Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основные свойства белковых молекул 11
1.1 Состави строение белков 11
1.2 Физико-химические свойства коллагена 13
1.3 Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля 16
Глава 2. Рассеяние света в растворах биополимеров. Метод статического рассеяния света 20
2.1 Основные положения теории рассеяния света 20
2.2 Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса и второго вириального коэффициента рассеивающих частиц 26
2.3 Теория Скэтчарда 30
Глава 3. Рассеяние света в растворах биополимеров. Метод динамического рассеяния света 31
3.1 Корреляционная функция интенсивности рассеянного света 31
3.2 Вириальное разложение для коэффициента трения в растворах белков 35
3.3 Теория Джеймса — Эванса 37
Глава 4. Обзор литературных данных по физическим свойствам коллагена
Глава 5. Экспериментальное исследование водных растворов коллагена методом статического светорассеяния 52
5.1 Объекты исследования и подготовка образцов для измерений 52
5.2 Описание экспериментальной установки 53
5.3 Результаты экспериментального исследования водных растворов коллагена методом статического светорассеяния 57
5.4 Обсуждение результатов и выводы 62
Глава 6. Экспериментальное исследование водных растворов коллагена методом динамического светорассеяния 64
6.1 Принципы работы фотонно-корреляционного спектрометра 64
6.2 Динамические свойства молекул коллагена в водных растворах с добавлением солей различных металлов 68
6.2.1 Экспериментальные результаты 69
6.2.2 Обсуждение результатов 74
6.3 Изучение угловых зависимостей интенсивности рассеянного света в водных растворах коллагена с добавлением солей различных металлов 79
6.3.1 Экспериментальные данные 80
6.3.2 Методы обработки экспериментальных данных (метод асимметрии и метод двойной экстраполяции) 81
6.3.3 Результаты, полученные с помощью обработки методами асимметрии и двойной экстраполяции 87
6.3.4 Обсуждение результатов 91
6.4. Исследование температурных зависимостей коэффициента трансляционной диффузии молекул коллагена в водных растворах 91
6.4.1 Результаты эксперимента 92
6.4.2 Обсуждение результатов и выводы 94
Выводы 98
Литература 99
- Физико-химические свойства коллагена
- Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса и второго вириального коэффициента рассеивающих частиц
- Вириальное разложение для коэффициента трения в растворах белков
- Описание экспериментальной установки
Введение к работе
Белки — высокомолекулярные природные органические вещества, играющие фундаментальную роль в структуре и жизнедеятельности организмов. Изучение белков как основного составного элемента живой природы, а также оценка влияния внешних факторов на белковые системы представляют собой огромный интерес для современной медицинской биофизики, молекулярной физики и экологии.
Макромолекулы белков, биополимеров и их водные растворы являются уникальными для исследования с помощью методов молекулярной физики, поскольку масса белковой макромолекулы строго определена для каждого типа белка, при этом поверхность белковой молекулы имеет определенную величину заряда, которую можно изменять путем изменения показателя рН раствора.
Актуальность темы исследования
Коллаген является одним из наиболее важных и распространённых белков в живых организмах, составляя одну треть всех белков массы человеческого тела. Различают около двух десятков типов коллагенов, самыми распространёнными из них являются первые четыре. Коллаген I типа - главный компонент кожи, сухожилий, связок и костей. Коллаген II типа - главный компонент хрящевой ткани. Коллаген III типа -упрочняющий компонент стенок полых органов, в том числе кровеносных сосудов и кишечника. Коллаген IV типа - упрочняющий компонент базальной пластины эпителия, фильтров в кровеносных капиллярах и других структурах. Коллаген выполняет главную структурную роль в организме. В связи с этим очень важными являются исследования как структурных изменений коллагена в водных растворах, так и процессов, связанных с объединением молекул в коллагеновые цепи - фибриллы, что определяет уникальные свойства костей, кожи и других тканей. [79,85]. Металлы необходимы для нормальной жизнедеятельности человеческого организма. Более 5% веса человеческого тела составляют натрий, калий, кальций и магний. Кальций - самый распространенный макроэлемент в организме человека, большая его часть содержится в скелете и зубах в виде фосфатов. Ионы кальция участвуют в процессах свертывания крови, мышечных и нейронных реакциях, а так же обеспечивают осмотическое давление крови. Калий и натрий играют важную роль в образовании буферных систем, предотвращающих сдвиги реакции среды и обеспечивающих их постоянство. Для всех тканей характерно определенное соотношение между концентрациями калия и натрия. В организме человека около 98% калия находится внутри клеток тканей, а в транспортных системах, где происходит синтез и транспортировка белка, преимущественно содержится натрий. Калий и натрий, играя важную роль в процессе внутриклеточного и межклеточного обмена, являются основными потенциалобразующими ионами. Вместе они участвуют в возникновении нервного импульса, механизме кратковременной памяти, влияют на состояние мышечной и сердечно -сосудистой систем. Изучение взаимодействия этих металлов с молекулами белков - важная и актуальная проблема современной биофизики и медицины. Другие металлы, такие как железо, кобальт, медь, молибден и цинк присутствуют в организме в связанном состоянии (гемоглобин, ферменты), а их содержание составляет менее 1% веса тела [11,12,20,18].
Тем не менее, превышение допустимой концентрации металлов в окружающей среде создает серьезную угрозу здоровью человека [65]. Особенно опасны тяжелые металлы, имеющие атомный вес больше 40. В значительной мере это связано с биологической активностью многих из них. Многие тяжелые металлы проявляют комплексообразующие свойства. В водных средах ионы этих металлов гидратированы и способны образовывать различные гидроксокомплексы, состав которых зависит от кислотности раствора. Если в растворе присутствуют какие-либо анионы или молекулы органических соединений, то ионы этих металлов образуют разнообразные комплексы различного строения и устойчивости.
В ряду тяжелых металлов одни крайне необходимы для жизнеобеспечения человека, другие вызывают противоположный эффект и, попадая в живой организм, они даже в небольших концентрациях способны серьезно нарушить нормальное течение физиологических процессов. Среди наиболее опасных для здоровья человека и животных выделяют ртуть, свинец и кадмий. Опасность свинца для человека определяется его значительной токсичностью и способностью накапливаться в организме. Проникая внутрь организма, свинец даже в малых количествах задерживается в нем и постепенно замещает кальций, который входит в состав костей. Это приводит к хроническим заболеваниям. Имея большой ионный радиус (Rpb2+=1,20 А), этот металл очень сильно влияет на процесс кластерообразования даже при очень малых концентрациях.
Белки в водных растворах имеют тенденцию к агрегации в зависимости от их физико-химического состояния. Этот процесс часто бывает необратимым и может являться признаком некоторых серьезных заболеваний в организме человека.
Агрегация и другие процессы, происходящие с белковыми макромолекулами в растворах, зависят от природы белков, их концентрации, типа растворителя, солей, ионов металлов, кислот, оснований, показателя рН, температуры и других факторов [92].
Патологические изменения в структуре коллагеновых фибрилл являются причиной ряда заболеваний соединительной ткани (коллагеновые болезни) и характеризуются поражением органов, а именно, суставов, сердца, сосудов, мышечной и кожной ткани.
Основной целью данной работы было исследование молекулярно-динамических процессов, происходящих в растворах молекул коллагена при воздействии различных параметров среды (рН, концентрация белка, ионная сила, температура), в том числе вредное воздействие ионов токсичных металлов методами статического и динамического рассеяния света.
Исходя из общей цели, в диссертации ставился ряд практических задач:
— исследование растворов макромолекул коллагена при изменении показателя рН среды с помощью метода статического рассеяния света;
— изучение влияния ионов металлов с различными ионными радиусами на динамические свойства молекул белка в водных растворах методом фотонно - корреляционной спектроскопии;
— получение и обработка угловых зависимостей интенсивности рассеянного света водных растворов коллагена при добавлении солей различных металлов с помощью метода динамического светорассеяния;
— исследование температурных зависимостей коэффициента трансляционной диффузии молекул в водных растворах коллагена в интервале температур от 24 - - 50°С.
В данной работе для определения молекулярных параметров коллагена использовались линейные оптические методы: статическое и динамическое рассеяние света. Особое внимание уделялось динамическому светорассеянию, с помощью которого изучались механизмы образования супермолекулярных наноструктур коллагена в водных растворах с ионами металлов, имеющих большие ионные радиусы. Научная новизна диссертации обусловлена рядом экспериментальных результатов, впервые полученных в данной работе:
1. С помощью метода статического светорассеяния были получены зависимости эффективной массы макромолекул коллагена в водных растворах при различных значениях показателя рН среды. При/?і74.5 значение молекулярной массы коллагена М=297000 г/моль хорошо согласуется с литературными данными.
2. Впервые была определена изоэлектрическая точка белка коллагена -рН 6.0 методом интегрального рассеяния света. Для определения изоэлектрической точки коллагена исследовалась зависимость коэффициента деполяризации от рН раствора. Экстремум этой зависимости наблюдается при значении рН 6.0.
3. Получено, что зависимость коэффициента межмолекулярного взаимодействия от рН в водных растворах коллагена нелинейна и имеет параболический характер с минимумом в изоэлектрической точке рНб.О белка.
4. Впервые с помощью метода фотонно - корреляционной спектроскопии получены значения коэффициента трансляционной диффузии в чистом водном растворе коллагена и в растворах, содержащих соли CaSC и NaCl. рН — зависимости коэффициента Dt имеют максимум близи изоэлектрической точки белка.
5. Впервые обнаружено, что размер ионных радиусов металлов сильно влияет на характер электростатического взаимодействия между макромолекулами коллагена. Взаимодействие ионов калия и тяжелого металла свинца, обладающих сравнительно большими ионными радиусами (К+- 1,33А, РЬ2+-1,2А), в растворах с коллагеном приводят к образованию макромолекулярных комплексов - дипольных белковых наноструктур.
6. Было показано, что значения коэффициентов трансляционной диффузии в водных растворах коллагена, содержащих соли КС1 и РЬ(СН3СОО)2, уменьшаются с ростом ионной силы раствора. Это указывает на увеличение массы частиц в растворах с ростом концентрации ионов К иРЬ . 7. С помощью данных по угловому рассеянию света в водных растворах коллагена с солями CaS04, NaCl, КС1 и Pb(CH3COO)2 оказалось возможным определить наиболее вероятную форму и размер наноструктур, образующихся в результате взаимодействия ионов металлов с молекулами белка.
8. Установлено, что коэффициент трансляционной диффузии при нагревании водного раствора коллагена имеет характерную зависимость с минимумом в области оптимальной температуры тела человека (37°С). В области данной температуры наблюдается, вероятно, фазовый переход и дальнейшее нагревание приводит к необратимым изменениям в структуре молекул белка - его денатурации.
9. Получено, что коэффициент трансляционной диффузии Dt при нагревании водных растворах коллагена, содержащих ацетат свинца, резко увеличивается в области температур 37-40°С, что вероятно, связано с разрушением дипольных кластеров.
В качестве основных результатов на защиту выносятся следующие положения:
1. На основании данных по статическому рассеянию света было получено, что коэффициент межмолекулярного взаимодействия имеет минимальное значение при рН 6.0 в водных растворах коллагена; эффективная масса молекул коллагена изменяется при различных значениях рН, причем максимальное значение молекулярной массы белка соответствует рН 6.0. Впервые была определена изоэлектрическая точка коллагена рН 6.0 по зависимости коэффициента деполяризации от показателя раствора/?77.
2. Впервые обнаружено образование наночастиц - белковых кластеров коллагена в водных растворах при взаимодействия молекул белка с ионами калия и свинца.
3. Показано, что массы образующихся наночастиц зависят от ионной силы растворов - увеличиваются с ростом концентрации ионов.
4. Обнаружен фазовый переход в водных растворах коллагена при температуре 37°С. Дальнейшее увеличение температуры приводит к необратимым изменениям в структуре молекул белка.
5. Установлено, что нагревание растворов коллагена, содержащих соль ацетата свинца, приводит к разрушению нанокластеров в области температуры 37°С.
Практическая ценность предлагаемого исследования заключается в том, что полученные в работе результаты способствуют развитию представлений о молекулярно-динамических процессах, происходящих в растворах белковых макромолекул, содержащих ионы легких и тяжелых металлов, а также вносят вклад в понимание природы межмолекулярных взаимодействий.
Изученное в работе поведение макромолекул коллагена в растворах и их взаимодействие с ионами различных солей, в том числе с ионами тяжелых металлов, позволяет установить возможные патологические процессы в организме человека, происходящие под воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды.
Как известно, токсичные и ядовитые вещества могут проникать внутрь организма через кожу и накапливаться в нем. Именно в коже содержится большая часть коллагена первого типа, который и являлся объектом исследования в данной работе. Содержание тяжелых металлов в окружающей нас среде увеличивается быстрыми темпами в результате деятельности человека, в связи с этим, изучение воздействия этих вредных факторов на организм человека, в том числе на слизистые оболочки и кожный покров, имеет важное практическое значение для медицины, экологии и косметологии.
Физико-химические свойства коллагена
Коллаген - фибриллярный белок, имеет нитеподобную структуру, состоящую из трех полипептидных цепей (каждая содержит более 1000 аминокислотных остатков), которые образуют правозакрученную трехспиральную структуру, стабилизированную водородными связями между боковыми группами составляющих ее аминокислот (рис.2). Различают несколько типов коллагена, отличающихся аминокислотным составом а - цепей [53].
Состав коллагена (процентное содержание аминокислот в коллагене). Анализ аминокислотного состава коллагена показывает {Табл.1), что на уС он состоит из глицина [16]. Цистеин и триптофан в нем не встречаются, а количество серосодержащих и ароматических аминокислот очень невелико. Около 20% аминокислот составляют пролин и оксипролин, присутствие которых обуславливает его жесткость. Роль этих аминокислот необычайно важна в стабилизации трехспиральной конформации молекул коллагена.
Фермент коллагеназа расщепляет коллаген на пептиды, в которых N - концевым остатком является глицин. Эта аминокислота входит во все пептиды, образующиеся при расщеплении коллагена. В наибольшем количестве в молекуле коллагена встречается пептид с последовательностью Гли - Про - Оксипро. За ним следует пептид Гли -Про - Ала.
Рентгенограммы коллагена [8] свидетельствуют о существовании винтовой оси нецелочисленного порядка с углом поворота 180 и трансляцией вдоль оси 2.86 А. Ассиметричной единицей этой структуры является группа из трех аминокислотных остатков. Из-за большого количества пролина и оксипролина коллаген не может образовывать а -спираль. Однако, его рентгенограммы свидетельствуют о наличии определенной спиральной структуры: три полипептидные альфа - цепи (первичная структура), свернутые в левую спираль (вторичная структура), ассоциируются с образованием тройной (право-закрученной) спирали, образуя молекулу коллагена .
В модели, изображенной на рис.2, три полипептидные цепочки свиты в правую слегка закручивающуюся тройную спираль, что обеспечивает некоторую растяжимость структуры. На один шаг спирали, равный 28.6 А, приходится 10 аминокислотных остатков. Каждая из трех цепочек, входящих в тройную спираль, является в свою очередь левой спиралью (это связано с наличием в ней пролина) с шагом "3 28.6 А. Вблизи оси тройной спирали должны располагаться лишь глициновые остатки. Таким образом, глицин является существенным элементом структуры.
При растворении коллаген образует молекулярные растворы. Молекулы коллагена имеют палочкообразную форму (рис.3). Длина молекулы 2900 А, диаметр 13.6 А, молекулярный вес примерно 270 - 345 000 г/моль. Удельное вращение коллагена [a ]d -400 град.
Молекулы коллагена в живых организмах самоассоциируются в фибриллы, которые в свою очередь, образуют супрамолекулярные ансамбли, выполняющие in vivo роль внеклеточного матрикса. Внеклеточный матрикс не только выполняет функции несущих конструкций, но и принимает участие в передаче информации клеткам, регулируя специфические взаимодействия с белками, нуклеиновыми кислотами и неорганическими ионами. [70,84].
Поскольку раствор в целом является электрически нейтральным, то около каждой заряженной группы на поверхности белковой молекулы должен находиться противоположно заряженный ион. Согласно теории Дебая-Хюккеля [17,18], исходящей из классической статистической механики и электростатики, каждая молекула оказывается окруженной атмосферой противоионов, что приводит к частичной экранировке кулоновских взаимодействий.
Для каждого белка существует определенное значение рН, при котором молекула в целом электронейтральна — так называемая изоэлектрическая точка (рТ). При значениях рН р1 белок будет обладать отрицательным суммарным зарядом, при рН р1 - положительным. Группы на поверхности белковой молекулы взаимодействуют сложным образом, и их ионизация происходит не независимо. Для анализа связи рН раствора с суммарным зарядом на белке существует уравнение для идентичных групп [16].
Полученное уравнение основывается на некоторых допущениях, поэтому не совсем точно согласуется с экспериментом [16,17]. Во-первых, форму молекул только приближенно можно считать сферической. Во-вторых, распределение заряда вблизи поверхности молекулы нельзя считать равномерным. Наконец, добавление любого электролита в раствор белка приводит к поляризации молекул, поэтому локальная диэлектрическая проницаемость не имеет постоянного по объему значения. На практике, для определения суммарного заряда на белке в растворах при различных значениях/?# используют данные по титрованию [3,22] или электрофорезу [17].
Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса и второго вириального коэффициента рассеивающих частиц
Эйнштейном на основе термодинамических соображений было получено более общее выражение для Rg0 [15]. С учётом этого выражения (2.18) сводится к (2.3). Оптическая постоянная раствора находится путём рефрактометрических измерений dn/dc. Экстраполяцию выполняют сН графически, откладывая - «о как функцию с. Наклон прямой позволяет вычислить коэффициент В. Напомним, что второй вириальный коэффициент характеризует степень неидеальности раствора и учитывает парные межмолекулярные взаимодействия в растворе. Термодинамическая теория растворов макромолекул даёт следующее выражение для В: в = v 2М2 , (2.23) где v0 - исключённый объём, то есть объём, из которого молекула вытесняет все остальные. Отметим также, что мультиплетные взаимодействия, описывающиеся третьим вириальным коэффициентом, проявляются в cH искривлении прямых, выражающих зависимость 90 от с.
Парциальное разложение осмотического давления строго применимо, вообще говоря, лишь для растворов нейтральных частиц, потенциал притяжения между которыми является ван-дер-ваальсовым и спадает как г 6. Белковые же молекулы в растворах при всех значениях рН, кроме изоэлектрической точки, являются заряженными. Потенциал взаимодействия между ними является кулоновским и спадает как г 1. Тем не менее, как уже было указано, вокруг макроиона, согласно теории Дебая Хюккеля, образуется атмосфера противоионов, экранирующая кулоновское взаимодействие. И если рассматривать разбавленные растворы, в которых дебаевский радиус экранировки rD d, d - среднее расстояние между макроионами растворённого вещества, то изложенная выше теория оказывается применима к белковым растворам. При этом из-за отталкивания одноимённо заряженных макроионов будет расти исключённый объём, и В, соответственно, будет иметь большие значения, чем для раствора нейтральных молекул. Следовательно, можно ожидать определённой зависимости В от //, каковая была приведена выше. 2.3 Поведение коэффициента межмолекулярного взаимодействия в трехкомпонентных растворах. Теория Скэтчарда.
Взаимодействие макроионов в растворе, содержащем кроме низкомолекулярного растворителя еще и третью компоненту - сильный электролит, было рассмотрено в теории Скэтчарда [1,3,4,16,18]. Параметры Д- характеризуют эффект исключенного объема и взаимодействие между парами ионов (индекс 2 -макромолекула белка, 3 - ион соли). Очевидно, что коэффициент взаимодействия меняется с ростом суммарного заряда на белке по параболическому закону (эффект Доннана) с минимумом в изоэлектрической точке [18]. Параметр Р22 обычно незначителен, а третий член в (2.24) может принимать достаточно большие значения, так что при существенной концентрации соли в растворе В может стать отрицательным [46,72]. При возрастании ионной силы (т3) вокруг заряженной молекулы белка в растворе возникает облако противоионов, экранирующее кулоновские взаимодействия; коэффициент В уменьшается и стремится к величине, характерной для полностью незаряженных молекул и определяемой ван-дер-ваальсовыми силами, однако параболический вид зависимости В(рН) сохраняется. Глава 3. Рассеяние света в растворах биополимеров. Метод динамического светорассеяния 3.1 Корреляционная функция интенсивности рассеянного света
Из условия стационарности случайной функции s{t) следует, что коэффициенты аю некоррелированы. Однако, если наложить несколько более жесткое условие, а именно потребовать, чтобы эти коэффициенты были статистически независимы, то можно получить рад существенных результатов.
Это - отношение Зигерта [86]. Формула (3.20) - одно из проявлений очень существенного свойства, определяемого распределением (3.13), которое состоит в том, что статистические характеристики высоких порядков для гауссова поля (3.9) выражаются через корреляционную функцию первого порядка.
Важность соотношения Зигерта для рассматриваемых методов измерения заключается в том, что оно позволяется вычислить спектральные характеристики первого порядка по корреляционной функции второго порядка или корреляционной функции интенсивности g{2)(j), которая как уже было показано, является простейшей спектральной характеристикой и может быть измерена с учетом специфики процесса детектирования. В отличие от сигналов с гауссовой статистикой, для которых справедливость соотношения Зигерта указывает лишь на то, что поле является суперпозицией большого числа независимых компонент, связь между g(1)(r) и g(2)(r) в случае негауссовой статистики может содержать весьма ценную информацию о механизме процесса рассеяния.
Вириальное разложение для коэффициента трения в растворах белков
Многочисленные исследования белка коллагена за последние десятилетия раскрыли особенности его молекулярной структуры, механизма биосинтеза и процессов фибриллообразования. Несмотря на широкое изучение молекул коллагена в водных растворах количество важных вопросов остаётся нерешенными. Исследование физических свойств коллагена методом статического светорассеяния Статическое рассеяние света даёт быстрый и точный способ для определения молекулярного веса и коэффициента межмолекулярного взаимодействия (второй вириальный коэффициент). Он использовался для изучения полимеров и коллоидных систем около 40 лет, и много обзорных статей и книг было опубликовано по данной теме [7,45,56,77].
Исследования коллагеновых волокон с помощью электронного микроскопа и рентгеноструктурного анализа проводилось еще с 1927 г. Но первые работы по светорассеянию были опубликованы спустя 20 лет. К таким работам можно отнести исследования П.М. Галопа [9]. Он изучал коллаген, полученный из оболочки плавательного пузыря карпа. По данным, полученным с помощью статического светорассеяния, измерениям вязкости растворов и центрифугированию, можно было прийти к выводу, что молекула коллагена имееет длинную нитевидную структуру с весом М=1 700000 г/моль и длиной L=13 000 А. Примерно в это же время, П.О. Смидт и др. [5], изучали структуру фибрилл коллагена с помощью электронного микроскопа. В результате они получили, что размер фундаментальной единицы, образующей коллагеновую фибриллу (в данном случае - молекула коллагена), не превышает размера L=3000 А. Для того чтобы улучшить данные, характеризующие молекулярные свойства коллагена, и разрешить противоречия в уже имеющихся результатах, полученных другими учеными, X. Боедткер и П. Доти [6] исследовали коллаген, полученный из плавательного пузыря карпа. Поскольку самое большое количество ранних работ было выполнено по светорассеянию, именно с этого метода X. Боедткер и П. Доти начали изучать молекулярные свойства коллагена.
По результатам, полученным с помощью метода статического светорассеяния, было вычислено среднее значение молекулярного веса и второго вириального коэффициента коллагена: М=345000 г/моль, В=3 10"4 см моль/г, а также построен график Зимма (воспроизводимый с достаточной точностью).
Анализируя полученные данные, X. Боедткер и П. Доти пришли к выводу, что молекулы коллагена состоят из трех полипептидных продольных цепей, имеют стержнеобразную форму со средним значением молекулярного веса М=340000 г/моль, длиной L=3000 А и толщиной D=13.6 А. Так как измерения по осмотическому давлению и двулучепреломлению потока в растворах коллагена были выполнены впервые, то их невозможно было сравнить с другими данными. Позже аналогичные результаты по светорассеянию были получены Б. Обринком. Он изучал свойства коллагена, полученного из кожи крысы, в фосфатном буферном растворе (рН 7.4) [23]. С помощью двойной экстраполяции Зимма были определены значения молекулярного веса коллагена М=320000 г/моль и радиуса вращения Rg=900 А (по начальному наклону линии к нулевой концентрации), соответствующему форме молекулы - палочке длиной L=3100 А. Эти результаты хорошо согласуются более ранними исследованиями X. Боедткерр и П. Доти [6].
Исследование физических свойств коллагена методом динамического светорассеяния Динамическое рассеяние света дает быстрый и точный метод для определения коэффициентов диффузии макромолекул в растворах [25,68,82,90]. Существует два метода для изучения молекулярных свойств белков в водных растворах при динамическом светорассеянии. Первый -спектроскопия флуктуации интенсивности света. В этом методе анализируется спектр фототока. Второй - фотонно - корреляционная спектроскопия, в котором измеряется автокорреляционная функция фотоэлектрических импульсов. Фотонно - корреляционная спектроскопия — это полностью цифровой метод, используется для компьютерного анализа и в целом является более точным, чем первый метод.
Первые работы по изучению свойств молекул коллагена методом спектроскопии флуктуации интенсивности были выполнены М.Френчем, Б. Обринком и др. [23]. После многократных измерений было получено значение коэффициента трансляционной диффузии порядка 7.8-10" см /с. Это хорошо согласовалось с результатом, рассчитанным по гидродинамической теории для молекул формы палочки с длиной L-3000 А и диаметром D=14 А.
Наиболее детальное изучение молекулярных свойств коллагена методом спектроскопии флуктуации интенсивности света провёл С. Флетчер с сотрудниками [26,28]. Они изучали свойства коллагена, извлеченного из сухожилий хвоста крысы. В результате была получена концентрационная зависимость коэффициента трансляционной диффузии молекул коллагена в водных растворах с максимальным значением: ),=8.6-10" см /с, соответствующему концентрации белка с=0.4 мг/мл.
Описание экспериментальной установки
Вертикально поляризованный пучок света {1=6328 Л) через призму подается на цилиндрическую стеклянную кювету с исследуемым раствором. Падающий луч модулируется электромеханическим прерывателем с частотой —70 Гц, что позволяет отделить сигнал от фоновой засветки. Рассеянный под углом 90 свет регистрируется фотоэлектронным умножителем, сигнал с которого затем поступает на резонансный усилитель У2-6 и отображается на экране осциллографа. Система из призмы Волластона, поляроида и диафрагм позволяет разделить поляризованную и деполяризованную компоненты рассеянного излучения (/// и Ij_ соответственно) и измерять их интенсивности независимо.
Усиленный сигнал подаётся на компьютер и оцифровывается с помощью АЦП (его роль выполняла звуковая карта "Creative SoundBlaster 16"). Обработка результатов проводится в автоматическом режиме непосредственно в течение эксперимента. Для этой цели с помощью языка программирования "C++" было разработано приложение, которое позволяет динамически наблюдать временную развертку сигнала на мониторе, быстро сделать выборку измеряемых интенсивностей и оценить результаты для текущих значений интенсивности и параметров раствора. Программа производит экстраполяцию рабочих зависимостей параметра рассеяния (с) методом наименьших квадратов, рассчитывает ошибки эксперимента и выводит результаты в виде графиков и таблиц в формате ASCII, свободно импортируемые в такие средства аналитической обработки, как "Origin " или "Excel".
Автоматизация обеспечивает удобство проведения эксперимента и обработки результатов, экономит время и позволяет избежать значительных ошибок, обусловленных качеством поверхности кюветы, чистотой оптических частей, стабильностью приборов, а также разбросом точек из-за бликов и неоднородностей в растворе.
В ходе экспериментов снималась зависимость /// и 1± от концентрации белка в растворе. Концентрация белка изменялась с шагом 0,055 мг/мл, путем добавления в приготовленный раствор [п. 3.J исходного концентрированного раствора белка [п.2.] по 60 мкл. По методике, предложенной ранее и запатентованной в нашей лаборатории, можно с высокой точностью определить изоэлектрическую точку белков [40], для чего необходимо получить рН - зависимость коэффициента деполяризации. Для определения изоэлектрической точки коллагена была получена зависимость коэффициента деполяризации Av от показателя рН раствора (рис.20). Экстремум этой зависимости наблюдается при значении рН 6.0, что связано с минимизацией суммарного поверхностного заряда на молекулах белка.
Было получено значение молекулярной массы коллагена Мэфф=297000 г/моль при рН 4.5 {рис. 14), которое хорошо согласуется с литературными данными Ммт=320-340000 г/моль [6,23]. Поскольку свойства молекул белка сильно зависят от показателя рН среды, то важно было изучить с помощью статического светорассеяния, как масса рассеивающих частиц коллагена и второй вириальный коэффициент зависят от поверхностного заряда макромолекул коллагена.
Из сопоставления экспериментальных данных {рис. 13,14,15,16,17,18) видно, что эффективная масса рассеивающих частиц увеличивается в области изоэлектрической точки (рис. 16,18). Это дает основание предполагать, что при увеличении показателя рН раствора, возможно, наблюдается тенденция к слипанию двух или даже трех молекул коллагена. Этот процесс может происходить, когда поверхностный заряд на белке минимален. При этом возможно взаимодействие между молекулами за счет сил Ван - дер - Ваальсого притяжения, в результате чего эффективная масса молекул коллагена увеличивается.
Согласно теории Скэтчарда (Гл.2, раздел 2.3) коэффициент межмолекулярного взаимодействия должен иметь минимальное значение в изоэлектрической точке белка. Полученная зависимость коэффициента межмолекулярного взаимодействия В от рН в водных растворах коллагена, имеет вид близкий к параболическому с минимумом в изоэлектрической точке белка рН 6.0 (рис.19). Это связано с тем, что в области изоэлектрической точки изменяется характер межмолекулярного взаимодействия.
