с которым должно произойти слияние.
Слияние липосш между собой
Для изучения механизма слияния предложен целый ряд модельных систем, в которых изучают взаимодействие и слияние липосом (ЛС) с клеткой, липосом с липосомами, липосом с плоской биСЛОЙ-НОЙ липидной мембраной (БЛМ), БЛМ с БЛМ /14-16,. 23/. Все перечисленные системы имеют свои преимущества- и. в целом дают, взаимодополняющую информацию о феноменологии и механизме слияния мембран.
Так, изучение закономерностей взаимодействия и слияния ЛС с клеткой может способствовать решению проблемы направленного. транспорта лекарственных препаратов, ферментов и др. веществ в клетку /69-71/.
Установлено, что ЛС действительно могут сливаться с клетка ми, причем вероятность этого процесса существенно зависит от состава и заряда ЛС, а также от агрегатного состояния липидов /69 73/, Однако изучение молекулярного механизма слияния ЛС с клетками затруднено по той причине, что эта модель все еще чересчур сложна, и исследователь по-прежнему имеет дело с таким сложным объектом, как биологическая мембрана.. В настоящее время существуют две основных модели биологических мембран - липосомы (ЛС) /14,16,23/ и бислойные липидные мембраны (БЛМ) /74/. Разные сочетания- этих моделей и используются для изучения взаимодействия мембран.
Структурные перестройки в липидных бислоях при слиянии
Как отмечалось выше, слиянию мембран во всех случаях должно предшествовать установление контакта между ними. Известно, что многие фьгазогены вызывают агрегирование ЛС и клеток /12,14,23/. Показано, что вещества, способствующие образованию таких конгломератов, увеличивают эффективность действия фьюзогенов /11,89/.
Однако контакт между мембранами, являясь безусловно важным моментом, не обязательно приводит к слиянию. Необходимо еще локальное нарушение бислойной структуры. Несложная оценка /153/ показывает, что для того, чтобы просто "вдавить" две мембраны друг в друга без нарушений в бислойной упаковке, нужно приложить к ним колоссальное давление ( 109 Н/м2). Поэтому такой механизм "совмещения зубцов гребенки" реально работать не может. Следовательно, перед слиянием должны произойти радикальные структурные перестройки в бислоях /23/.
Какова же морфология промежуточных структур, реализующихся при слиянии? По мнению де Круиффа и сотр. /154,155/,такими структурами являются липидные мембранные частички ЬГР и комплементарные им углубления, обнаруженные авторами на криофрактографических сколах в процессе слияния. Подчеркнем, что такие частички наблюдаются лишь на смесях, содержащих липиды, молекулы которых имеют форму обратного конуса (то есть площадь, занимаемая гидрофобной частью молекулы, больше площади полярной головки): ненасыщенный ФЭА или кардиолипин (КЛ) /156,157/. Эти липиды в определенных условиях предпочитают гексагональную упаковку (например, КЛ в присутствии Са +).
По вопросу о структуре таких UP мнения исследователей расходятся. Так, на основании анализа криофрактографических снимков и спектров Р - ЯМР де Круифф и коллеги пришли к выводу, что
ИР представлягот собой инвертированные мицеллы внутри бислоев /155,157/. Однако ряд исследователей /I58-I6I/ методом негативного контрастирования на поперечных срезах многослойных ЛС из ФЭА, ФЭА/ФХ/КЛ и др. смесей показали наличие своеобразных конических образований, соединяющих соседние бислои. Эти образования
в плане на криофрактографических сколах видны в виде UP И дают
31 характерный сигнал в Р-ЯМР спектрах. Таким образом, ьір представляют собой не инвертированные мицеллы, а локальные дефекты: "сшивки" между бислоями. Такие "сшивки" в /23,162/ предложено называть оталками.
Поперечные срезы выявляют также относительно обширные плоские участки в области контакта бислоев, которые трактуются как результат монослойного слияния. Для стабилизации сталков, обладающих большой кривизной, необходимы, по мнению авторов, липиды, имеющие форму обратного конуса. Рост сталка приводит к образованию одиночного бйслоя в области контакта двух мембран. Трилами-нарная структура может явиться промежуточной в процессе слияния, которое фиксируется на сколах в виде "пустот" в области контакта бислоев.
Основные стадии взаимодействия липвдных . бислоев
При взаимодействии БЛМ из различных липидов и их смесей, содержащих или не содержащих органический растворитель,наблюдается следующая общая последовательность событий. После сближения мембран посредством выдавливания их друг навстречу другу при создании соответствующей разности гидростатических давлений между ними устанавливается плоскопараллельный контакт. При наблюдении в отраженном свете под прямым углом к плоскости контакта би-слоев она имеет равномерную желтоватую окраску. Этой стадии соответствует изменение регистрируемых на выходе усилителя 0А осциллограмм (см. рис. Па), отражающее увеличение постоянной времени системы благодаря повышению сопротивления щели между мембранами.
Через некоторый промежуток времени, зависящий от заряда мембран, содержания в них растворителя, от ионной силы и состава фонового электролита, происходит изменение конфигурации кБЛМ, проиллюстрированное на рис. 86. Этот процесс в случае декановых мембран носит скачкообразный характер. При наблюдении в перпендикулярном плоскости контакта направлении видно, как на фоне плоскопараллельного контакта декановых мембран происходит одновременное образование многочисленных черных точек. В области контакта формируется характерная "ячеистая структура", состоящая, по-видимому, из чередующихся бислойных участков и водных линз, зажатых между двумя бислоями. Диаметр области водных линз пропорционален диаметру исходного плоскопараллельного контакта БЛМ. Эта область окружена черным кольцом, сформированным в процессе более медленного роста площади контакта БЛМ после скачкообразного возникновения водных линз.
В случае "сухих" мембран этот процесс, напротив, начинается обычно из 1-2 черных точек. Площадь черного участка медленно увеличивается и распространяется до площади всей области контакта (рис. 9).
Наряду с видимыми в микроскоп изменениями в конфигурации системы на этой стадии происходит также качественное изменение осциллограмм емкостного тока на выходе ОА2 (рис. 56), соответствующее формированию одиночного бислоя в области контакта двух мембран.
Как отмечалось выше, структура области контакта БЛМ исследовалась рядом авторов. Однако наиболее прямой метод доказательства - измерение удельной емкости области контакта Ск - давал неоднозначные результаты. Значения Ск варьировали от 85$ в /21/ до 50$ от величины См в /147/. По этой причине мы вернулись к изучению структуры области контакта мембран, в частности, бислоев, не содержащих растворителя.
Плоокопараллелбшй контакт бислойбых липвдных мембран
После сближения заряженных бислоев между ними устанавливается (в определенных условиях) равновесный плоскопараллельный контакт, при котором силы межмолекулярного притяжения и гидростатическое давление уравновешиваются электростатическим отталкиванием заряженных поверхностей /22/. Очевидно, что равновесное расстояние между кБЛМ должно зависеть от их заряда, состава и концентрации электролита, а также от разности гидростатических давлений, созданной для приведения бислоев в контакт.
В отличие от других стадий взаимодействия БЛМ образование плоскопараллельного контакта не сопровождается качественным изменением формы токовых осциллограмм, регистрируемых на выходе усилителя ОА2 (рис. II). Возрастает лишь характерное время релаксации тока вследствие увеличения постоянной времени системы при образовании узкого водного зазора между кБЛМ (сопротивление зазора существенно выше, чем сопротивление раствора в среднем отделении ячейки). Обычно постоянную времени системы характеризуют произведением RC, где R и с - последовательно соединенные сопротивление и емкость системы. Однако в данном случае непосредственно определить эффективное сопротивление зазора невозможно, поскольку в действительности область контакта представляет собой элемент цепи с распределенными параметрами.
В настоящей работе мы не ставили задачи специально исследовать область плоскопараллельного контакта, но сочли необходимым разобраться в природе сигнала, характеризующего его образование. Анализ формы емкостного сигнала важен, так как этот сигнал, по крайней мере качественно, отражает изменение расстояния между БЛМ при их сближении и, следовательно, позволяет контролировать состояние системы перед монослойным слиянием (см. 3).
Для правильной количественной обработки осциллограмм необходима соответствующая теория, позволяющая оценить эффективное сопротивление щели между кБЖ. Такая теория была развита совместно с В.Ф. Пастушенко и И.Г. Абидором.
Похожие диссертации на Взаимодействие и слияние бислойных липидных мембран
