Введение к работе
Актуальность работы. Антнбиотики-актиномицины в течение " нескольких десятилетий используются в медицинской практике для лечения инфекционных и опухолевых заболеваний [Планельес Х.Х. 1962, Терентьева Т.Г. 1977, Frei Е; 1974].. Такое применение основано на способности актиномицинов формировать устойчивый комплекс с молекулой ДНК, ингибировать РНК-полимеразную реакцию и, таким образом, подавлять биосинтез белка, рост клеток и тканей.
Однако до сих пор не сформировано однозначного представления о механизме взаимодействия актиномицинов с ДНК и структуре формирующегося комплекса; существуют лишь противоречивые модели [Сазыкин Ю.О. 1965., Егоров Н.С. 1985]. Наиболее распространенная из них предусматривает решающее значение интеркаляции хромофора актиномицина между азотистыми основаниями ДНК [Jain S.C. 1971, 1972, Sobell Н.М. 1972]. Согласно другой, модели, комплексообразование происходит за счет встраивания хромофора и пептидной части молекулы в малую бороздку ДНК [Гурский Г.В. 1969].
Кроме того, существуют данные о том, что актиномицин связывается преимущественно со шпилечными образованиями ДНК и что для эффективного комплексообразования необходимо наличие участков, богатых гуанином [Егоров Н.С. 1985, Krugh Т. 1972, Wadkins R. 1991,1998].
Ранее 'были изучены механизмы встраивания гетерохромофорных молекул в ДНК и сформированы представления о закономерностях таких взаимодействий [Полетаев А.И. 1976, Борисова О.Ф. 1973, Жузе А.Л. 1980, 1985,1998]. '
Актиномицины являются эффективными противоопухолевыми препаратами, однако их медицинское использование ограничено выраженным побочным токсическим действием, обширным рядом противопоказаний.
Недостаточное понимание ДНК-актиномицинового взаимодействия препятствует поиску путей оптимизации медицинского использования антибиотиков на основе актиномицинов, связанных с разработкой способов трансмембранного переноса, направленной доставке препарата в клетку, снижению побочных токсических эффектов при противоопухолевой терапии.
Необходимо детальное изучение механизма комплексообразования актиномицинов с ДНК. При этом представляется важным сделать акцент на исследовании при малых (терапевтических) концентрациях и в 'зависимости от агрегатного состояния ДНК. Актуальной задачей также является поиск путей направленной доставки актиномицина в клетку.
Научная новизна. Методологической новизной данной работы является применение комплекса спектроскопических методов (абсорбционная спектроскопия в УФ, видимой и ИК-областях; стационарная, фазово-модуляционная, поляризационная и «stopped-flow» флуоресцентная спектроскопия). Кроме ДНК использованы модельные нуклеотидные
системы в сочетании с применением флуоресцирующего аналога актиномицина. Впервые для анализа интеркаляционной способности актиномицина (одной из основных характеристик механизма этого комплексообразования) используется высокочувствительный метод анализа декстеровского обменного переноса энергии.
Показано отсутствие интеркаляционных механизмов в формировании ДНК-актиномициновых комплексов в растворе.
Установлено, что феноксазоновый хромофор актиномицина находится ,
в окружении азотистых оснований ДНК, в состав комплекса входят молекулы воды, но комплексообразование не сопровождается формированием комплекса стэкингового интеркаляционного типа.
При сравнительном анализе взаимодействия актиномицинов с *
растворенной и конденсированной ДНК обнаружены принципиальные различия механизмов комплексообразования и свойств формирующихся комплексов.
Обнаружено и исследовано явление перемещения актиномицина из комплекса со шпилечным олигонуклеотидом на ДНК. Показана способность шпилечного олигонуклеотида выполнять функцию трансмембранного переносчика актиномицина к ядерной ДНК на клетках асцитной карциномы.
Научно-практическая ценность.
Показанное отсутствие интеркаляции при формировании ДНК-актиномициновых комплексов при микромолярных (терапевтических) концентрациях может быть основанием для разработки производных актиномицина для оптимизации его медицинского использования.
Обнаруженное различие механизмов комплексообразования актиномицина с растворенной и конденсированной ДНК дает возможность для дифференциации понимания актииомицинового эффекта в отношении "свободной" цитоплазматической ДНК и ДНК в составе нуклеопротеидных и нуклеолипидных комплексов. Это потенциально позволяет вносить корректировки в выбор производных актиномицина и учет схем и дозировок актиномициновои терапии в зависимости от состояния клеточного хроматина, стадии клеточного цикла и митотической активности ткани.
Способность шпилечного олигонуклеотида выполнять функцию '
переносчика актиномицина в клетке дает возможность развития нового направления повышения эффективности этого препарата при противоопухолевой терапии.
Целью работы является спектроскопическое изучение механизма комплексообразования ДНК с актиномицином в растворе и пленках, мест встраивания актиномицина и свойств формирующегося комплекса, а также поиск возможных способов направленной доставки актиномицина в клетку к ядерной ДНК.
Задачи работы:
-
Исследовать комплексообразующую способность актиномицинов в отношении агрегатов гуанина и полигуаниловой кислоты как системы, моделирующей участки ДНК, обогащенные остатками гуанина.
-
Определить способность актиномицина к* формированию интеркаляционного комплекса с ДНК, шпилечным олигонуклеотидом, полигуаниловой кислотой,
-
Сравнить комплексообразующие свойства актиномицина D и его флуоресцентного аналога 7-аминоактиномицина D в отношении полигуаниловой кислоты, гуанина и шпилечного олигонуклеотида НР1.
-
Оценить сродство актиномицина к шпилечным образованиям ДНК и способность шпилечных структур выполнять функцию переносчика актиномицина.
-
Определить характер молекулярного окружения актиномицина в комплексе с ДНК, наличие в нем молекул воды и значение водородных связей.
-
Провести сравнительный анализ механизма комплексообразования актиномицина с растворенной ДНК и с ДНК, конденсированной в пленку.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на-УГП Зимней международной молодежной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии." (Москва, Институт биоорганической химии, 7-9 февраля 2001 г.); на V конференции молодых ученых г. Пущино"Биология - наука 21 века." (16-20 апреля, Пущино, 2001 г.); на VI конференции молодых ученых г. Пущино "Биология - наука 21 века." (20-24 мая, Пущино, 2002 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена пв.~/Ж& страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения и списка литературы ("/vet ссылок). Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и содержит 11 таблиц.
Список сокращений. AMD - актиномицин D, 7AAMD - 7-аминоактиноми-u#hD.
В работе использовали актиномицин D ("Reanal", Венгрия), 7- амино-актиномицин D ("Fluka", Чехия), олигонуклеотнд НР1 ("Midland Certified Reagent Company". Также использовали несколько видов ДНК: ДНК тимуса теленка ("Serva", Германия), ДНК спермы лосося No 101500 ("ICN") и ДНК фага X No 25250-010 ("GibcoBRL",CIIIA)
Для получения спектров УФ-поглощения л флуоресценции использовали растворы веществ в какодилатном буфере концентрации 10 мМ (рН = 7.6). Для флуоресцентных измерений методом "stopped-flow"
использовали растворы в 10 мМ Tris-HCl буфере с 0.5 мМ ЭДТА (рН 7.6) и 20 мМ Tris-HCl буфере (рН 7.6). При флуоресцентных исследованиях концентрация 7AAMD и этидия бромида составляла 1 мкМ, концентрация ДНК, поли-G и НР1 в пересчете на нуклеотиды - 6 мкМ. При изучении комплексов методом абсорбционной спектроскопии использовали более высокие концентрации (в 2-3 раза).
Спектры поглощения растворов исследуемых веществ в ультрафиолетовой и видимой областях регистрировали на спектрофотометре "Specord М-40" (Германия) в 1-см кварцевых кюветах в диапазоне 220-700 нм.
ИК-спектры пленок ДНК и ее комплексов регистрировали в диапазоне 4000-900 см"1 на спектрофотометре "Specord М80" (Германия). ИК спектры растворов в тяжелой воде были получены на этом же приборе с помощью флюоритовых кювет толщиной 70 мкм.
Испускание флуоресценции 7AAMD регистрировали в дипазоне от 580 до 700 нм (возбуждение - 530 нм), этидия бромида - в диапазоне от 570 до 670 нм (возбуждение - 500 нм) на флуориметрах "Perkin-Elmer MPF44B" (США) и «SLM-4800» (США) со щелями монохроматоров 8 нм на возбуждении и 4 нм на испускании. Спектры возбуждения флуоресценции регистрировали в диапазоне от 240 до 300 нм в ультрафиолетовой и от 450 до 650 нм в видимой областях со щелями монохроматоров 4 нм на возбуждении и 8 нм на испускании при положении монохроматора испускания 650 нм для 7AAMD и 610 нм для этидия бромида.
Время жизни флуоресценции определяли фазово-модуляционным методом на фазово-модуляционном спектрофлуориметре «SLM-4800» (США) при частоте модуляции 30 МГц и щелях монохроматора возбуждения - 1 нм и монохроматора излучения 16 нм.
Значения деполяризации флуоресценции определяли на спектрофлуориметре «SLM-4800» (США) в стационарном режиме и статическом положении поляризаторов (параллельно и перпендикулярно плоскости поляризации световой волны) при щелях монохроматора возбуждения и испускания 8 нм.
В основе методики сравнительного спектроскопического изучения пленок и растворов исследуемых веществ лежало сравнение оптических и спектральных свойств раствора и пленки одного и того же комплекса. При этом выполнялись условия, при которых пучок света спектрального прибора проходил через часть образца (пленки и раствора), содержащую одинаковое количество вещества.
Быструю кинетику связывания 7AAMD с НР1 или ДНК в миллисекундном временном диапазоне изучали по изменению интенсивности испускания флуоресценции, которое регистрировали на "stopped-flow" флуориметре "Applied Photophysics" (США) с возбуждением 550 нм.и эмиссионным фильтром > 570 нм.
Изменения интенсивности испускания флуоресценции при связывания 7AAMD с ДНК и перемещении 7AAMD с НР1 на ДНК в минутном
временном диапазоне регистрировали на стандартном спектрофлуориметре "Perkin-EImer MPF44B" (США) в 1-см кварцевых кюветах на 610 нм (при возбуждении 570 нм).
Количество молекул (N), донирующих возбуждение на одну молекулу акцептора, и эффективность переноса энергии (Q) определяли по формулам [ВекшинНЛ. 1998,2002]:
N = Fsaa/FaEd (1)
Q = Fsa еа [a] I Fa ed Щ (2)
Здесь Fsa - интенсивность сенсибилизированной флуоресценции акцептора, возбуждаемого в донорной полосе поглощения, Fa -интенсивность флуоресценции акцептора, возбуждаемой в его собственной полосе, єа - коэффициент- экстинкции акцептора, ed - коэффициент экстинкции донора, [а] - концентрация акцептора. [d\ - концентрация донора.
Эффективный объем флуоресцирующей частицы определяли по известному уравнению Левшина-Перрена:
(3)
Здесь Ро - предельная поляризация (она равна 0.5 для 7AAMD в замороженных растворителях), Р - это измеренная поляризация, т - время жизни, Г| - вязкость водного раствора (0.012 пуаз для воды при 13С), Т -абсолютная температура (286К), R- универсальная газовая постоянная и V -эффективный объем частицы. .
