Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Водорастворимые производные Бакминстерфуллерена 10
1.1. Гидрофилизация и биосовместимость фуллеренов 10
1.2. Гидроксифуллерен 19
1.3. Гексасульфобутилфуллерен (ГСБФ) 20
1.4. Карбоксифуллерены 21
1.5. Фуллеропирролидины 24
1.6. Аминокислотные и пептидные производные фуллерена Сбо 28
1.7. Противовирусная активность фуллерена Сбо- 35
Глава 2. Материалы и методы 41
Глава 3. Мембранотропные свойства АПФ и стсреоспецифичность их проницаемости через липидного бислой 52
3.1. Проницаемость липидного бислоя для АПФ 52
3.2. Стереоспецифичность действия энантиомеров аминокислотных производных фуллерена Сбо на липидный бислой фосфатидилхолиновых липосом 66
Глава 4. Модуляция активности мембраносвязанных ферментов и фотозависимость действия АПФ 71
4.1. Влияние АПФ на каталитическую активность моноаминооксидазы А и моноаминооксидазы В 71
4.2. Стереоспецифичность действия энантиомеров АПФ на функционирование МАО-А и МАО-В 75
4.3. Фотозависимость влияния АПФ на каталитическую активность МАО-А и МАО-В 77
Глава 5. Антиоксидантная активность и противовирусное действие АПФ 82
5.1. Влияние АПФ на пероксидное окисление липидов в биологических мембранах 82
5.2. Влияние АПФ на ПОЛ при цитомегаловирусной инфекции 86
Заключение 92
Выводы 94
Публикации по теме диссертационной работы 95
Список литературы 98
- Аминокислотные и пептидные производные фуллерена Сбо
- Стереоспецифичность действия энантиомеров аминокислотных производных фуллерена Сбо на липидный бислой фосфатидилхолиновых липосом
- Стереоспецифичность действия энантиомеров АПФ на функционирование МАО-А и МАО-В
- Влияние АПФ на ПОЛ при цитомегаловирусной инфекции
Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование физико-химических механизмов биологического
действия водорастворимых производных является актуальной
фундаментальной и научно-прикладной проблемой для нового интенсивно развивающегося научного направления - нанобионики фармакологически активных соединений.
Благодаря своей уникальной геометрической форме и электронной структуре фуллерены и их производные рассматриваются в качестве основы для получения новых эффективных лекарственных средств. Сами по себе фуллерены чрезвычайно гидрофобны и мало применимы для введения в организм. Однако развитые в последние годы методы химической модификации фуллеренов с помощью водорастворимых и липофильных аддуктов позволили выявить широчайший спектр их биологического действия. Показано, что фуллереновые соединения обладают рядом уникальных особенностей - способностью проникать через липидные мембраны, преодолевать гематоэнцефалический барьер и модулировать транспорт ионов. Некоторые из них проявляют заметную биологическую активность. Известно, что производные Сбо катализируют процесс перевода кислорода в синглетное состояние и в то же время обладают антирадикальными свойствами, проявляют антивирусную активность, в частности, ингибируют протеазу ВИЧ, встраиваясь в активный центр фермента и подавляя при этом работу вирусной протеазы. При облучении в присутствии кислорода соединения фуллерена способны разрывать цепь ДНК, оказывая цитотоксический эффект на опухолевые клетки. Очень перспективными, особенно в радиомедицине, считаются производные эндометаллофуллеренов, содержащие атом металла внутри молекулы. В предлагаемой работе впервые исследовались
водорастворимые аминокислотные производные фуллерена Сбо - новый
класс водораствормых производных фуллерена, уникальность которых заключается в их амфифильных свойствах, а также в их фармакологическом действии.
В связи с таким многообразием фармакологических свойств фуллеренов и их производных особенно актуальным является вопрос о физико-химических механизмах их биологического действия. При этом важная роль отводится мембранотропным свойствам этих соединений, т.е. их способности проникать через биологические мембраны или встраиваться в них, а также возможности включаться в глобулы мембраносвязанных белков-переносчиков и транспортироваться с их помощью к клеткам-мишеням, действуя таким образом на метаболические, в том числе и патогенетические процессы.
Таким образом, исследование мембранотропных свойств аминокислотных производных фуллерена Сбо является актуальной фундаментальной и научно-прикладной проблемой современной биофизики.
Цель и задачи работы состояли в установлении молекулярных физико-химических механизмов действия АПФ на фосфолипидные мембраны, мембраносвязанные ферменты и пероксидное окисление липидов в этих мембранах.
Исследования были сосредоточены на решении следующих задач:
1) изучить фотофизические свойства аминокислотных производных
фуллерена Сбо',
2) исследовать стереоспецифичность мембранотропных свойств
энантиомеров АПФ:
- установить способность энантиомеров АПФ проникать через
липидный бислой липосом и биологических мембран;
- оценить изменения каталитической активности мембраносвязанных
ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов головного
мозга крыс - моноаминооксидаз А и В (МАО-А и МАО-В) при действии энантиомеров АПФ;
исследовать фотодинамику влияния АПФ на каталитическую активность МАО-А и МАО-В;
изучить антиоксидантные свойства АПФ, а также их способность влиять на развитие цитомегаловирусной инфекции.
Научная новизна работы
Впервые изучены и количественно охарактеризованы мембранотропные свойства водорастворимых аминокислотных производных фуллерена Сбо
Показано, что АПФ являются тушителями фосфоресценции триплетного зонда эритрозина в водных растворах, в составе фосфатидилхолиновых липосом и в составе эритроцитарных мембран. Оценены значения констант скорости тушения зонда этими производными в водных растворах, в составе модельных и биологических мембран.
Впервые установлена стереоспецифичность мембранотропных свойств АПФ:
-L-энантиомеры проникают через липидный бислой во внутренний объем фосфатидилхолиновых липосом, D-энантиомеры - нет;
-L-энантиомеры вызывают активацию митохондриальных моноаминооксидаз А и В и подавляют процесс пероксидного окисления липидов в митохондриях, D-энантиомеры этими свойствами не обладают.
Исследования фотозависимости действия АПФ на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов митохондрий головного мозга крыс - МАО-А и МАО-В являются пионерскими.
Обнаружено, что ряд аминокислотных производных фуллерена Сбо являются ингибиторами цитомегаловирусной инфекции. Среди них выявлен эффективный ингибитор, превосходящий по своему противовирусному действию клинический препарат ганцикловир. Впервые
установлено, что процесс развития цитомегаловирусной инфекции сопровождается интенсификацией пероксидного окисления липидов. Научно-практическая значимость работы
Впервые установлена взаимосвязь биологического действия
водорастворимых аминокислотных производных фуллеренов с их
мембранотропными свойствами. Выявлена стереоспецифичность
мембранотропных свойств АПФ, в частности, их способности проникать через фосфолипидные мембраны, усиливать каталитическую активность митохондриальных ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов головного мозга крыс, ингибировать процессы пероксидного окисления липидов субклеточного гомогената головного мозга и печени крыс. Впервые установлена взаимосвязь процесса пероксидного окисления липидов с процессом развития цитомегаловирусной инфекции. Выявлены эффективные ингибиторы цитомегаловирусной инфекции на основе АПФ, в частности N-моногидрофуллеренил-у-аминомасляная кислота, рекомендованная для клинических испытаний.
Полученные результаты могут быть полезны при разработке способов адресной доставки лекарственных средств, где в качестве транспортирующих агентов могут быть использованы производные фуллерена, благодаря их мембранотропным свойствам, а также для фармакологии в свете создания нового класса высокоэффективных лекарственных препаратов противовирусного и нейропротекторного действия на основе водорастворимых аминокислотных производных фуллеренов.
Апробация работы
Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Российских и Международных конференциях:
"Биохимическая физика", Москва, 2002;
"Структура и динамика молекулярных систем", Яльчик, 2002;
5-th ISTC Scientific Advisory Committee Seminar "Nanotechnologies in the Area of Physics, Chemistry and Biotechnology", St. Petersburg, 2002;
"Modern Trends In Organometallic and Catalytic Chemistry", Moscow, 2003;
XI Международная конференция по химии органических и элементоорганических пероксидов", Москва, 2003;
6th Biennial International Workshop "Fullerene and Atomic Clusters", St-Petersburg, 2003;
III Съезд биофизиков России, Воронеж, 2004; International Conference «Reactive Oxygen Species, Nitric Oxide, Antioxidants, and Human Health» Smolensk, Russia, 2005;
7th Biennial International Workshop in Russia "Fullerens and atomic clusters", St.Peterburg, Russia, 2005;
9-ая Международная Пущинская школа конференция молодых ученых, Пущино, 2005;
International Conference "Biocatalysis-2005: Fundamentals and Aplications", StPetersburg, 2005.
Аминокислотные и пептидные производные фуллерена Сбо
СБО составляют ряд продуктов 1,2-присоединения аминокислот и пептидов к углеродному каркасу, подобно тому, как протекает реакция азотистых нуклеофилов с электронодефицитной молекулой Сбо- Существенной особенностью полученных производных является эквимолярное соотношение фуллерена и аминокислоты.
Впервые такая реакция была проведена на примере природных а-аминокислот, в результате чего были синтезированы продукты эквимолярного присоединения к фуллерену Сбо глицина (I), аланина (II), аргинина (III), серина (IV) и аланил-аланина (V) (табл. 1.3) [66], пролина . Поскольку эта реакция протекает без затрагивания хирального углеродного атома, то таким же путем были синтезированы соответствующие L- или D- изомеры аминокислотных производных.
Особенностью полученных АПФ является их растворимость в воде, зависящая от природы аминокислотного или пептидного фрагмента [67]. В водных растворах АПФ находятся преимущественно в виде ассоциатов, состав и форма которых зависит главным образом от концентрации растворов (табл. 1.4).
Изучена зависимость степени ассоциации водорастворимых аминокислотных и пептидных производных фуллерена Сбо от концентрации, рН и ионной силы раствора [68]. Было показано, что степень ассоциации АПФ увеличивается как в кислой, так и в щелочной среде по сравнению с исходным водным раствором. Например, для N-(моногидрофуллеренил)-ОЬ-серина при значениях рН 3.75 и 11.04 число молекул в ассоциатах составляет 166.5 и 120.0, соответственно. На примере аргининового и аланил-аланинового производных Сбо показано, что увеличение ионной силы раствора также приводит к увеличению степени ассоциации.
Наибольшая степень ассоциации (п) молекул АПФ наблюдается в кислой среде, но в интервале 4 рН 5 она резко снижается, а далее при 5 рН 11 остается практически постоянной {п - 30). Особенно точно эта зависимость выполняется при высокой ионной силе растворов, когда снижена степень диссоциации карбоксильных групп и растворимость АПФ (рис. 1.5). Соответственно при подщелачивании среды и образовании солей АПФ увеличивается их растворимость и снижается степень ассоциации молекул АПФ. В сильно щелочной среде степень ассоциации зависит только от ионной силы раствора. Структура мицелл Ы-(моногидрофуллеренил)-Ь-аланина и их ассоциатов изучена методом туннельной сканирующей микроскопии [69]. Было показано, что мицеллы в растворе с концентрацией 1.6 г/л представляют собой анизодиаметрические частицы размерами 0,5-10 мкм, содержащие малое количество воды.
Методом инфракрасной спектроскопии установлено, что все водорастворимые аминокислотные и пептидные производные фуллерена имеют цвиттерионное строение [70], приведенное для К-(моногид-рофуллеренил)-глицина: Такое строение имеют Сбо-производные глицина и всех дипептидов, тогда как дериваты аминокапроновой и аминобензойной кислот, а также пролина существуют виде карбоновых кислот.
Эти данные о природе водных растворов АПФ и зависимости степени их ассоциации от рН и ионной силы растворов следует учитывать как при проведении физико-химических исследований, так и при изучении фармакологической активности АПФ.
Применение фуллеренов в качестве носителей биологически активных группировок для получения новых эффективных лекарственных препаратов и вакцин является весьма перспективным направлением современной биотехнологии. В работах [71, 72] показано, что ряд аминокислотных производных фуллерена Сбо обладают выраженной иммуностимулирующей активностью, и по эффективности действия превосходят применяемые в клинике адьюванты (гидроокись алюминия). Среди фуллереновых аминокислот и пептидов следует выделить оптически активный фуллеропролин [73] и его производные [74]. Особый интерес представляет исследование влияние фуллеренового каркаса на ключевую роль производных пролина в определении направления сворачивания полипептидной цепи [75]. Не исключено, что именно с этим свойством фуллеропролинов связана их биологическая активность, опосредованная ингибированием ряда ферментов [76].
Показательна в этом отношении обнаруженная субстратная и стереоселективность ряда фуллеропролинов, полученных по реакции Прато с последующей ферментативной переэтерификацией. Установлено, что эти соединения ингибируют действие липаз по сложноэфирной группировке. При этом также отмечена стереоселективность этого эффекта, обусловленная Са-хиральным центром пролинового цикла [76]. Эти производные фуллеропролина ингибируют также цистеиновые (папаин, катепсин) и сериновые (трипсин, тромбин) протеазы [77, 78], что предположительно определяется гидрофобностью и электрофильностью фуллеренового сфероида.
Стереоспецифичность действия энантиомеров аминокислотных производных фуллерена Сбо на липидный бислой фосфатидилхолиновых липосом
Важнейшим результатом настоящей работы является выявленная стереоспецифичность мембранотропных свойств АПФ. Это свойство важно при исследовании биологически активных соединений с точки зрения создания лекарственных препаратов на основе рацематов АПФ. Поскольку реакция эквимолярного присоединения аминокислот и пептидов к фуллерену Сбо протекает без затрагивания хирального углеродного атома, то образующиеся АПФ сохраняют стереохимию исходной аминокислоты или пептида. Так были синтезированы рацематы и энантиомеры АПФ [66]. В водных растворах они существуют в виде цвиттерионов и их ассоциатов переменного состава, что зависит от строения аминокислотного фрагмента, ионной силы или рН растворов [108].
В процессе исследований было показано, что L и D энантиомеры аминокислотных производных фуллерена - C6o-L-Ala, C6o-D-Ala, Сбо-L-Arg, Сбо-D-Arg в водных растворах имеют одинаковые константы скорости тушения фосфоресценции эритрозина (таблица 3.2), в то время как в липосомах их константы различаются почти на порядок (рисунок 3.8).
В рамках задач диссертационной работы исследовалась влияние энантиомеров Сбо-L-Ala, Сбо-D-Ala, C6o-L-Arg, Сбо-D-Arg на липидный бислой фосфатидилхолиновых липосом. Было показано, что в присутствие L-изомеров интенсивность и время жизни фосфоресценции эритрозина, встроенного во внешнюю и внутреннюю поверхности липосом, уменьшались до нуля, в то время как D-изомеры снижали интенсивность фосфоресценции зонда на 50% (рис.3.9). Полученный результат свидетельствует о том, что L-изомеры АПФ транспортируются через липидный бислой липосомальпой мембраны, вызывая тушение эритрозина на внутренней поверхности мембраны, а D-изомеры не проникают во внутренний объем липосом и тушат фосфоресценцию эритрозина, расположенного только на внешней поверхности мембраны.
Обнаруженная способность водорастворимых аминокислотных производных фуллерена проникать через липидный бислой липосом и биологических мембран позволяет предположить, что при этом АПФ могут вызывать изменения активности мембраносвязанных ферментов в цито- и эндоплазматических мембранах. Впервые было изучено влияние аминокислотных производных фуллерена на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов в митохондриях гепатоцитов и клеток головного мозга крыс - моноаминооксидазы А и моноаминооксидазы В (МАО-А и МАО-В, соответственно).
В качестве АПФ изучались C6o-DL-Ala, C6o-DL-Ala-DL-Ala, C6o-DL-Arg [109-112] на каталитическую активность МАО-А и МАО-В (субстраты - серотонин и бензиламин, соответственно). МАО-А и МАО-В являются важнейшими ферментами метаболизма. Они отвечают за процесс окислительного дезаминирования биогенных аминов (индолалкиламины, адреналин, норадреналин, дофамин). Известно, что МАО-А и МАО-В играют двойную защитную роль: защищают организм от токсических экзогенных аминов и защищают нейроны, использующие амины (серотонин и катехоламины) от образующихся эндогенных аминов, (например, тирамина, фенилэтиламина и триптамина), которые могут нарушать нормальную нейротрансмиссию [113]. Моноаминоксидаза является одной из двух главных мишеней для создания антидепрессантов. Из сказанного следует, что изучение влияния АПФ на МАО-А и МАО-В является важной задачей для создания новых лекарственных препаратов.
В работе было показано, что при действии указанных АПФ на субклеточные гомогенаты коры головного мозга крыс возрастает активность как МАО-А, так и МАО-В (рис. 4.1). Причем, наиболее эффективное воздействие на активность МАО-А оказывает Сбо-DL-Ala, тогда как на МАО-В они действуют примерно одинаково (табл. 4.1, 4.2). Таким образом, из рисунка 4.1 видно, что эффект воздействия АПФ на МАО-А в отличие от МАО-В зависит от фрагмента аминокислоты, присоединенной к фуллерену. Известно, что пониженная активность МАО-А характеризуется повышенной возбудимостью у животных, плохой обучаемостью [114]. Повышение активности МАО-А приводит к снижению адреналина в организме, что позволяет рассматривать активаторы МАО-А в качестве потенциальных препаратов для снятия нервного возбуждения. В то же время повышение активности МАО-В сопровождается увеличением свободнорадикальных интермедиатов окисления - активных форм кислорода, что согласно теории оксидативного стресса имеет важное значение в процессе старения [115]. Таким образом, из сказанного видно, что C6o-DL-Ala действует на МАО аналогично ноотропам.
Стереоспецифичность действия энантиомеров АПФ на функционирование МАО-А и МАО-В
В связи с обнаруженной стереоизбирательностью проницаемости энантиомеров АПФ через липидный бислой фосфатидилхолиновых липосом было изучено действие энантиомеров АПФ на активность мембраносвязанных ферментов.
Как видно из таблиц (4.3, 4.4) L-энантиомеры Сбо-Arg вызывают увеличение каталитической активности МАО-А митохондрий головного мозга крыс (аналогичные результаты были получены для митохондрий печени крыс), в меньшей степени МАО-В, в то время как D-энантиомеры не влияют на активность МАО-А, но вызывают увеличение активности МАО-В. Возможно, такой эффект вызван способностью L-энантиомеров проникать через биологические мембраны и взаимодействовать с активными группировками ферментов, в то время как D-изомеры не могут преодолевать гомохиральный барьер липидного матрикса мембран митохондрий. Для энантиомеров других АПФ получили аналогичные результаты.
Таким образом, на примере L-аргинина показано, что L-энантиомеры АПФ стимулируют увеличение активности МАО-А, это приводит к снижению адреналина в организме (как уже говорилось выше). Полученный результат позволяет рассматривать L-энантиомеры АПФ в качестве потенциальных препаратов антистрессорного действия. И наоборот D-энантиомеры, увеличивая активность МАО-В, способствуют дегенерации дофаминовых нейронов [116], а также увеличению свободнорадикальных интермедиатов окисления [117, 118].
Таким образом, выявлена стереоспецифичность влияния энантиомеров АПФ на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов митохондрий головного мозга и печени крыс. Показано, что L-энантиомеры могут рассматриваться в качестве потенциальных препаратов антистрессорного действия, в то время как D-энантиомеры вызывают стимуляцию патологических процессов в организме, таких как старение, гибель клеток в результате образования нейротоксина МРР+.
В последние годы интерес к изучению фотодинамических свойств производных фуллеренов существенно возрос в связи с выявленным у них широкого спектра фармакологической активности [119]. Еще в 1993 г. [120] была синтезирована и испытана серия производных фуллерена Сбо для фотонаведенного ингибирования ферментов. Было показано, что модифицированные фуллерены ингибируют цистеиновые и сериновые протеазы при облучении светом низкой интенсивности и даже предложен механизм ингибирования ферментов с участием синглетного кислорода.
Поскольку производные фуллерена характеризуются наличием полосы поглощения в области видимого света, где излучают гелий-неоновые и полупроводниковые лазеры, применяемые в медицине, то их можно использовать для фотодинамической терапии вследствие способности фотовозбужденного фуллерена генерировать синглетный кислород, расщепляющий молекулы ДНК [121].
В работе изучалось фотозависимое действие АПФ на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов - моноаминоксидазу А (МАО-А) и моноаминоксидазу В (МАО-В). В качестве испытуемых соединений были выбраны Сбо-L-Ala, C60-L-Arg, C6o-L-Ala-L-Ala. Исследования проводили при шестичасовой инкубации митохондрий с L-изомерами АПФ в отсутствие света и при освещении лампой накаливания для необлученных образцов и после облучения их импульсным лазером X = 532 нм. Как видно из таблицы, при действие L-изомеров АПФ после 6-часовой инкубации необлученных митохондрий головного мозга крыс в отсутствие света значение активности МАО-А увеличивалось, а после шестичасового освещения лампой накаливания не менялась. При этом темновая инкубация значительно (в 2 - 3 раза) увеличивала значения активности фермента по сравнению с аналогичными значениями в опытах с инкубацией необлученных образцов при дневном освещении. Из таблицы видно, что наибольшую активацию МАО-А вызывал Сбо-L-Ala. Меньший, но в целом подобный эффект обнаружен и в случае МАО-В (табл. 4.5, 4.6). В случае облучения образцов митохондрий с АПФ светом длиной волны 532 нм при 6-часовой инкубации в отсутствие света активность МАО-А для необлученных образцов возрастала в значительно большей степени, чем для образцов после облучения (таблица 4.5). При инкубации митохондрий с L-изомерами АПФ на свету активность облученных образцов возрастала, в то время как необлученных оставалась неизменной. При этом значения активности облученных образцов при темповой инкубации значительно превосходили аналогичные при инкубации на свету. В случае МАО-В значения активности облученных образцов после шести часовой темновой инкубации значительно превышали аналогичные значения необлученных образцов (таблица 4.6). Более слабый аналогичный эффект наблюдался для МАО-В в образцах, инкубированных при освещении лампой накаливания. Как видно из таблиц (4.5, 4.6), при инкубации образцов митохондрий с АПФ в отсутствие света увеличение активности МАО необлученных и облученных образцов зависит от вида аминокислоты, присоединенной к фуллерену. При инкубации образцов при освещении лампой накаливания активность ферментов в необлученных образцах не зависит от вида аминокислоты, в отличие от образцов, подвергнутых лазерному облучению.
Влияние АПФ на ПОЛ при цитомегаловирусной инфекции
Задача ингибирования цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) является серьезной проблемой современной клинической медицины, т.к. цитомегаловирус (ЦМВ) подавляет иммунитет и сопровождает ВИЧ-инфекцию в качестве наиболее распространенного оппортуниста. Большинство химиопрепаратов для ингибирования ЦМВИ требуют применения высоких доз в течение длительного времени и, как правило, являются высоко токсичными. Этими проблемами объясняется актуальность изучения физико-химических механизмов развития ЦМВИ и создания на основе полученных результатов новых химических соединений - эффективных ингибиторов цитомегаловируса. К настоящему времени накопилось достаточно предпосылок для использования в качестве таковых производных фуллеренов.
Известно, что производные фуллеренов обладают рядом уникальных особенностей: способностью проникать через липидные мембраны, модулировать транспорт ионов, преодолевать гематоэнцефалический барьер; некоторые из них проявляют биологическую активность, включая антивирусную, и антиоксидантную [78].
Как известно свободнорадикальный механизм ПОЛ и его торможение биоантиоксидантами играет важную роль в регуляции процессов пролиферации клеток, размножения бактерий и некоторых вирусов [116]. Известно также, что не существует общего механизма развития различных вирусных инфекций, что не позволяет создать класс препаратов, универсальных ингибиторов различных вирусов. В связи с этим возникает интерес к созданию высокоэффективных ингибиторов ЦМВИ на основе производных фуллерена С60, а также к изучению взаимосвязи между развитием ЦМВИ и изменением уровня ПОЛ с целью более глубокого понимания физико-химических механизмов развития этой вирусной инфекции.
Для решения поставленных задач исследовали ингибирующую способность АПФ по отношению к ЦМВИ, а также зависимость между увеличением концентрации вирусных белков и изменением уровня ПОЛ в культуре клеток фибробластов легкого эмбриона человека (ФЭЧ) в процессе развития и ингибирования ЦМВ-инфекции.
В качестве ингибиторов ЦМВ-инфекции использовались: ганцикловир - клинический препарат, ингибитор ЦМВ-инфекции и водорастворимые аминокислотные производные фуллерена С60: C60-AMNa и C60-AKKNa (водорастворимые натриевые соли продуктов эквимолярного присоединения у-аминомасляной и со-аминокапроновой кислот к фуллерену С60). Исследования проводили на модели ЦМВИ in vitro в культуре фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ)
Было показано, что эффективная доза противовирусного действия (ЭДэ-о) производных фуллерена при использовании вирулицидной схемы в культуре ФЭЧ составляет 0,20 -0,22 мкг/мл. При этом ЦД5о - концентрация АПФ, при которой остаются жизнеспособными 50% клеток ФЭЧ 1000 -1200 мкг/мл, что свидетельствует о выраженном противовирусном действии испытуемых соединений и о их чрезвычайно низкой токсичности. Индекс селективности (ИС) для АПФ составляет 5000. Для сравнения ИС для ганцикловира (патентованного ингибитора ЦМВИ) составляет лишь 1000. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования Сбо-AMNa и Сбо-AKNa в качестве эффективного ингибитора ЦМВИ. Как видно из таблиц 5.2 и 5.3 инфицирование клеток ФЭЧ цитомегаловирусом сопровождается увеличением концентрации вирусных белков при развитии ЦМВ-инфекции, а также повышением концентрации МДА. Таким образом, развитие ЦМВИ сопровождается повышением уровня ПОЛ.
При введении Сбо-AMNa в инфицированные ФЭЧ наблюдается снижение концентрации белков в клетках до значений, приближающихся к концентрации белка в неинфицированной клеточной культуре (рис. 5.2). При этом концентрация МДА в инфицированной культуре ФЭЧ также уменьшалась до значений, близких к концентрации интактных ФЭЧ. Как видно из таблиц 5.2 и 5.3 при действии ганцикловира также наблюдалось снижение уровня ПОЛ в культуре ФЭЧ. Но эффективность противовирусного действия этого препарата на ЦМВИ, а также его антиоксидантная активность были значительно ниже, в сравнении с изученным нами Сбо-AMNa. Полученные результаты свидетельствуют о высокой противовирусной активности водорастворимого производных фуллерена С6о, особенно натриевой соли фуллерениламиномасляной кислоты, а также о корреляции между изменением концентрации вирусных белков и уровнем ПОЛ в культуре ФЭЧ при развитии ЦМВ -инфекции: при увеличении концентрации белков наблюдается повышение уровня ПОЛ в клеточной культуре, тогда как при введении АПФ и гапцикловира в зараженную культуру уменьшается концентрация вирусных белков и снижается уровень ПОЛ (рис.5.2).
Вероятное объяснение высокой эффективности противовирусного действия АПФ заключается в мембранотропных свойствах аминокислотных производных фуллерена, их способности, проникая через липидный бислой, связываться с липофильными участками липидного бислоя или гидрофобными сайтами мембранных белков.
Таким образом, в ряду водорастворимых аминокислотных производных фуллерена С6о найден эффективный ингибитор цитомегаловируса - C6o-AMNa, который по своему ингибирующему действию и антиоксидантным свойствам превосходит известный клинический препарат для лечения ЦМВИ - ганцикловир.
Большинство результатов, полученных в ходе выполнения диссертационной работы, являются абсолютно новыми. Впервые обнаружено и детально исследовано влияние водорастворимых АПФ на кинетику затухания фосфоресценции триплетного зонда эритрозина. Полученные результаты легли в основу создания оригинальной методики изучения с помощью метода триплетных зондов способности биологически активных соединений транспортироваться через фосфолипидные мембраны. Впервые установлена высокая стереоспецифичность способности энантиомеров АПФ проникать через липидный бислой фосфатидилхолиновых липосом и биологических мембран митохондрий. Пионерскими являются эксперименты и методика их проведения по изучению влияния производных фуллерена на мембраны эритроцитов перефирической крови, что позволило установить проницаемость эритроцитарной мембраны для АПФ. Впервые показано увеличение каталитической активности ферментов окислительного дезаминирования биогенных аминов при воздействии на них АПФ. Обнаружена фотозависимость влияния АПФ на каталитическую активность МАО-А и МАО-В. Результат ингибирования ПОЛ в гомогенатах коры головного мозга крыс при действии L-энантиомеров аминокислотных производных фуллерена С6о представляет несомненный интерес в свете защиты организма от последствий оксидативного стресса.
Похожие диссертации на Мембранотропные свойства аминокислотных производных фуллерена C60 и обусловленная ими биологическая активность
