Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Цели и задачи исследования 48
Материалы и методы исследования 50
Результаты 56
Обсуждение результатов 92
Выводы 109
Благодарности 111
Библиография 112
Введение к работе
В настоящее время считается установленным, что возбуждающие аминокислоты глутамат и аспартат играют важную роль в гибели нейронов при острых поражениях головного мозга, таких как инсульт, ишемия/гипоксия, а также различных нейродегенеративных процессах (Rothman and Olney, 1986; Lipton, 1999). Избыточное выделение и накопление глутамата во внеклеточном пространстве приводит к гиперстимуляции глутаматных рецепторов, открыванию N-метил-О-аспартат-управляемых каналов (NMDA-каналов) и мощному потоку ионов Са2+ внутрь клетки. Основной моделью для изучения глутаматнои неиротоксичности являются первичные культуры нервных клеток из различных областей мозга крыс или мышей. Показано, что глутаматная нейротоксичность опосредуется кальциевой перегрузкой нейронов (Hartley et al., 1993). Более детальное изучение изменений концентрации внутриклеточного Са ([Са ]І) при глутаматном воздействии привело к открытию явления, названного отсроченной кальциевой дизрегуляцией (ОКД). Оказалось, что первичный сравнительно небольшой подъем [Ca2+]j, вызванный глутаматом в нейронах, через некоторое время сменяется сильным необратимым увеличением [Ca2+]j - ОКД (Tymianski et al., 1993; Vergun et al., 1999; Nicholls and Budd, 2000). Дальнейшие исследования показали, что культивируемые нейроны различного возраста по-разному отвечают на одно и тоже глутаматное воздействие. Так, молодые нейроны (6-Ю дней в культуре) в ответ на 10-15 мин глутаматный удар отвечают небольшим обратимым подъемом [Са ]І, который сопровождается слабой митохондриальной деполяризацией (МД). В зрелых нейронах, содержащихся в культуре более 11 дней, в ответ на такое же воздействие глутамата развивается ОКД (Adamec et al., 1998) и сильная МД (Vergun et al, 1999). Причины возрастного различия в поведении нейронов при глутаматном воздействии и механизмы ОКД до сих пор остаются невыясненными. Данная работа направлена на изучение зависимости устойчивости нейронов к гиперстимуляции глутаматных рецепторов от состояния их энергетического метаболизма. Исследование показало, что гликолиз играет ведущую роль в противодействии нейронов мозга нарушению кальциевого гомеостаза и дисфункции митохондрий, вызываемых глутаматом. Научная новизна. В опытах на молодых культивируемых нейронах мозжечка впервые изучен механизм возникновения медленной деполяризации митохондрий, вызываемой длительной глюкозной депривацией (замены глюкозы на ее неметаболизируемый аналог 2-деокси-0-глюкозу). Показано, что эта митохондриальная деполяризация (МД) устойчива к удалению наружного Са или антагонистов глутаматных рецепторов, но быстро подавляется блокатором АТФ-синтазы олигомицином и предотвращается пируватом.
Впервые показано, что глюкозная депривация значительно ускоряет развитие ОКД и сопровождающей ее сильной МД в молодых нейронах, подвергнутых глутаматному воздействию.
Впервые установлено, что ускорение развития ОКД в условиях глюкозной депривации нельзя объяснить ускорением открывания митохондриальной поры, поскольку блокада митохондриальной поры путем замены Са2+ на Sr2+ не изменяет латентного периода между первой и второй фазами подъема внутриклеточной концентрации Sr2+ (по сравнению с Са2+-содержащей средой).
Впервые показано, что обработка культуры антиоксидантом МпТВАР или блокатором NO-синтазы L-NAME не оказывают заметного влияния на развитие ОКД и сильной митохондриальной деполяризации во время глутаматиого воздействия в молодых нейронах, лишенных глюкозы. Сделано заключение, что ускорение развития ОКД и сильной митохондриальной деполяризации нельзя объяснить усилением синтеза реактивных форм кислорода и моноокиси азота при глюкознои депривации во время глутаматного воздействия в отсутствии глюкозы.
Впервые установлено, что добавление пирувата в безглюкозную среду предотвращает
развитие ОКД и сильной митохондриальной деполяризации, вызванных глутаматом. Исходя из полученных данных сделано заключение, что основной причиной ускорения развития
ОКД при глюкознои депривации является прекращение гликолитической продукциипирувата, ведущее к коллапсу митохондриального потенциала и торможению синтеза АТФ.
Положения, выносимые на защиту.
1. Митохондриальная деполяризация, развивающаяся в условиях блокады гликолиза обусловлена АДФ-зависимым усилением потока протонов через митохондриальную АТФ-синтазу на фоне ослабления дыхания.
2. Ускорение развития отсроченной кальциевой дизрегуляции и сильной митохондриальной деполяризации во время глутаматного воздействия в безглюкозной среде не могут быть объяснены гиперпродукцией реактивных форм кислорода и N0, а также ускорением открывания митохондриальной поры вследствие быстрого падения АТФ.
3. В условиях глюкознои депривации реверсия Na+/Ca2+-o6Mena во время глутаматного воздействия вносит существенный вклад в нарушение кальциевого гомеостаза.
4. Добавление пирувата в безглюкозную среду устраняет ускорение развития отсроченной кальциевой дизрегуляции и сильной митохондриальной деполяризации во время глутаматного воздействия вследствие того, что пируват способен поддерживать генерацию митохондриального потенциала, необходимого как для электрофоретического захвата Са2+ митохондриями, так и для синтеза АТФ.
Цели и задачи исследования
Воздействие Глу на клеточные культуры приводит к снижению внутриклеточного содержания АТФ (Budd and Nicholls, 1996; Ходоров и др., 2001). Основными причинами этого падения могут являться как АТФ-потребляющие механизмы, выводящие Са (например, Са2+/Н+-АТФаза плазматической мембраны) или Na+ (№+/К+-АТФаза) из клетки, так и митохондриальная АТФаза, которая при угнетении дыхания начинает разлагать АТФ, чтобы поддерживать ДЧ щ (обзор Budd and Nicholls, 2000). Падение АТФ может привести к снижению активности механизмов, выводящих Са2+ из клетки. Более того, как уже указывалось выше, АТФ необходимо на некоторых стадиях гликолиза. Поэтому можно предположить, что именно нарушение энергетического метаболизма является основной причиной ОКД и гибели нейронов при Глу воздействии. Это предположение частично было подтверждено в ряде работ, в которых добавление к клеткам дополнительного энергетического субстрата пирувата уменьшало долю клеток, погибших от Глу воздействия.
Так, защитный эффект пирувата от Глу нейротоксичности был продемонстрирован в работе Eimerl and Schramm (1995). Авторы показали, что присутствие пирувата или пирувата с неорганическим фосфатом в среде, содержащей глюкозу, существенно уменьшает процент нейронов мозжечка, погибших после Глу воздействия. Аналогичная защита пирувата и малата от гибели гиппокампальных и кортикальных нейронов после воздействия NMDA в среде, содержащей глюкозу, была продемонстрирована в работе Ruiz et al. (1998). Однако Lee et al. (2001), исследуя клеточную выживаемость после воздействия NMDA или Глу в присутствии глюкозы, не обнаружили защитного эффекта пирувата.
Защитный эффект пирувата против токсического действия NMDA в отсутствии глюкозы, был ранее описан в работе Maus et al. (1999). Авторы продемонстрировали, что добавление пирувата в безглюкозную среду почти в 3 раза уменьшает гибель клеток после воздействия NMDA, и значительно уменьшает падение АТФ во время удара NMDA. Исходя из этих данных было сделано предположение, что эффект пирувата связан с поддержанием уровня АТФ в клетках. Однако в ряде работ было показано, что нет прямой взаимосвязи между падением АТФ в клетке и гибелью нейронов или между падением АТФ и нарушением кальциевого гомеостаза. Так, в работе Mattson et al. (1993) было показано, что лишение гиппокампальных нейронов глюкозы вызывает нарушение кальциевого гомеостаза, потерю АТщ и снижение уровня АТФ. Факторы роста предотвращали нарушение кальциевого гомеостаза и потерю АТщ, однако не предотвращали падения уровня АТФ в клетках. В другой работе, проведенной на клетках мозжечка, было показано, что ряд веществ, которые предотвращают клеточную гибель, вызванную Глу, не оказывают влияния на падение АТФ при Глу воздействии (Marcaida et al., 1995). Budd and Nicholls (1996) обнаружили, что соотношение АТФ/АДФ после воздействия на нейроны Глу в присутствии блокатора АТФ-синтазы олигомицина было меньше, чем соотношение АТФ/АДФ после воздействия на нейроны одного Глу. В тоже время блокада митохондриального синтеза АТФ не оказала никакого влияния на развитие ОКД. Учитывая полученные данные, авторами было высказано предположение, что нарушение митохондриального синтеза АТФ не является причиной нарушения кальциевого гомеостаза в зернистых нейронах, подвергнутых Глу воздействию. Принимая во внимания противоречивые результаты, описанные в различных работах, можно сказать, что вопрос о роли АТФ в нарушениях кальциевого гомеостаза до сих пор остается открытым. Итак, на протяжении последнего десятилетия множество работ было направлено на изучение механизмов дестабилизации кальциевого гомеостаза при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Оказалось, что устойчивость нейронов к токсическому действию глутамата сильно зависит от возраста культур и значительно снижается по мере взросления нейронов (Adamec et al., 1998; Vergun et al., 1999). Дальнейшие исследования показали, что развитие ОКД, происходящее в нейронах при действии глутамата, сопровождается сильной МД, которая играет ведущую роль в нарушении кальциевого гомеостаза (Vergun et al., 1999; Ходоров и др., 2001). Целый ряд работ был направлен на выяснение механизмов, лежащих в основе ОКД. В этих работах изучалась роль митохондриальной поры, свободных радикалов, вклад Ка+/Са2+-обменника в нарушение кальциевого гомеостаза, вызванного Глу (Khodorov et al., 1993; Vergun et al., 1999; Vergun et al., 2001; Alano et al., 2002; Castilho et al, 1998; Castilho et al, 1999). Однако факторы, определяющие устойчивость нейронов к глутаматному воздействию, остались не выясненными.
Материалы и методы исследования
У 6-8 дневных крысят линии Wistar извлекали мозжечки в соответствии с этическими требованиями по работе с животными, промывали в бескальциевом и безмагниевом растворе Хенкса ("Gibco", США), измельчали и помещали на 15 мин в 0.05% раствор трипсина с 0.02% ЭДТА (36С). После инкубации трипсин двукратно отмывали стандартным раствором Хенкса ("Gibco", США) с феноловым красным, а затем культуральной средой MEM (Minimal Essential Medium, "Gibco", США) на растворе Игла, содержащей 10% феталыюй сыворотки крупного рогатого скота. Затем клетки диспергировали в свежей среде mvlO (состав см. ниже) до получения однородной суспензии, которую затем центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Осаждённые клетки ресуспендировали в соответствующем объёме свежей mvlO (примерная концентрация 10 клеток/мл) и переносили (100-150 мкл) на находящиеся в чашках Петри ("Costar") покровные стерильные стекла, покрытые поли-О-лизином (10 мкг/мл). Через 2 часа после нанесения клеток на стекла в чашки Петри добавляли по 1 мл культуральной среды mvlO, содержащей 25 мМ КС1. Клетки содержались в течение 7-Ю дней в инкубаторе (95% воздуха + 5% СОг, относительная влажность 98%) в среде mvlO с добавлением 25 мМ КС1. На 3-4 сутки культивирования в среду инкубации добавляли арабинозинмоноцитозид (0.5x10"5 М) для предупреждения пролиферации не нейрональных клеток. Получали смешанную нейроглиальную культуру с подавляющим большинством зернистых клеток. Нейроны были легко отличимы от клеток глии: они были контрастно очерчены, с большим ядром, имели гладкую округлую форму и лежали в фокальной плоскости над глией. Эксперименты проводились на нейронах, пребывавших в культуре 6-Ю дней.
Состав культуральной среды для клеток мозжечка, mvlO, (на 100 мл готового раствора): У 1-2 дневных крысят линии Wistar извлекали кору головного мозга в соответствии с этическими требованиями по работе с животными, промывали в растворе Кребса, содержавшем (мМ): 130 NaCl, 5.4 КС1, 20 HEPES, 0.4 КН2Р04, 15 Glucose, 0.5 MgS04 и 3mg/ml бычий сывороточный альбумин (BSA, Sigma), рН 7.4. Затем кору измельчали и помещали на 15 мин (36С) в раствор Кребса, содержащий трипсин 1-300 (0.8 мг/мл, ICN). После инкубации трипсин двукратно отмывали стандартным раствором Кребса, содержащим 0.08 мг/мл ингибитора трипсина ("Sigma", США) и 0.01 мг/мл ДНКазы ("Roche"). Клетки диспергировали в среде Кребса с ингибитором трипсина (0.5 мг/мл) и ДНКазой (0.08 мг/мл) до получения однородной суспензии, которую затем центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Осаждённые клетки ресуспендировали в соответствующем объёме Neurobasal Medium с добавлением B-27(Gibco), GlutaMax (Gibco) и penicilline/streptomycine (Gibco) и переносили (100-150 мкл) на находящиеся в чашках Петри ("Costar") покровные стерильные стекла, покрытые поли-Б-лизином (10 мкг/мл). Через 2 часа после нанесения клеток на стекла в чашки Петри добавляли по 1 мл Neurobasal Medium с добавлением В-27, и GlutaMax. Клетки содержались в течение 5-7 дней в инкубаторе (95% воздуха + 5% СОг, относительная влажность 98%) в указанной среде, после чего проводилась процедура трансфекции.
Измерения внутриклеточной концентрации Са2+ (ГСа2+1,) проводили с помощью флуоресцентного Са индикатора Fura-2FF/AM (константа диссоциации 5 мкМ) или Fura-2/АМ (константа диссоциации 225 нМ). Спектр флуоресценции этих липофильных зондов смещается к более коротким волнам при увеличении связывания молекул зонда с Са2+. Индикатор вводили культуральную среду к клеткам в форме ацетоксиметилового эфира (TefLabs, Austin, ТХ). После 50 мин инкубации нейронов с 4-5 мкМ Fura-2/AM или 5-6 мкМ Fura-2FF/AM при 37С в инкубаторе краситель отмывали контрольным солевым раствором (HBSS) следующего состава (в мМ): NaCl - 135, КС1 - 5, CaCl - 1.8, MgCl - 1.0, HEPES - 20, глюкоза - 5, pH 7.4.
Измерение относительного уровня трансмембранной разности потенциалов на внутренней мембране митохондрий (А1?) проводили с помощью липофильного флуоресцентного катиона родамина 123 (Rhodamine 123, Rh-123), которым клетки окрашивали после того, как они уже были нагружены Са2+ индикатором. Rh-123 легко проникает через плазматическую мембрану и распределяется в клетке согласно потенциалу Нернста, поэтому накапливается преимущественно в митохондриях (имеющих в норме ДТщ = 170-180 мВ с минусом внутри), что ведет к аутогашению флуоресценции. При деполяризации мембраны Rh-123 выходит в цитозоль, и диффузное распределение зонда очень сильно увеличивает свечение. Клетки загружали в течение 15-20 мин 3-4 мкМ Rh-123 при 37 в инкубаторе и затем тщательно отмывали HBSS. Из регистрируемой от тел нейронов флуоресценции вычитали фоновую флуоресценцию (свечение, обусловленное, в основном, присутствием в культуре глиальных клеток). Полученные результаты нормировали по исходной флуоресценции, которую принимали за 100%. Измерения рН в цитозоле (рНц) проводили с помощью рН-чувствительного флуоресцентного белка (cytYFP). Измерения рН в матриксе митохондрий (рНм) проводили с помощью рН-чувствителыюго флуоресцентного белка (mtYFP), который в качестве адресной метки включал N-концевой фрагмент (первые 36 аминокислотных остатков) полипептидной цепи субъединицы VIII цитохром С оксидазы. Векторы были любезно предоставлены профессором Р. Риззуто (Rozario Rizzuto, University of Ferrara, Italy). В ряде экспериментов трансфецированные нейроны нагружались Са +-чувствительными зондами как описано выше. Из регистрируемой от тел нейронов флуоресценции вычитали фоновую флуоресценцию (свечение, обусловленное, в основном, присутствием в культуре глиальных клеток). Все внутриклеточные зонды разводили в 30% диметилсульфоксиде (DMSO) до необходимой концентрации и хранили в виде "stock solution"npH -40С.
Результаты
Для изучения вклада гликолиза и окислительного фосфорилирования в механизмы регуляции кальциевого гомеостаза и митохондриального потенциала (ДЧ щ) нейронов мы, прежде всего, сопоставили влияние блокады митохондриального синтеза АТФ и блокады гликолиза на ДЧ и внутриклеточную концентрацию Са2+ ([Ca2+]j). Для блокады Fi/F0-синтазы был использован олигомицин (2,5 мкг/мл), блокада гликолиза осуществлялась с помощью замены в наружном растворе глюкозы на ее неметаболизируемый аналог - 2-деокси-О-глюкозу (глюкозная депривация).
Добавление к нейронам мозжечка (7-Ю дней в культуре, ДВК) олигомицина вызвало гиперполяризацию клеток и никак не повлияло на базальный [Ca2+]j (Рис. 1). Эффект олигомицина на Д щ связан с прекращением потока протонов в митохондриальный матрикс через Fo-субъединицу митохондриальной АТФ-синтазы (Duchen and Biscoe, 1992).
В этой серии экспериментов мы изучили, как влияет на ДЧ и [Ca2+]j замена глюкозы на 2-деокси-0-глюкозу (ДГ). ДГ приводит к торможению гликолиза в клетках, поскольку она конкурирует с глюкозой за захват нейронами, а также за фосфорилирование ферментом гексокиназой. Образующийся в результате фосфорилирования 2-ДГ-6-фосфат далее не метаболизируется, подавляя, таким образом, гликолитический синтез как АТФ, так и пирувата, необходимого для поддержания Д щ (Chi et al., 1987). В данной работе инкубация молодых (6-Ю дней в культуре, ДВК) зернистых нейронов мозжечка в течение 20-60 мин в безглюкозном растворе, содержащем ДГ (ЮмМ), приводила к постепенной деполяризации митохондрий (24 эксперимента, Рис 2А, Г.). Как известно из литературных данных, в смешаных нейронально-глиальных культурах замена глюкозы на ДГ приводит к увеличению [Са ], в нервных клетках (Silver et al., 1997). В опытах на гиппокампальных срезах также было обнаружено, что лишение клеток блокаторами NMDA-каналов, из чего было сделано предположение о действии эндогенного глутамата (Глу) в данных экспериментальных условиях. Исходя из этих результатов, можно было бы предположить, что митохондриальная деполяризация (МД), развивающаяся в результате замены глюкозы на ДГ, является следствием действия эндогенного Глу. Однако в наших экспериментах мы не наблюдали увеличения [Са +]І ВО время инкубации клеток с ДГ независимо от того, проводились ли измерения [Са +]j с помощью высокоаффинного красителя Fura-2 или низкоаффинного Fura-2FF. Добавление в наружный раствор, содержащий ДГ, блокатора NMDA каналов мемантина (50мкМ; 5 экспериментов) или же уборка Са2+ из инкубационного раствора (4 эксперимента) не только не предотвратили, но даже не ослабили развития МД (Рис. ЗА, Б). Полученные данные говорят о том, что МД, развивающаяся в нейронах в отсутствии глюкозы, не может быть объяснена действием эндогенного Глу.
Известно, что ингибирование гликолиза, наряду с истощением внутриклеточного АТФ, приводит к прекращению синтеза одного из основных митохондриальных субстратов пирувата (Ленинджер, 1976). Следовательно, одной из причин развития МД в отсутствии глюкозы может являться нарушение работы дыхательной цепи митохондрий в результате прекращения синтеза пирувата. Наши дальнейшие эксперименты (3 эксперимента) показали, что добавление к клеткам пирувата (5мМ) или лактата (5мМ) (последний, попадая в нейроны, превращается в пируват) за 5 мин до замены глюкозы на ДГ предотвращает развитие МД (Рис. 2Б, В). Добавление лактата или пирувата в наружный раствор через 30 Известно, что прекращение гликолитического синтеза АТФ приводит к накоплению АДФ в клетке, что, в свою очередь, может способствовать усилению митохондриального синтеза АТФ. Митохондриальный синтез АТФ сопряжен с потоком протонов через F)/F0- АТФсинтазу внутрь митохондрий, следовательно, еще одной причиной МД, развивающейся в результате замены глюкозы на ДГ, может быть деполяризующий поток протонов через митохондриальную мембрану в результате усиления митохондриального синтеза АТФ. Действительно, мы обнаружили, что добавление в наружный раствор блокатора F0 субъединцы митохондриальной АТФ-синтазы олигомицина (2,5 мкг/мл) через 20 мин после удаления глюкозы из раствора приводит к восстановлению АЧ т во всех нейронах (8 экспериментов, Рис. 4А). Особенно впечатляющим является тот факт, что добавление олигомицина даже через 60 мин после замены глюкозы на ДГ также приводит к восстановлению потенциала митохондрий (3 эксперимента, Рис. 4Б). Последнее обстоятельство указывает на то, что, несмотря на блокаду гликолиза и, следовательно, прекращение синтеза пирувата, нейроны сохраняют способность продолжать синтез АТФ.
Обсуждение результатов
Замена во внешнем растворе глюкозы на ее неметаболизируемый аналог ДГ приводила к постепенно развивающейся МД, которая начиналась с первых минут этого воздействия (Рис. 2А, Г). В литературе имеются данные о выходе из клеток эндогенного Глу и, как следствие, повышении нейроналыгого [Са2+]і в ответ на удаление из внеклеточного раствора глюкозы или одновременное удаление глюкозы и кислорода (Silver et al., 1997: Zhang and Lipton, 1999; Tekkok et al., 1999). Однако в наших экспериментах блокада Глу-активируемых каналов мемантином или удаление Са2+ из безглюкозного раствора не предотвращали развитие МД (Рис. 3). Это привело нас к выводу о том, что наблюдаемая МД не связана с выделением эндогенного Глу. Поскольку глюкозная депривация приводит к торможению гликолиза (Chi et al., 1987), конечным продуктом которого является пируват, необходимый митохондриям для поддержания АЧ , мы предположили, что одной из причин снижения АЧ т в отсутствии глюкозы является торможение дыхания из-за недостатка пирувата. Действительно, добавление в безглюкозную среду пирувата или лактата (последний, попадая в нейроны, превращается в пируват ферментом лактатдегидрогеназой) предотвращало развитие МД (Рис.2Б, В). Это предположение подтвердили также наши данные, полученные при измерении НАД(Ф)Н в нейронах, а именно, тот факт, что замена глюкозы на ДГ приводила к падению НАД(Ф)Н в клетках, т.е. к уменьшению количества субстрата для первого комплекса дыхательной цепи митохондрий. Добавление в безглюкозный раствор лактата, так же как и замена ДГ на глюкозу, способствовало восстановлению уровня НАД(Ф)Н (Рис. 6). Эти данные свидетельствуют о том, что торможение дыхания из-за дефицита пирувата вносит вклад в развитие МД. Глюкозная депривация помимо прекращения синтеза пирувата вызывает еще и прекращение гликолитического синтеза АТФ.
Нехватка АТФ может привести к накоплению АДФ в клетке и вызвать компенсаторное усиление митохондриального синтеза АТФ, который сопряжен с потоком протонов через Fo-канал АТФ-синтазы внутрь митохондрий. Эксперименты, проведенные с блокатором Fo субъединицы АТФ-синтазы олигомицином, показали, что применение олигомицина через 20-60 мин после удаления глюкозы приводит к восстановлению АЧ щ (Рис.4). Хорошо известно, что изменения ДЧ щ, вызываемые олигомицином, зависят от того, в каком режиме работает митохондриальная АТФ-синтаза. Так, в покоящихся клетках олигомицин вызывает гиперполяризацию, блокируя поток протонов, направленный через АТФ-синтазу внутрь митохондрий (Рис. 1, см также Duchen and Biscoe, 1992). МД, вызываемая классическими ингибиторами дыхательной цепи (такими как цианид или антимицин), превращает АТФ-синтазу в АТФазу, вызывая реверсию потока протонов через Fo субъединицу. В этих условиях применение олигомицина приводит к МД (Nicholls and Budd, 2000). Наши эксперименты с олигомицином ясно показали, что, несмотря на МД и отсутствие глюкозы, в нейронах продолжался митохондриальный синтез АТФ. Следовательно, деполяризующий поток протонов через АТФ-синтазу вносит вклад в развитие МД в отсутствии глюкозы. Величина ДЧ ,, до определенной степени, может регулироваться активностью митохондриалыюго АТФ/АДФ-обменника - транслокатора адениновых нуклеотидов (ТАН), поскольку он не является электронейтральным (АТФ более отрицательно заряжен, чем АДФ) (Klingenberg and Rottenberg, 1977). Инкубация клеток с ДГ приводит к уменьшению отношения АТФ/АДФ в цитозоле. Это вызывает увеличение потока АДФ в матрикс митохондрий и одновременное увеличение потока АТФ из митохондрий. В результате увеличивается количество положительных зарядов в матриксе, и, следовательно, может снижаться A4V Чтобы подтвердить или опровергнуть это предположение, необходимы дополнительные эксперименты. Таким образом, МД, развивающаяся после замены глюкозы на ДГ, вызвана, по крайней мере, двумя причинами. Во-первых, ослаблением работы дыхательной цепи митохондрий из-за недостатка субстрата. Во-вторых, усилением деполяризующего потока протонов через Fo-субъединицу АТФ-синтазы вследствие компенсаторного усиления синтеза АТФ в митохондриях (см. также рис. 5). Что же позволяет нейронам поддерживать AvFm, необходимый для синтеза АТФ, в отсутствии глюкозы? Откуда клетка получает субстраты для дыхательной цепи во время глюкозной депривации? Одним из наиболее вероятных источников пирувата в нейронах мог бы служить лактат, производимый глиальными клетками, и затем поступающий в нейроны и там превращающийся в пируват (Ames, 2000, Pellerin and Magistretti, 2004). Однако замена глюкозы на ДГ приводит к блокаде не только нейронального гликолиза, но также и гликолиза в глиальных клетках.
Известно, что глиальные клетки, в отличие от нейронов, обладают способностью создавать запасать гликогена, который может быть использован для поддержания гликолиза в отсутствии глюкозы. Но дезоксиглюкоза-6-фосфат, образующийся на первой стадии гликолиза в глиальных клетках, блокирует гликоген фосфорилазную активность в астроглии (Dringen and Hamprecht, 1993), таким образом, исключая возможность использования глиального гликогена для производства лактата. Наряду с лактатом, нейроны могут использовать также жирные кислоты или аминокислоты, которые вступают в цикл Кребса, превращаясь в Ацетил-КоА, и, таким образом, поддерживают АТщ. Известно также, что в глиальных клетках глутамат превращается в глутамин, который впоследствии транспортируется в нейроны аминокислотным транспотером. Нейроны, в свою очередь, используют глутамин для ресинтеза глутамата. Этот процесс называется глутамат/глутаминовый цикл (см обзоры Ames, 2000; Deitmer, 2000). Помимо глутамата, поступающего из глиальных клеток, в нейронах содержатся большие запасы собственного глутамата - около 100 мМ в синаптических везикулах и 10 мМ в цитозоле (Danbolt, 2001). Следовательно, использование эндогенного или синтезированного из глутамина глутамата можно рассматривать, как один из возможных способов поддержания А щ во время глюкозной депривации. Однако выяснение точного механизма, ответственного за поддержание ДЧ в отсутствии глюкозы остается задачей для будущих исследований.
