Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 5
1. Гибридные антиоксиданти ихфаны, перспективы их использования при болезни Альцгеймера 5
2. Влияние антиоксидантов - экранированных фенолов на структуру биологических мембран 9
3. Применение метода спиновых зондов для изучения мембранотропного действия и распределения во внутримембранном пространстве экзогенных соединений 13
4. Форма эритроцитов и ее изменения под влиянием различных факторов 24
4.1. Возможные механизмы морфологических трансформаций эритроцитов 26
4.2. Влияние экзогенных соединений на форму эритроцитов 34
3. Материалы и методы исследований 40
1. Объекты исследований 40
2. Выделение эритроцитарной массы 40
3. Приготовление и анализ образцов при использовании методов сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и световой микроскопии (СМ) 40
4. Исследование гемолитической активности ихфанов 42
5. Получение липосом 43
6. Приготовление образцов для ЭПР спектроскопии и анализ спектров ЭПР 44
7. Статистическая обработка результатов 48
8. Использованные в работе химические соединения 49
4. Результаты и обсуждение 51
1. Влияние ихфанов на морфологию эритроцитов 51
1.1. Оценка гидрофобности ихфанов с различными заместителями у четвертичного атома азота 51
1.2. Кинетика изменений морфологии эритроцитов под влиянием ихфанов 54
2. Гемолитическое действие производных ряда ихфанов 75
3. Влияние ихфанов на структуру мембраны эритроцитов и липосом .80
3.1. Структурные изменения эритроцитарной мембраны, индуцируемые производными ряда ихфанов 80
3.2. Модифицирующее действие ихфанов на структуру мембран лпосом 88
5. Заключение 99
6. Выводы 101
7. Приложение 104
7. Список литературы 105
- Влияние антиоксидантов - экранированных фенолов на структуру биологических мембран
- Форма эритроцитов и ее изменения под влиянием различных факторов
- Приготовление и анализ образцов при использовании методов сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и световой микроскопии (СМ)
- Приготовление образцов для ЭПР спектроскопии и анализ спектров ЭПР
Введение к работе
Актуальность проблемы. Важной задачей физико-химической биологии и фармакологии является поиск новых эффективных лекарственных препаратов. Одно из направлений поиска - создание препаратов комбинированного действия, то есть соединений, содержащих в своей структуре фрагменты, обладающие различными видами биологической активности. Таковыми являются синтезированные в ИБХФ РАН гибридные антиоксиданты - ихфаны (Никифоров и др., 2003). В их структуру включены два фрагмента, обеспечивающие антиоксидантную и антихолинэстеразную активности, кроме этого они имеют боковой алкильный заместитель с различным содержанием углеродных атомов в алифатической цепи, обуславливающий гидрофобные свойства производных этого ряда. Химический дизайн ихфанов, по мнению ряда авторов, позволяет рассматривать их в качестве перспективных препаратов для лечения болезни Альцгеймера (Braginskaya et al., 1996; Molotchkina et al., 2002; Бурлакова и др., 2003).
Выявлены высокая антиоксидантная активность ихфанов и их ингибирующее действие на ацетилхолинэстеразу эритроцитов человека, а также различия в эффективности действия разных по гидрофобным свойствам производных (Braginskaya et al., 1998; Озерова, 2000; Molotchkina et al., 2002; Никифоров и др., 2003).
Известно, что функциональная активность эритроцитов во многом определяется их формой и ее изменениями под влиянием биологически активных препаратов, при развитии патологических процессов в организме и действии других факторов (Sheetz, Singer, 1974; Bessis М., 1974; Козинец, Симоварт, 1984; Isomaa eta!., 1987; Лунева и др., 2002). До настоящего времени не было изучено влияние ихфанов на морфологию эритроцитов.
Важным этапом во взаимодействии экзогенного соединения с клетками является процесс его мембранного транспорта, в частности, интеркаляция в мембрану и распределение во внутримембранном пространстве (Stein, 1981; Гендель, Круглякова, 1986; Balaz, Lukacova, 2002). Несмотря на важность проблемы мембранный транспорт ксенобиотиков, в том числе органических катионов, все еще остается недостаточно изученным.
Не были исследованы особенности мембранного транспорта производных ряда ихфанов и их влияние непосредственно на структуру плазматической мембраны эритроцитов. В связи с этим в данной работе использовали методы сканирующей электронной микроскопии и спиновых зондов, позволяющие получать взаимодополняющую информацию о влиянии ксенобиотиков на морфологию эритроцитов и структуру эритроцитарной мембраны, а так же об особенностях распределения различных по гидрофобным свойствам соединений, в том числе и производных ряда ихфанов, во внутримембранном пространстве. Такая информация важна для понимания механизмов действия этих биологически активных веществ и разработки подходов к синтезу новых лекарственных препаратов.
ИОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ і
БИБЛИОТЕКА |
Цель настоящей работы. Изучить физико-химические особенности взаимодействия новых гибридных антиоксидантов ряда ихфанов с мембранами эритроцитов для установления взаимосвязи химической структуры производных с их интеркалированием в мембрану и распределением во внутримембранном пространстве и выяснения влияния гидрофобных свойств ихфанов на их мембранотропное действие.
Основные задачи исследования:
-изучить методом сканирующей электронной микроскопии действие производных ряда ихфанов на морфологию эритроцитов. Оценить влияние различных по гидрофобности боковых заместителей в структуре ихфанов на кинетику индуцируемых ими морфологических трансформаций эритроцитов и специфику распределения производных во внутримембранном пространстве;
- изучить гемолитическую активность ихфанов и выявить концентрации, в которых изученные производные оказывают гемолитическое действие;
-изучить методом спиновых зондов влияние ихфанов на структуру плазматической мембраны эритроцитов и мембран липосом. Провести сравнительный анализ эффективности структурно-модифицирующего действия производных с различными по структуре и гидрофобным свойствам боковыми заместителями.
Научная новизна работы. В работе впервые изучено влияние новых гибридных антиоксидантов - представителей гомологического ряда ихфанов на структурные особенности мембраны эритроцитов. Установлено, что ихфаны индуцируют изменения морфологии эритроцитов, оказывая эхиноцитогенное и стоматоцитогенное действия. Обнаружены различия в кинетике и эффективности трансформирующего действия различных по гидрофобным свойствам производных, отражающие особенности процесса их мембранного транспорта во внутренний монослой эритроцитарной мембраны.
Показано, что ихфаны с объемным гидрофобным заместителем способны вызывать гемолиз эритроцитов. Выявлена зависимость гемолитической активности от концентрации производного и структуры его гидрофобного заместителя.
Установлено модифицирующее действие ихфанов на структуру мембран эритроцитов и липосом. Выявлено уменьшение микровязкости как поверхностных, так и более глубоких областей эритроцитарной мембраны под действием ихфанов, а также влияние химической структуры и гидрофобных свойств бокового заместителя на характер распределения производных ряда ихфанов в мембране. Обнаруженные структурные модификации мембраны липосом ихфанами указывают на возможное участие липидной компоненты в их мембранотропном действии на эритропитарную мембрану.
Научно-практическое значение. Получены новые важные данные о мембранотроішом действии ихфанов, дополняющие характеристику их биологической активности как потенциальных лекарственных препаратов. Обнаруженные эффекты ихфанов необходимо учитывать при их возможном практическом использовании.
Результаты работы расширяют представления о взаимодействии органических катионов с биологическими мембранами, в частности, с мембранами эритроцитов, а также о влиянии гидрофобного замесштеля, введенного в структуру биологически активных соединений, на особенности их распределения во внутримембранном пространстве и их мембранотропные свойства.
Полученные данные вносят вклад в изучение механизмов действия гибридных соединений, в частности указывают на возможность неспецифического ингибирования мембраносвязанной ацетилхолинэстеразы эритроцитов ихфанами, обусловленного изменениями структуры мембраны.
Результаты работы могут быть использованы для выработки практических рекомендаций при выборе оптимального гидрофобного заместителя в молекуле ихфанов, а также для разработки подходов к направленному синтезу лекарственных соединений.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на 3-ей Молодежной конференции ИБХФ РАН - Вузы Биохимическая физика (Москва, 2003), 5 Meeting of European Federation of ESR Groups (Portugal, 2003), конференции "Фундаментальные науки - медицине", (Москва, 2003), Ш Съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004), конференции "Современные достижения магнитного резонанса" (Казань, 2004), European Association for Red Cell Research 15th Meeting (Murten, Switzerland, 2005).
Публикации no теме исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, заключение, выводы, приложение и список цитируемой литературы ( ^"работ). Работа изложена на /20 страницах и включает _ таблицы и $_ рисунков.
Влияние антиоксидантов - экранированных фенолов на структуру биологических мембран
Исследованые в данной работе антиоксиданты ихфаны содержат фрагмент, представленный экранированным фенолом. К настоящему времени уже разработано и используется большое количество синтетических антиоксидантов, содержащих аналогично природному антиоксиданту токоферолу фенольный фрагмент. К их числу относится 2,6-диизопропил фенол (пропофол) (Aarts at al., 1995), 1-гидрокси-2,6-ди-трет-бутил-4-метил-бензол (дибунол, ионол, ВНТ) (Бурлакова и др., 1975), фенозан, сульфидные и дисульфидные производные, амиды салициловой кислоты и другие. Антиоксидантиое действие этих соединений основано на реакции фенольного фрагмента со свободными радикалами, в результате которой образуется малоактивный феноксильный радикал.
Известно, что антиокислительная активность фенольных соединений зависит от структуры соединения. Так наличие в орто-положении от гидроксильнои группы объемных заместителей, которые осуществляют пространственное экранирование фенольной группы и стабилизируют феноксильный радикал, препятствует его дальнейшему взаимодействию с липидами мембраны и продолжению цепной реакции перекисного окисления. Ингибирующая активность фенольных антиоксидантов возрастает с увеличением числа третбутильных групп в орто-положении (Дюбченко и др., 2003; Гуреева и др., 2002). Кроме того, в ряде исследований обнаружена зависимость активности фенольных антиоксидантов от структуры нефенольной части молекулы. Активность может увеличиваться с увеличением гидрофобности соединения. Такая зависимость показана для аминоалкилфенолов (Дюбченко и др., 2003). Однако в работе (Liao, Yin, 2000) показано, что антиоксидантная активность флавоноидов отрицательно коррелирует с коэффициентом распределения, который является показателем гидрофобности соединения. Для достижения максимального антиокислительного эффекта в гомогенном растворе и мембранном окружении необходимы антиоксидантные молекулы с различной структурой (Yu et al., 1993); одни и те же молекулы антиоксидантов могут обладать различной активностью в мембране и в водном растворе. Кроме того, эффективность антиоксидантов зависит от внутриклеточной локализации молекулы вблизи мест продукции свободных радикалов (Tsuchiya et al., 2002). Для предотвращения ПОЛ мембран используются антиоксиданты, включающие в свою структуру фрагменты, обеспечивающие их встраивание в толщу мембраны.
Влияние антиоксидантов на структуру биологических мембран в настоящее время широко изучается. В частности, исследовано мембранотропное действие фенольных антиоксидантов на примере искусственных фосфолипидных мембран, мембран эритроцитов, тромбоцитов и других биологических мембран с использованием различных методов, позволяющих исследовать структурное состояние мембраны - с использованием спиновых и флуоресцентных меток, дифференциальной сканирующей калориметрии, рентгеноструктурного анализа.
Большинство исследований показали, что фенольные антиоксиданты вызывают снижение упорядоченности и уменьшение микровязкости биологических мембран. Так, методом спиновых зондов показано уменьшение упорядоченности мембран эритроцитов под влиянием различных концентраций пропофола (Tsuchiya et al., 2002). Снижение микровязкости было выявлено методом дифференциальной сканирующей калориметрии в липосомах под влиянием ряда фенольных антиоксидантов растительного происхождения. Также была отмечена способность липидных молекул к образованию ламеллярной фазы при взаимодействии с молекулами антиоксидантов (Guttierez et al, 2003). Отмечена способность фенольных антиоксидантов снижать микровязкость внутренних областей мембран тромбоцитов (Kitagawa et al., 1993). Серосодержащий фенольный синтетический антиоксидант пробукол (4,4 -(изопропилидендитио)-бис(2,6 ди-трет-бутил фенол)) вызывает увеличение упорядоченности фосфатидилхолиновых мембран, находящихся в жидкой фазе, причем наибольшее действие препарат оказывает на внутренние области мембраны. Однако вблизи точки фазового перехода и в мембране находящейся в гелевой фазе пробукол вызывает увеличение подвижности жирнокислотных цепей в мембране. Предполагается, что пробукол оказывает регуляторный эффект на микровязкость мембран (Subczynnski et al., 1994). Синтетические антиоксиданты производные фенозана также относятся к группе экранированных фенолов. Помимо антиоксидантних свойств они обладают широким спектром биологической активности. Выявлены нейрорегуляторные свойства этих соединений (Архипова и др., 1992; Федотова и др., 1990), в работах (Бурлакова и др., 1984; Жданов, Комаров, 1989) продемонстрирован терапевтический эффект фенозанов при лечении ожоговой болезни. Также установлено, что некоторые фенозаны влияют на активность аденилатциклазы в мембранных препаратах мозга (Мальцева, Бурлакова, 1986) и препятствуют специфическому связыванию опиоидных лигандов с рецепторами (Хохлов и др., 1986). Изучено влияние фенозанов на структуру биологических мембран. Показано, что фенозан вызывает изменение температуры фазового перехода, разупорядочение липидного бислоя липосом на основе фосфатидилхолина, а также вызывает полиморфные трансформации липидов, образование гексагональных структур и увеличение толщины мембранного бислоя (Погорецкая и др., 1999), Предполагается, что образование гексагональных структур может быть вызвано переходом части связанной воды мембраны в свободное состояние за счет взаимодействия с ОН-группой фенольного фрагмента (Архипова и др., 2002). Одним из показателей, позволяющих оценить структурное состояние мембраны эритроцитов, является их устойчивость к гемолизу. В ряде работ было показано, что антиоксиданты, в том числе синтетические антиоксиданты фенольного ряда, повышают устойчивость эритроцитов к гемолизу за счет снижения повреждения мембраны свободными радикалами (Liu et al., 1992; Tedesco et al., 2000 ,Tsuchiya et al, 2002). В то же время есть сведения о том, что ряд фенольных антиоксидантов вызывает прямое нарушение структуры эритроцитарной мембраны, не связанное с продукцией свободных радикалов, что приводит к гемолизу. К таким веществам относятся ВНТ (Nohl, Stolze, 1998), производные фенозана, содержащие четвертичный атом азота и длинный гидрофобный заместитель (Kleszczynska et al., 2000). В последнем случае обнаружена зависимость гемолизирующего действия антиоксиданта от длины гидрофобного фрагмента. Показано, что с увеличением объема молекулы антиоксиданта его деструктивный эффект на эритроцитарную мембрану увеличивается (Kleszczynska et al., 2000). Необходимо отметить, что амфифильные молекулы, встраивающиеся в мембрану, но не обладающие антиоксидантными свойствами, также могут оказывать защитный эффект при гипотоническом гемолизе эритроцитов, а при увеличении концентрации сами вызывают гемолиз (Isomaa et al., 1986; Isomaa, Engblom, 1988), причем оба эффекта также сильно зависят от структуры вещества. Защитный эффект, вероятно, связан с увеличением проницаемости мембраны, что приводит к уменьшению разности осмотического давления по разные стороны мембраны (Hagersrand, Isomaa, 1991; Isomaa et al., 1986). He исключено, что подобный механизм вносит вклад в антигемолитическое действие антиоксидантов.
Форма эритроцитов и ее изменения под влиянием различных факторов
В настоящее время широко изучаются механизмы влияния различных факторов на морфологию эритроцитов. Имеющиеся в литературе данные позволяют представить картину взаимосвязанных событий, приводящих к изменению формы клеток. Однако не все этапы данного процесса достаточно полно изучены, что объясняет сосуществование некоторых противоречивых гипотез.
Исследование морфологии эритроцитов и воздействия на нее различных физико-химических факторов необходимы как этап в выяснении механизмов нарушений функциональной активности эритроцитов при патологии. Помимо того, эритроциты являются удобным модельным объектом для изучения способности клеток изменять свою форму, для выяснения особенностей взаимодействия клеток организма с различными экзогенными соединениями и лекарственными препаратами. Также представляет интерес изучение влияния экзогенных биологически активных веществ непосредственно на клетки крови при попадании в кровяное русло.
Равновесной для эритроцита является форма двояковогнутого диска с гладкой поверхностью. Человеческий эритроцит имеет объем V=87 мкм3, площадь поверхности S—163 мкм2 (Черницкий, Воробей, 1981), Диаметр клетки 6,5 - 8,0 мкм, диаметр центральной впадины эритроцитов обычно составляет 35-65% от целого диаметра клетки (Козинец, Симоварт, 1984). В большинстве кровеносных сосудов красные клетки движутся в кластерах, а в малых капиллярах (диаметром 3-5 мкм) они отделяются друг от друга. Деформация эритроцитов обеспечивает их проход через капилляры. При этом форма, которую имеют эритроциты, очень важна для нормального движения красных клеток по капиллярам.
Для объяснения дискоидной формы эритроцитов важен тот факт, что поверхность клетки однородна в отношении ее формообразования. Оказалось, что «впадины» диска не связаны с определенными областями мембраны: если дискоцит, прикрепленный одним участком поверхности к предметному стеклу микроскопа, заставить перемещаться по стеклу (действием потока жидкости) то во «впадины» попадают различные области мембраны (Казенов, Маслова, 1987).
Кроме эритроцитов в виде двояковогнутого диска - дискоцитов, в крови также присутствуют и другие морфологические формы этих клеток. Эти формы описаны в работах ряда исследователей и для их систематизации предложены различные классификации, которые различаются по выделенным формам, их описанию и терминологии. Общепризнанной является классификация, предложенная М. Бессисом (Bessis, 1973; Bessis, 1974). Согласно этой классификации клетки в форме двояковогнутого диска называются дискоцитами, а модифицированные эритроциты можно отнести к следующим группам: эхиноциты - эритроциты, имеющие на поверхности выросты (кренации) той или иной длины. В зависимости от длины и количества кренаций различают эхиноциты I, Н, III стадий. стоматоциты - эритроциты в виде односторонне вогнутых дисков («сир» — форма) с гладкой поверхностью. В зависимости от степени инвагинированности клетки различают стоматоциты I, II, III стадий. сфероциты - диски равномерно округленные до полной сферы.
Присутствие небольшого количества модифицированных форм эритроцитов характерно для нормальной крови (Козинец, Симоварт, 1984). Их присутствие может быть связано с постоянно идущими процессами «старения» эритроцитов. При старении нарушается проницаемость мембраны для различных ионов и осмотический баланс, ухудшается деформируемость мембраны и изменяется форма клетки (Козинец, Симоварт, 1984).
Нормальная форма эритроцита (дискоидная) является оптимальной для поддержания нормальных реологических свойств крови. Считают, что образование стоматоцитов приводит к нарушению микроциркуляции, образование эхиноцитов - к ухудшению потока крови в больших сосудах за счет увеличения вязкости крови. Кроме того, эхиноциты и стоматоциты имеют меньшую способность к деформации, а эта характеристика важна для прохождения клеток крови по капиллярам (Nagasawa, 1981).
Приготовление и анализ образцов при использовании методов сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и световой микроскопии (СМ)
Для приготовления образцов для СЭМ и СМ использовали суспензии эритроцитов крысы и человека в буфере А, содержащие 0.8-1,1 К)7 кл/мкл. Суспензии после получения использовали не более чем через 30 мин.
В работе применяли методику фиксации эритроцитов, предложенную в работе (Козинец, Симоварт, 1984) с некоторой модификацией, которая заключалась в том, что не проводили дополнительную фиксацию образцов в 1% четырехокиси осмия и обезвоживание материала в серии разведений этанола. Использованная методика фиксации позволяла получать устойчивые морфологические формы эритроцитов.
Влияние ихфанов на морфологию эритроцитов изучали на суспензиях эритроцитов крысы. Инкубацию клеток с соответствующим производным проводили в течение различных интервалов времени от 2 до 120 мин (время указано в подписи к рисункам). Использовали следующую последовательность добавления компонентов: к эритроцитарной массе в буфере А добавляли вещества, растворенные в этаноле. В контрольные пробы вместо раствора вещества добавляли соответствующий объем этанола и инкубировали в течение 2 или 120 мин, конечная концентрация этанола в образцах не превышала 0.8 об.%. Обратимость действия ихфанов на морфологию эритроцитов исследовали на суспензиях эритроцитов человека. Для этого после инкубации с веществом эритроциты отмывали путем 3-х кратного центрифугирования при 350g в буфере A (t=+4C). Инкубацию во всех экспериментах проводили при температуре 18±2 С.
Фиксацию образцов проводили в 1% растворе глютарового альдегида (SERVA, Германия) в буфере А (рН 7,4) в течение 3 часов или в 2.5% растворе глютарового альдегида (Sigma, США) в течение 1 часа при комнатной температуре под тягой. Соотношение суспензии эритроцитов и фиксирующего раствора составляло в первом случае 3 : 8 и во втором 3 : 4. Для удаления глютарового альдегида фиксированные эритроциты промывали 4 раза в бидистиллированной воде посредством центрифугирования в течение 10 мин при 600g (t=18±2C).
Промытые фиксированные эритроциты наносили в виде мазков на покровные стекла, добиваясь равномерного - в один слой - распределения клеток.
Для анализа образцов методом световой микроскопии использовали световой микроскоп фирмы Carl Zeiss (Германия). Изображение фиксировали в виде графических файлов при помощи присоединенной к окуляру микроскопа цифровой веб-камеры. Регистрировали несколько полей для каждого образца и осуществляли подсчет содержания различных морфологических форм, значения выражали в процентах от общего количества клеток. В каждом образце рассматривали 400-500 клеток.
Для анализа методом СЭМ полученные мазки на покровных стеклах высушивали в течение 24 часов при комнатной температуре. Затем фрагменты мазков с плотным и равномерным распределением клеток приклеивали к предметному столику СЭМ. После этого на препарат напыляли слой платины с палладием толщиной 200 А в вакуумном ионном распылителе EIKO IB-3.
В работе использовали сканирующий электронный микроскоп CAMSCAN (Великобритания). Для получения более объемного изображения предметный столик помещали под углом 15-20 к потоку электронов. Проводили фотографирование полей с эритроцитами. Значения увеличений указаны в подписях к рисункам. Изображение фиксировали в виде графических файлов, по которым проводили подсчет морфологических форм эритроцитов. Количество рассмотренных клеток на каждый образец было также не менее 500. Для характеристики морфологии клеток использовали классификацию предложенную М.Бессисом (Bessis, 1974).
Приготовление образцов для ЭПР спектроскопии и анализ спектров ЭПР
Исследования методом ЭПР проводили на цельных эритроцитах и липосомах. Содержание в пробах цельных эритроцитов составляло 1x107 кл/мкл, липосом - 40 мг фосфолипида/мл. В качестве спиновых зондов в работе использовали спин-меченые производные стеариновой кислоты (5- и 16-доксилстеарат) (Sigma) и спин-меченое производное у-карболина (синтезирован в ИХФ РАН (Розанцев, 1970; Панасенко и др., 1980). Химические названия и структурные формулы использованных в работе нитроксильных радикалов приведены в таблице 2. Изучение влияния ихфанов на структуру эритроцитарной мембраны проводили с использованием в качестве спиновых зондов 5- и 16 -доксилстеарата (в дальнейшем обозначенные как зонды I и II, с оответственн о). встраивание зонда проводили с целью избежать взаимодействия спиновых зондов с вводимыми в среду инкубации ихфанами. Ихфаны в водных растворах в высоких концентрациях способны образовывать мицеллы. При взаимодействии в водной среде со спиновыми зондами мицеллы включают молекулы зонда в свою структуру, тем самым вызывая появление в результирующем спектре ЭПР суперпозиции сигнала зонда, растворенного в водной среде и взаимодействующего с мицеллой. Такая суперпозиция может затруднять анализ спектра ЭПР. Спектр ЭПР зонда, интеркалированного в мембрану демонстрирует только один тип сигнала - сигнал зонда в мембране, что свидетельствует об отсутствии значительных количеств зонда, растворенного в водной фазе. Это позволяет минимизировать взаимодействие зонда с мицеллами ихфанов и избежать появления суперпозиции сигналов. Конечная концентрация зонда в образце составляла lxl04M, После инкубации с зондом в суспензию эритроцитов добавляли исследуемое вещество в виде спиртового раствора и тщательно перемешивали.
Суммарное содержание этанола в образцах не превышало 1.2 об.%. Готовые пробы помещали в стеклянный капилляр с диаметром 1 - 0.9 мм, который размещали в резонаторе прибора. Измерения начинали через 2 мин после добавления вещества и проводили в различные интервалы времени от 2 до 60 мин. Контролем служили образцы, инкубировавшиеся в идентичных условиях, но в отсутствие испытуемого препарата. Влияние ихфаиов на структуру липосом изучали методом аскорбат-индуцированной гибели радикалов с использованием зондов I и III. При взаимодействии с экзогенным восстановителем аскорбатом натрия происходит восстановление парамагнитого фрагмента зонда, общее количество радикалов в образце снижается и амплитуда сигнала падает. По изменению скорости восстановления парамагнитных фрагментов зондов, интрекалированных в мембрану можно судить об изменении доступности их для экзогенного восстановителя. Изменение скорости диффузии молекул аскорбата через мембрану свидетельствует об изменениях структуры данных областей мембраны (Смит, Бутлср, 1979; Панасенко и др., 1983; Гендель, Круглякова, 1986). Суспензию липосом предварительно инкубировали с зондом в течение 5 мин для полной интеркаляции зонда в мембрану. Затем добавляли ихфаны в виде спиртовых растворов (конечная концентрация зонда 1 10"4М, этанола — 1.2 об.% ) и инкубировали в течение 30 мин, после чего добавляли водный раствор аскорбата натрия (Sigma). Конечная концентрация аскорбата составляла 4х10"3М. Регистрацию спектров начинали через 2 мин после добавления аскорбата и производили в различные интервалы времени от 2 до 30 мин. В табл.2 приведены типичные спектры ЭПР использованных в работе нитроксильных радикалов, введенных в изучаемые мембранные системы и схема оценки использованных параметров. При изучении влияния ихфанов на структуру эритроцитарных мембран в качестве структурно-чувствительных параметров использовали 2А у и т для зондов I и II, соответственно. Величину 2А ц (пропорциональную параметру порядка S (Смит и др., 1979) определяли как расстояние (в гс) между экстремумами спектра ЭПР в области низких и высоких полей (см. табл.2). Значения т оценивали с использованием формулы (Анциферова и др., 1977): где I ., / і — амплитуды, соответственно, низкополевой и высокополевой компонент спектра ЭПР, АН . — ширина (в гс) низкополевой компоненты спектра. Этот параметр характеризует среднее время поворота радикала на угол ти/2. Уменьшение параметров 2А ц и т свидетельствует о снижении микровязкости областей локализации парамагнитных фрагментов спиновых зондов. Для исследования влияния ихфанов на кинетику аскорбат-индуцированного восстановления радикальных центров спиновых зондов I и III использовали параметр hQ - у, ( _ « \, где hQ(t) - интенсивности центральной компоненты спектра ЭПР нитроксильного радикала в зависимости от времени t после введения аскорбата в суспензию липосом. В работе использовали ЭПР-спектрометры РЭ-1307 для изучения влияния ихфанов на структуру мембран эритроцитов и РЭ-1306 в случае изучения действия ихфанов на структуру мембран липосом. Регистрацию спектров ЭПР проводили при комнатной температуре (18±2С) при помощи компьютера с использованием оригинальной программы RESESR, разработанной на каф. биофизики Биологического ф-та МГУ, позволяющей производить накопление сигнала. Каждый экспериментально полученный спектр включал в себя 3 накопления. Для обработки спектров ЭПР использовали пакет программ Matlab 6.1.
Для калибровки магнитного поля использовали стандартный образец її Мп в MgO, расстояние между 3-ей и 4-ой компонентами спектра которого равно 86,7 Гс. 7, Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили на основе компьютерной программы Statistica 5.5 с использованием парного критерия Стьюдента (t-критерия) и критерия Стьюдента для независимых выборок. В случае анализа данных по влиянию ихфанов на структуру мембран эритроцитов использовали относительные значения изменения параметров, вычисленные по формуле: где Хоп и Хконтр — значение исследуемого параметра в опыте и контроле, соответственно. Значение АХ,% вычисляли для каждой пары опытов, отложенную на графиках ошибку среднего вычисляли для массива данных АХ,% для каждого вещества. Поиск статистически достоверных отличий между опытом и контролем проводили с использованием парного критерия Стьюдента, сравнивая выборки Хоп и Хконтр. В случае объединения данных первых 30 мин исследования кинетики действия ихфанов на мембрану эритроцитов значения Хоп и Хконтр для одного вещества для всех интервалов времени были объединены. Статистически достоверные отличия выявляли сравнивая с помощью парного критерия Стьюдента объединенные выборки оп И -Л.контр Каждое значение на экспериментальных кривых получено в результате обсчета данных 3-5 экспериментов в случае изучения морфологии эритроцитов, гемолиза и структуры мембран липосом и 8-21 экспериментов в случае изучения структуры мембран эритроцитов методом ЭПР (при объединении данных первых 30 мин количество экспериментальных данных на точку составляло от 56 до 147).
