Введение к работе
Актуальность работы. Одно из основополагающих природных свойств полинуклеотидов состоит в их способности ассоциироваться с различными биополимерами и низкомолекулярными соединениями с образованием функциональных супрамолекулярных комплексов. Надмолекулярные ассоциаты полинуклеотидов - естественная форма их существования. Конструирование искусственных комплексов ДНК и структурно-функциональное исследование таких модельных систем - продуктивный прием, как для изучения естественных природных процессов, так и для создания новых подходов к решению широкого спектра актуальных прикладных задач. В настоящей работе рассмотрены три группы супрамолекулярных ассоциатов ДНК. 1. Наиболее близкие природным аналогам нуклеопротеиновые транспортные комплексы для направленной доставки чужеродных олиго-/полинуклеотидов в целевые клетки живого организма. 2. Комплексы, моделирующие свойства живой системы [живая клетка - фиксированная на внешней мембране ДНК - комплементарная нуклеотидная последовательность]. 3. Искусственные ассоциаты ДНК и нуклеопротеиновые ансамбли с наночастицами металла (никеля).
Необходимость применения специальных транспортных систем для доставки чужеродного генетического материала в клетки-мишени остается существенным препятствием на пути развития генотерапии. Наибольшая избирательность в отношении целевых клеток показана для белковых переносчиков чужеродного генетического материала, использующих естественные механизмы клеточного обмена. В настоящее время, несмотря на обнадеживающие лабораторные результаты, известные белковые векторы в силу различных причин не удовлетворяют требованиям клинического применения. Поэтому особенно актуальна разработка новых подходов к созданию белков-транспортеров ДНК, способных к самопроизвольной сборке с различными терапевтически значимыми молекулами олиго- и полинуклеотидов с образованием стабильных в биологических жидкостях функциональных надмолекулярных комплексов. Для этой цели необходимо изучение закономерностей образования и структурно-функциональных свойств таких нуклеопротеиновых ассоциатов. Полученные результаты могут стать основой для разработки новых универсальных и технологически доступных неиммуногенных белковых векторов, необходимых для создания различных лекарственных средств для генотерапии заболеваний различной этиологии.
Многие адгезивные манипуляции с живыми клетками основаны на бинарных лиганд-рецепторных взаимодействиях. Для направленной мультиаффинной иммобилизации клеток на твердом носителе недавно было предложено снабдить поверхность клеток фрагментами ДНК. Для этого проводили ковалентную конденсацию активированных олигонуклеотидов с олигосахаридами клеточной мембраны, модифицированными азидо-группами {Chandra, 2006), что и придавало клеткам искусственное сродство к комплементарным последовательностям ДНК. Реализация этой привлекательной и перспективной идеи осложнена и ограничена необходимостью использования небезопасных абиогенных интермедиатов и длительностью (трое суток) процедуры ДНК-модификации клеток. Создание нового способа быстрой, эффективной и безопасной для жизнеспособности клеток ассоциации ДНК с плазматической мембраной чрезвычайно актуально для развития новых подходов в инженерии тканей, получения искусственных межклеточных ассоциатов, разработки новых биосенсорных систем.
Одно из направлений в нанотехнологии состоит в получении новых материалов с использованием фрагментов ДНК, ковалентно связанных с наноразмерным носителем, например, частицами золота (Crocker, 2008). Наночастицы никеля, в сравнении с ранее описанными платформами, обладают рядом привлекательных свойств, обусловленных их электропроводными и магнитными характеристиками, а также уникальной способностью удерживать гистидинилированные белки (Becerril , 2006, Лазарев, 2007). Поэтому создание биосенсоров и диагностических систем на основе подобных биополимерных структур представляет значительный интерес. Однако, закономерности процессов сборки ассоциатов наночастиц никеля с олигонуклеотидами и белками до сих пор не изучены. Непосредственная же металлизация ДНК путем восстановления катионов никеля приводит к изменению конформации и потере природных свойств полинуклеотида (Becerril, 2005, 2006). Особенно важно в этой связи изучить условия образования комплексов и подтвердить целостность и функциональность молекул в их составе.
В настоящей работе большое внимание уделено исследованию, разработке и оптимизации методов синтеза фрагментов ДНК, в том числе содержащих модификации сахаро-фосфатного остова и различные заместители, способов получения рекомбинантных белков, а также подходов к формированию и анализу структуры комплексов полинуклеотидов.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состоит в конструировании искусственных ДНК-содержащих супрамолекулярных комплексов, изучении на этих
моделях закономерностей их сборки и структурно-функциональных свойств и применении найденных подходов для решения важных прикладных медико-биологических и нанобиотехнологических задач, таких как:
конструирование новых белков-векторов, самоассоциирующихся с олигонуклеотидами и их аналогами, а также с плазмидной ДНК для избирательной доставки чужеродного генетического материала в целевые клетки;
создание нового способа быстрой, эффективной и безопасной для жизнеспособности клеток фиксации ДНК на внешней мембране клетки для расширения возможностей адгезивных манипуляций с живыми клетками;
получение функциональных ассоциатов олигонуклеотидов, белков и нуклеопротеиновых комплексов на основе наночастиц никеля;
— разработка и оптимизация методов получения ДНК и белковых
компонентов комплексов, а также способов формирования и анализа структурной
организации супрамолекулярных ассоциатов полинуклеотидов.
Научная новизна и практическая значимость. Получены ковалентные белок-белковые и ДНК-белковые конъюгаты с применением природных [эпидермального фактора роста человека (ЭФРч) и альфа-фетопротеина] и новых рекомбинантных белков. Показано, что синтезированные соединения и комплексы способны избирательно интернализоваться целевыми клетками по рецептор-опосредованному механизму и обеспечивать доставку нуклеиновой компоненты к внутриклеточным мишеням. В качестве основы для конструирования переносчика биотинилированных молекул получен слитый функциональный белок - стрептавидин-дифтерийный токсин. На основании полученного экспериментального материала сформулирован новый подход к созданию транспортных белков для доставки чужеродной ДНК в клетки-мишени, в соответствии с которым получен ряд новых полипептидов, в том числе белок PGEk, состоящий из адресующего ЭФРч домена и олигокатионной ДНК-связывающей последовательности. На примере взаимодействия плазмидной ДНК и различных олигонуклеотидов с PGEk изучены процессы формирования и свойства образующихся комплексов. Исследовано влияние конформации ДНК на строение и свойства ассоциатов с PGEk и влияние комплексообразования на структуру самой ДНК. Определены стерические и термодинамические параметры связывания белка с олигонуклеотидами. Показана выраженная корреляция между структурой комплексов и их биологическими свойствами. Обнаружено, что PGEk не только способствует более интенсивной интернализации ДНК клетками-мишенями, но и защищает ее от
деградации нуклеазами. Показано, что PGEk в результате существенно увеличивает
противоопухолевый эффект известных антисмысловых олигонуклеотидов, создавая реальную перспективу разработки широкого спектра адресованных генотерапевтических средств. Найденные подходы и закономерности носят системный характер и необходимы для конструирования новых переносчиков ДНК, избирательных в отношении различных типов клеток.
Предложен новый способ иммобилизации фрагментов ДНК на внешней поверхности клеток для генерации искусственного сродства клеток к комплементарным олигонуклеотидным последовательностям. Показано, что жирнокислотные производные олигонуклеотидов при внесении в культуральную среду нековалентно и эффективно удерживаются на внешней мембране клеток, не изменяя их жизнеспособности. Иммобилизованные олигонуклеотиды сохраняют природную способность к гибридизационным взаимодействиям. Найденный метод ДНК-маркирования клеток перспективен для создания биосенсоров, разработки новых подходов в инженерии тканей, получения искусственных межклеточных ассоциатов.
В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля для формирования многофункциональных биополимерных структур, а также их преимущества в сравнении с другими наноразмерными основами. Показана способность агрегатов наночастиц никеля ассоциироваться с фрагментами однонитевых ДНК с образованием стабильных комплексов. На примере рекомбинантных гистидинилированных белков исследовано образование протеин-никелевых ассоциатов. Впервые показано, что в составе комплексов молекулы биополимеров не деградированы и могут частично или полностью сохранять функциональные свойства, что создает основу для их использования, например, в системах селекции аффинных к белкам аптамеров. Полученные результаты вносят вклад в создание новых биополимер-никелевых наноструктур - исследовательских и диагностических инструментов в области молекулярной наноэлектроники, биологии и медицины.
Оптимизированные методы и технологические приемы получения олигонуклеотидов, их структурных аналогов и производных, а также способы очистки и анализа фрагментов ДНК широко используются в лабораторной практике. С их применением получены новые штаммы-продуценты белков (атриального натрийуретического фактора, кальцитонина, гормона роста, эпидермального фактора роста, цитохромов и др.), трансгенные вирусы (на основе Х-вируса картофеля) и растения (арабидопсис, табак и картофель), разработаны диагностикумы различных
инфекционных заболеваний. С помощью синтезированных олигонуклеотидов проведена одна из первых отечественных работ по геномному секвенированию (геном Х-вируса картофеля), а также конформационные исследования ДНК - параллельных дуплексов, триплексов, квадруплексов. В настоящей работе предложен новый методический прием, позволяющий осуществлять одновременный автоматический синтез олигонуклеотидов, содержащих различное число тиофосфорильных межнуклеотидных связей. Этот метод важен для поиска новых олигонуклеотидных лекарственных средств и развития ДНК-диагностики. Описана малоизученная реакция превращения полигалогензамещенных флоуронов в соответствующие акридины действием водного аммиака, являющаяся побочной при получении флуоресцентно меченых олигонуклеотидов. Использование зондов, синтезированных и выделенных с учетом этого процесса, позволило увеличить чувствительность ряда диагностикумов на 15-20%.
Разработанные методы и технологические приемы внедрены в производство диагностических наборов для определения широкого ряда патогенов, используются в производстве ДНК-синтезаторов серии ASM-800 и конструировании нового 96-канального синтезатора ASM-1000 (ООО "Биоссет", Россия, Новосибирск).
Вклад автора. Работа носит выраженный междисциплинарный характер. Основной вклад автора состоит в теоретическом обосновании гипотез, постановке задач, детальном планировании проведения экспериментов и анализе их результатов. Кроме того, непосредственно автором выполнено подавляющее число синтетических, хроматографических и аналитических работ.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации автором опубликовано более 60 печатных работ, в том числе 2 патента, главы в научных сборниках, статьи, 31 из них в рецензируемых отечественных и международных журналах из списка ВАК.
Материалы, включенные в диссертацию, докладывались более чем на 40 всероссийских и международных симпозиумах и конференциях, в том числе на Int. Conf. "Fundamental & Applied Problems in Phytovirology", 14 Conversation: Biomolecular Stereodynamics. Albany. US, Int. Conf. "RNA as Therapeutic and Genomics Target" IV Russian-French Symp. "Supramolecular Systems in Chemistry and Biology", 11 Conversation: Biomolecular Stereodynamics, Int. Conf. "Molecular Biology on the verge of the XXI Century: genome structure. Functional Analysis", 56th ASMS Conference on Mass Spectrometry и др.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, материалы и методы исследования, выводы, список литературы и приложения, содержащего 4 акта о внедрении части результатов работы в производство. Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста, включает 8 аблиц и 63 рисунка. Список литературы содержит 286 ссылок.
