Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы: экспериментальные методы и математические модели 6
2. Физико-химические основы описания материально-энергетического баланса роста клеточных культур 31
2.1. Введение 31
2.2. Элементный баланс роста клеточных популяций 32
2.3. Понятия Ф-базиса и редоксона 35
2.4. Термодинамика баланса вещества и энергии при прохождении химических реакций 42
2.5. Баланс и термодинамика химических реакций в Ф-базисе 48
2.6. Характеристики клеточной биомассы в Ф-базисе 56
2.7. Энергетика метаболизма в Ф-базисе 60
3. Теория материально-энергетического баланса клеточных популяций 65
3.1. Потоки редоксонов в метаболизме и их связь с переносчиками энергии. Парциальные обмены 65
3.2. Система уравнений материально-энергетического баланса 71
3.3. Эффективность роста биомассы и образования продуктов метаболизма 72
3.4. Модификации системы парциальных обменов 77
3.5. Верхний предел выхода биомассы и продуктов метаболизма 82
3.6. Энергетическая эффективность роста фотосинтезирующих бактерий 85
3.7. Ионный баланс роста клеточных культур. Обоснование бистата 88
3.8. Приложения теории материально-энергетического баланса 95
4. Метод баланса в экспериментальной кинетике микробных культур 106
4.1. Объекты и методы исследования 106
4.2. Соотношение тепловыделения и потребления кислорода при росте микроорганизмов 111
4.3. Энергетические и кинетические характеристики микробных культур при лимитировании и ингибировании их роста 114
4.4. Влияние температуры на рост культур дрожжей 124
4.5. Двойное лимитирование роста микроорганизмов 127
5. Математические модели популяций клеток прокариот и эукариот 131
5.1. Постановка задачи 131
5.2. Временной масштаб переходных процессов в непрерывных культурах. Изохроны 132
5.3. Динамика бистата 145
5.4. Базовая распределенная модель роста клеточных популяций 149
5.5. Исследование решений распределенной модели, учитывающей возраст клеток 157
Заключение 181
Выводы 187
- Элементный баланс роста клеточных популяций
- Система уравнений материально-энергетического баланса
- Соотношение тепловыделения и потребления кислорода при росте микроорганизмов
- Временной масштаб переходных процессов в непрерывных культурах. Изохроны
Введение к работе
Актуальность проблемы
Популяции микроорганизмов и клеток тканей представляют большой интерес для биофизических исследований. Многие свойства микробных клеток, в особенности эукариотических, аналогичны свойствам клеток высших организмов. Клеточная культура, выращиваемая в строго контролируемых условиях, с точки зрения ряда ее свойств является физической моделью отдельной клетки, поскольку межклеточные взаимодействия в ней намного слабее, чем в тканях. Такой объект может поддерживаться и изучаться в течение длительного времени при относительно небольших затратах на эксперимент. Физико-математические исследования клеточных популяций важны с точки зрения и фундаментальной науки, и приложений. Микроорганизмы занимают одно из важнейших мест в биосфере Земли. В последние десятилетия культуры микроорганизмов и клеток тканей широко используются в биотехнологии, как промышленной, так и (микроорганизмы) экологической. Несмотря на то, что такие исследования широко проводятся в течение десятков лет, ряд важных проблем в этой области остаются недостаточно разработанными. Сюда относятся интегральные закономерности клеточной энергетики, контролирующие распределение вещества и энергии в процессе роста популяции, а также кинетические закономерности роста, учитывающие ее гетерогенность по ключевым физиолого-биохимическим показателям. Вследствие сложности объекта основное внимание при его изучении уделялось подходам, основанным на представлении о микробной популяции как «точечном» объекте (описываемом сосредоточенной моделью) и, как правило, мало учитывавшим роль законов сохранения в динамике этого объекта. Следствием было смещение акцентов в сторону «точечной» кинетики в ущерб стехиометрии и биоэнергетике. Предпринятые нами исследования направлены на замещение пробелов знания в этой области.
Цель исследования
Основная цель нашей работы -развитие интегральных подходов в биоэнергетике и кинетике клеточных популяций, позволяющих выявить общие закономерности баланса вещества и энергии в метаболизме клеток, динамики роста популяций с учетом их гетерогенности, и применение этих подходов к исследованию культур микроорганизмов.
Эта общая задача состоит из следующих этапов.
1. Разработка теоретических основ анализа материально-энергетического баланса, а также ионного баланса клеточного метаболизма в целом, то есть полной совокупности биохимических реакций.
2. Применение этого подхода к теоретическому исследованию роста микробных культур и образования ими продуктов метаболизма.
3. Экспериментальные исследования энергетики и кинетики роста микробных культур, основанные на теории материально-энергетического баланса.
4. Разработка базовой распределенной математической модели роста клеточной популяции, нахождение и исследование ее решений для случая, когда рост зависит от концентрации одного из субстратов.
5. Выявление новых аспектов «точечной» динамики клеточных популяций.
При разработке теории материально-энергетического баланса ставилась задача получить достаточно полный и работоспособный подход, обладающий концептуальной ясностью и дающий возможность максимально просто и эффективно получать реалистичные значения энергетических показателей процесса роста клеточных популяций. Нам представлялось важным разграничить роль трех факторов, определяющих биоэнергетику роста: 1) законы сохранения вещества и энергии, 2) вариабельность метаболических путей и 3) кинетика биохимических реакций.
Научное значение и новизна работы
В течение многих лет исследования субклеточных систем преобладают над исследованиями, относящимися к уровню целых клеток и их популяций. Объективная причина этого - сложность клетки, то есть большое количество ее составных частей, многоуровневость и разнообразие ее пространственной и функциональной организации. Субъективная причина, на наш взгляд, состоит в том, что основной акцент при изучении клеток и их популяций делается на ставшие традиционными подходы - ферментативную кинетику и обыкновенные дифференциальные уравнения.
Наша работа выходит за эти рамки. Мы предлагаем компактный подход, выделяющий своего рода прочный «скелет» в клеточном метаболизме, рамки, в пределах которых существует биологическое разнообразие клетки и сообщества клеток. Этот подход использует физико-химические свойства органических соединений как материала, из которого состоит клетка, свойства, которые обусловливают связь потоков вещества в метаболизме с передачей энергии и ее использованием в клетке. Он делает картину метаболических потоков и их связей легко понимаемой и пригодной для эффективного использования в конкретных расчетах. Этот подход дает возможность редукции количественных характеристик роста клеток и их популяций, то есть их сведения к характеристикам субклеточных систем.
Распределенная модель роста клеточной популяции, разработанная нами, отличается от имеющихся в литературе сбалансированностью уравнений, описывающих граничные условия, по количеству веществ-участников процесса роста и деления клеток. Впервые нами найдены и исследованы решения распределенной модели микробной популяции для случая, когда учитывается влияние среды на клетки. Нахождение таких решений выводит распределенные модели на уровень рабочего аппарата исследователя, занимающегося фундаментальными и прикладными задачами в области биотехнологии и экологии.
Нами разработан метод описания динамики точечных моделей с помощью изохрон в фазовом пространстве, дополняющий множество фазовых траекторий и дающий интегральное описание временных свойств переходных процессов. Разработан на основе теории ионного баланса и осуществлен экспериментально новый эффективный метод непрерывного культивирования - бистат, разработана и изучена математическая модель культуры, растущей в бистате.
В работе получены следующие новые результаты.
1) Впервые разработано общее понятие восстановленности для любого химического соединения, объединяющее старый (кислородный) и новый (электронный) подходы и предложена универсальная единица восстановленности - редоксон.
2) Впервые разработаны строгие понятия парциальных обменов как частей целостного метаболизма клетки, основанные на параллельном делении метаболических потоков.
3) Впервые сформулирована полная система уравнений внутриклеточного материально-энергетического баланса, учитывающая одновременно движение редоксонов в метаболизме и баланс двух видов промежуточных переносчиков энергии - а) макроэргических связей и б) протонов как носителей высокого трансмембранного электрохимического потенциала.
4) Впервые дан общий анализ ионного баланса роста клеточных популяций и на его основе разработан и осуществлен новый способ непрерывного культивирования - бистат.
5) Впервые в распределенной модели роста клеточных популяций случайность динамики роста отдельной клетки учтена в наиболее компактной форме как сконцентрированная по времени в момент деления клеток.
6) Впервые получено и исследовано решение системы уравнений, описывающей динамику возрастного распределения клеток одновременно с влиянием концентрации субстрата (системы из уравнения в частных производных, интегрального и интегро-дифференциального уравнений).
7) Впервые дан изохронный портрет клеточной популяции.
Практическое значение работы
Разработанный нами метод материально-энергетического баланса является эффективным исследовательским инструментом для интегрального описания популяций клеток. Он может быть применен и для описания популяций многоклеточных организмов. Этот подход позволяет упростить рассмотрение динамики клеточных популяций, исключив из этого рассмотрения факторы, не влияющие на изучаемые характеристики. Например, если изменение метаболических путей не приводит к изменению затрат АТФ на конструктивный обмен, то такое изменение не должно учитываться при вычислении величины выхода биомассы из субстрата. Этот подход позволяет найти реалистичные оценки величин выходов биомассы или органических продуктов из субстрата на основе биохимической информации о метаболизме данного субстрата. Он является основой технологических расчетов режимов культивирования и особенно эффективен в случае высоких концентраций биомассы. Он позволяет также осуществлять мониторинг растущей популяции в режиме реального времени, что является источником качественно новой информации о процессе ее жизнедеятельности. Новый способ культивирования - бистат, разработанный нами на основе ионного и материально-энергетического балансов роста, обеспечивает устойчивое культивирование во всем диапазоне концентраций влияющего на рост субстрата S, в том числе при тех значениях S, которые неосуществимы известными методами (хемо-стат, турбидостат, рН-ауксостат). Разработанная нами базовая распределенная модель роста микробной популяции и найденные решения выявляют ряд новых свойств поведения клеточных популяций с учетом их физиологической гетерогенности, что также важно в приложениях к технологическим процессам. Наконец, изохронный портрет популяций и других динамических объектов позволяет определить время достижения стационарного состояния системы с заданной точностью.
Апробации работы
Результаты работы доложены и обсуждены в 22 сообщениях на 18 отечественных и зарубежных конференциях разных лет: 1st International Symposium on Advances in Microbial Engineering (Marianske Lazne, Czechoslovakia, 1972), III Всесоюзное совещание по управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск, 1973), Всесоюзные конференции по лимитированию и ингибированию процессов роста и микробиологического синтеза (Пущино, 1976, 1980 - 2 сообщения), Седьмая Всесоюзная конференция по калориметрии (Черноголовка, 1977), Всесоюзные совещания по непрерывному культивированию микроорганизмов (Москва, 1978, Киев, 1981 - 2 сообщения), съезды Всесоюзного микробиологического общества (Рига, 1980, Алма-Ата, 1985 - 2 сообщения), International Symposia on Continuous Cultivation of Microorganisms (Prague, 1978, Hradec Kralove, Czechoslovakia, 1987 - 5 сообщений), FEMS International Symposia (Hradec Kralove, Czechoslovakia, 1981, Пущино, 1983 - 2 сообщения), 1 Всесоюзное совещание по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1983), 1 международная школа по автоматизации научных исследований (Пущино, 1985), IV Всесоюзная конференция "Управляемое культивирование микроорганизмов" (Пущино, 1986 - 2 сообщения), Всесоюзная конференция «Биоконверсия-88» (Рига, 1988), 15 International Symposium on Yeasts (Riga, 1991), Международная конференция «Математика, компьютер, образование» (Пущино, 2003).
Публикации
Основные результаты работы изложены в 51 публикациях, из которых в рецензируемых изданиях 46 (20 в отечественных и 26 в зарубежных изданиях).
Элементный баланс роста клеточных популяций
Связи между различными стехиометрическими коэффициентами при росте клеточных популяций вначале изучались нами в форме элементного баланса, то есть на основе закона сохранения вещества по каждому химическому элементу [261-263]. Здесь дано краткое описание этого исследования, поскольку оно явилось стартовой позицией для разработки общего подхода к области, названной нами «материально-энергетический баланс роста клеточных популяций». Типичная задача баланса такова. Имеется несколько величин, характеризующих эффективность роста микроорганизмов. В простейшем случае аэробного роста, когда образование органических продуктов незначительно или вообще отсутствует, это два коэффициента - Yx/S - выход биомассы из органического субстрата, водорода и т.д. и Y Q - выход биомассы из потребленного кислорода. Субстрат является источником вещества и энергии для роста, а кислород связан с процессом извлечения клетками энергии из субстрата для использования в метаболизме при преобразовании субстрата в биомассу. Поэтому каждый из двух выходов представляет интерес. Среди большинства исследователей существовало мнение, что необходимо изучать оба коэффициента. Нами был поставлен вопрос о взаимосвязи этих величин. При наличии такой связи можно ограничиться изучением одной из них, а именно, той, которую легче измерять, а другую при необходимости вычислять из первой. Нами был разработан общий подход к исследованию элементного баланса микробного роста, приложимый к любому составу участников процесса [261-263]. Этот подход на стадии исследований элементного баланса был применен к весьма распространенному в природе и биотехнологии процессу - гетеротрофному аэробному росту микроорганизмов, когда в качестве источника азота используется аммиак. Этот случай ьыл взят также потому, что азот в NH3 находится в том же электронном состоянии, в котором находится почти весь азот биомассы. Как будет видно из дальнейшего, рассмотрение материального баланса на данном примере позволяет перейти к общей концепции материально-энергетического баланса без ограничений на вид субстратов и продуктов роста.
При составлении баланса будем учитывать из всего множества субстратов только органический субстрат, кислород и источник азота. Эти вещества служат источниками С, Н, О и N, содержание которых в клетках обычно наиболее велико по сравнению с другими элементами, получаемыми только из других субстратов (Mg, Р, Fe и др.). При необходимости число рассматриваемых элементов и множество субстратов могут быть легко расширены. Мы представили элементный состав сухого вещества биомассы, состав органического субстрата и возможного органического продукта в общем ви де следующим образом [263]: CHmOi (субстрат), CHpOnNq (биомасса), CHrOsNt (продукт) (2.2.1) Углерод органического субстрата расходится в трех направлениях - в биомассу, в органический продукт (если он образуется) и в С02. Обозначим выходы (по углероду) биомассы и продукта как yx/s и уш. Каждая из этих величин есть доля углерода субстрата, включенная в вещество биомассы и продукта. Тогда процесс преобразования вещества субстратов при росте культуры с точки зрения перераспределения атомов химических элементов записывается в следующем виде [263]: CHmOi + aNH3 + Ю2 = = yx/s CHpOnNq + уш CHAN, + (1- yx/s - Угя )С02 + сН20 (2.2.2) Значения _yx/s и yp/s не фиксированы. В зависимости от микроорганизма и условий культивирования они могут меняться в пределах от нуля до некоторого максимума, о чем речь пойдет ниже. В уравнении (2.2.2) присутствуют 5 коэффициентов: а, Ъ, с, yxls и yp/s. Имеются 4 условия сохранения числа атомов химических элементов С, Н, О, N, из которых условие для углерода уже учтено. Остальные условия дают выражение а, Ь, с через _yx/s и _yp/s: a = yx/s q + _yp/st (2.2.3) b = 4(rs -УХ/SXB -УР/S/P) (2.2.4) m 3q - p 3t - r ,_ - _4 с = — + Ух/s - Y + УР/S -y- (2.2.5) где rs = 4 + m - 21 (2.2.6) rB=4 + p-2n-3q (2.2.7) /p=4 + r-2s-3t (2.2.8) Если известны величины ys, ув, y? (известен состав участников процесса), то находится коэффициент Ъ, а затем путем пересчетов Величины ys, ув, ур играют чрезвычайно важную роль в материально-энергетическом балансе микроорганизмов и живой материи вообще. Они являются мерой восстановленности углерода соответственно органического субстрата, биомассы и органического продукта (см. ниже). Именно эти величины, полученные при исследовании элементного баланса, послужили отправным пунктом дальнейшего развития наших исследований, приведшим к разработке метода материально-энергетического баланса. Величины а, Ь и с описывают расход аммиака и кислорода и образование метаболической воды при росте культуры. Чтобы найти их численные значения, необходимо задать выходы биомассы и продукта по углероду yx/s и yP/s, а также ys, ув, уР. Значения yx/s и уР/в зависят от вида клеток и от условий культивирования. Для часто встречающегося случая, когда образование органических продуктов отсутствует или незначительно, yP/s = 0. Поскольку молекулярная масса кислорода равна 32, а сухая масса клеток в правой части (2.2.2) равна I X/S/ B ( в Для углерода в сухом веществе клеток), то расход кислорода на единицу образованной биомассы равен [263]: 1 [х/о _2сгв У УУх/s У в (2.2.9) 1 Кривые зависимости от yXJS для некоторых субстратов приведены х/о на рис. 2.2.1. Для каждого значения ys имеется yx/s такое, что расход кислорода становится равным нулю, а при более высоких yx/s делается отрицательным. вестны, это предположение выглядит неправдоподобным. Очевидно, что строгое решение вопроса о максимально допустимом значении выхода по углероду требует совместного рассмотрения баланса вещества и баланса энергии. 2.3. Понятия Ф-базиса и редоксона Величиной, несущей в себе связь балансов вещества и энергии, является степень восстановленности у. Чтобы понять ее смысл, мы записали уравнение окисления органического вещества кислородом: CHuOvNw + ( -» СО2 + Н20 + NH3 [264, 265]. Здесь CHuOvNw может быть индивидуальным органическим соединением, либо их смесью, в том числе биомассой клеток. После сбалансирования это уравнение имеет вид: CHuOvNw+ /-02 = С02 + -(u-3w)H20 + wNH3 (2.3.1) 4 2 где =4+u-2v-3w (2.3.2) - выражение, идентичное ys, ув, ур. Аммиак в качестве продукта реакции выбран потому, что 1) он весьма часто является источником азота для роста, 2) азот в нем находится в электронной форме, близкой к той, которую он имеет в большей части макромолекул биомассы. О третьей причине будет сказано ниже.
Если окисление происходит чисто химическим путем, то весь запас энергии органического вещества превращается в тепло. При биохимическом окислении с участием электрон-транспортных путей часть энергии сохраняется в промежуточных носителях, а затем используется клеткой. Таким образом, процесс (2.3.1) является способом оценки общего количества физиологически доступной энергии, заключенной в органических веществах. Соответственно, С02, Н20 и NH3 следует рассматривать как вещества, имеющие нулевой уровень физиологически доступной энергии. Каждая молекула кислорода имеет 4 вакантных места для присоединения электронов других атомов и образования С02 и Н20. Тогда - 02 есть ко- 4 личество кислорода, пересчитанное на один электрон, акцептируемый свободным кислородом. На первом этапе наших исследований материально-энергетического баланса мы использовали количество таких электронов для оценки энергетического запаса субстрата, органического продукта роста и сухого вещества биомассы [265-271]. Электроны, акцептируемые свободным кислородом при окислении органического вещества по схеме (2.3.1), мы назвали доступными электронами [265-271]. Этот термин был предложен Payne с соавт. исключительно для субстратов роста состава С,Н,0 (см. Главу 1). Нами этот термин был расширен и применен к веществам состава C,H,0,N, включая биомассу клеток. Как упоминалось в Главе 1, ранние работы по термохимии органических соединений выявили факт приблизительного постоянства отношения теплообразования к потреблению кислорода при окислении низкомолекулярных органических соединений. Нами было найдено, что та же закономерность имеет место и для биомассы микроорганизмов [265-272]. Сделанное нами расширение содержания понятия доступного электрона позволило сформулировать первый вариант концепции материально-энергетического баланса роста микроорганизмов, ввести понятие энергетического выхода роста и получить ряд важных результатов. В то же время понятие доступного электрона было недостаточно строгим с точки зрения термодинамического подхода, принятого в физической химии. К тому же оно не позволяло рассмотреть случай, когда акцептором электронов в дыхательной цепи является не кислород, а другое неорганическое соединение, например, нитрат.
Система уравнений материально-энергетического баланса
Описание баланса метаболизма сделано нами как в форме конечных приращений [267-269,274], так и в скоростной форме [287,288,292,293]. Здесь мы излагаем второй вариант. Нами введены следующие удельные скорости, характеризующие главные метаболические потоки в клетке: rs для потребления субстрата-источника редоксонов для роста, ju для роста биомассы, г0 для потока редок-сонов по дыхательной цепи, гР для образования продуктов. Все эти величины имеют размерность ч-1 и рассчитаны на 1 экв. RO сухого вещества клеточной биомассы, имеющейся на данный момент времени. Скорости //, г0 и гР характеризуют потоки вещества соответственно через конструктивный, дыхательный и продуктный обмены. Соотношение (3.1.2) в скоростной форме имеет вид: rs=M+rP + r0 (3.2.1) Это весьма простое соотношение описывает внешнюю сторону материально-энергетического баланса полного клеточного метаболизма, то есть только входящие и выходящие потоки. Оно основано на законе сохранения вещества и не отражает влияние особенностей метаболизма на рост популяции. Последнее стало возможно на основе введенного нами деления метаболизма на парциальные обмены. Нами введены следующие коэффициенты, характеризующие стехиометрию парциальных обменов: YB - количество МЭС, необходимых для прохождения 1 экв. RO по конструктивному обмену, 0 - количество МЭС, образуемых при прохождении 1 экв. RO по дыхательному обмену, р - количество МЭС, образуемых при прохождении 1 экв. RO по продуктному обмену. Всегда FB О, 0 0. Если продуктный обмен в целом продуцирует МЭС, то FP 0; в противном случае Р 0. Эти коэффициенты связаны с циклическим процессом образования и потребления МЭС. Еще один циклический процесс, включающий в себя кругооборот как МЭС, так и RO, это поддержание клеток и футильная диссипация (ПКФД). Скорость расхода МЭС в ПКФД обозначена нами как %м. Баланс МЭС имеет вид: 0r0 + У?г? = Твц + хм (3-2.2) Включение в баланс еще одного переносчика энергии - высокоэнергетических протонов (ВЭП) позволило нам составить более подробную систему уравнений. Эта система учитывает возможные потери энергии при обмене ВЭП на МЭС в электрон-транспортной цепи, а также возможные прямые затраты ВЭП в конструктивном обмене и ПКФД.
Образование ВЭП следует понимать как перенос протона через мембрану против градиента концентрации КҐ и, соответственно, придание ему высокого значения трансмембранного электрохимического потенциала. Затрата ВЭП - это обратный перенос протона через мембрану в область, где его потенциал низок. Для уравнений баланса использованы следующие стехиометрические коэффициенты и скорости: Фн - число электронов (то есть, число редоксонов), перенесенных по электрон-транспортной цепи через участок сопряжения, необходимое для образования одного ВЭП; кс - число точек сопряжения транспорта электронов и протонов; Фм - число ВЭП, затраченных АТР-азой для образования одной МЭС; Фв - число протонов, затрачиваемых непосредственно в конструктивном обмене на прохождение 1 RO из субстрата в биомассу; гнм - скорость использования ВЭП АТР-азами для образования МЭС %я - скорость непосредственных затрат ВЭП в ПКФД. Величины Гдм и Хя - удельные, в расчете на 1 RO существующей биомассы. Баланс ВЭП: г0кс/Фн = гнм + ФВУи + Хя (3-2.3) Баланс МЭС: ГЩАІФМ + VP = ГвМ + Хм (3-2.4) Для вычисления характеристик материально-энергетического баланса роста популяции клеток возможны два варианта системы уравнений: А) (3.2.1) и (3.2.2); Б) (3.2.1), (3.2.3) и (3.2.4). 3.3. Эффективность роста биомассы и образования продуктов метаболизма Количественной оценкой энергетической эффективности роста биомассы является выход биомассы из субстрата по энергии (см. Главу 1). Нами введен другой показатель эффективности роста - выход биомассы из субстрата по редоксонам (в первоначальном варианте - выход по доступным электронам) [284,265,267,268,270,271,287]: 77x/s=y"As (3-3.1) Аналогичной мерой преобразования вещества субстрата в вещество восстановленных продуктов является введенный нами выход продуктов из субстрата по редоксонам [267, 268, 292, 296]: 7P/S= PA S (3-3.2) Поскольку энергетическая цена редоксона в органических соединениях близка к универсальной величине (Глава 2), величины 7] в и P/s близки к долям энергии субстрата, включенным, соответственно, в биомассу и органические продукты. С другой стороны, эти показатели легко находятся без применения калориметрической бомбы и без использования справочников по термодинамическим величинам, в которых то или иное вещество может отсутствовать. Для этого измеренные в эксперименте значения выходов по массе Ix/g и Ур/8 пересчитываются с использованием (2.3.9): x/s= x/s p/s= p/s (3.3.3) s-s/s crsrs Обратные соотношения позволяют найти выходы по массе, если выходы по редоксонам вычислены, исходя из тех или иных предпосылок (см. ниже): x/s = x/s» Ym 7p/s (З -3.4) 0в/в РУР Поскольку выход биомассы из кислорода Yyj0 (если процесс аэробный) также представляет интерес, нами найдено [267]: 3 lyjo= f lro- х/о = Лхіо (3.3.5) 2сгв7в где TJX/Q - отношение числа редоксонов субстрата, включенных в биомассу, к числу RO, прошедших по дыхательной цепи. Эта величина близка к отношению энергии субстрата, включенной в биомассу, к энергии, выделенной в виде тепла (см. ниже). Из уравнения (3.2.1) мы получили взаимосвязь величин т/x/S ЧХІО И 7P/S 7хю=:, — (3.3.6) 1 - x/s 7P/S Используя уравнения (3.2.1) и (3.2.2), мы вычислили энергетический выход биомассы через характеристики клеточного метаболизма [268,269,288,297]: 1 + (3.3.7) Vx/s Vx/s V где 7jx/s - энергетический выход биомассы при условии полного отсутствия затрат энергии на ПКФД («истинный» выход роста), те - удельная скорость затрат субстрата на ПКФД. Эти величины равны а .ГтПив + ГоИ-Чп) „ ZM (3.3.8) Численные значения коэффициентов W определяются на основе биохимических данных о метаболических путях [268]. Продуктный обмен.
В случае, когда субстрат - глюкоза, продукт - этанол, либо молочная или уксусная кислота, метаболический путь - путь Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса (гликолиз), продуктный обмен производит 2 МЭС (АТР) на 24 RO [290]. Отсюда нами найдено, что !Рр в этом случае равно 2/12 = 0,083. Если продуктный обмен с теми же исходными и конечными веществами проходит через путь Энтнера-Дудорова, то на 24 RO производится 1 МЭС [290], вследствие чего Р = 0,041. Дыхательный обмен. Субстратное фосфорилирование здесь играет малую роль. Дыхательная цепь характеризуется показателем Р/О (количество АТР на 2 электрона, акцептированных атомом кислорода), откуда 0 = Уг Р/О. Для Р/О = 3 или 2 значение 0, соответственно, равно 1,5 или 1. Конструктивный обмен. Расчеты затрат МЭС на синтез сухого вещества биомассы были сделаны в работах [298,299]. Согласно расчетам Стоутхамера [298], на 1 моль АТР образуется 30 г АСБ при росте на глюкозе. При росте на яблочной, молочной или уксусной кислотах на 1 моль АТР образуется соответственно 15, 13 или 10 г АСБ. Используя (2.3.9) и сгв/в = 1.9, мы получили в = 0.2 для роста на глюкозе и 0.4, 0.46, 0,6 для вышеуказанных кислот как субстратов [268]. Оура [299] получил другую оценку: 61 г АСБ на 1 моль АТР при росте на глюкозе; для этанола им найдено 12.5 г АСБ/моль АТР. Из этих значений мы получили в =0.1 для роста на глюкозе и 0.5 для роста на этаноле. Отсюда видно, что необходима дальнейшая работа по систематизации биохимических данных для того, чтобы получить расчетным путем достоверную оценку WB. В разделе 3.5 описан разработанный нами подход, позволяющий обойти эту проблему и получить надежные оценки выхода биомассы при оптимальных условиях роста. Скорость затрат энергии на ПКФД может иметь две составляющие - зависящую только от условий среды (температура, рН, концентрации минеральных ионизированных субстратов) и пропорциональную удельной скорости роста [127]. Мы детализировали этот тезис, введя предположение, что это относится по отдельности к затратам МЭС и ВЭП на ПКФД [293, 297]: Хм = Хм + ХмМ Хи=Хя+ ХнМ С5-3-9) Из (3.3.8) и (3.3.9): = - - + - m m +m ju (3.3.10) x/s Пх/s V где 77 s - энергетический выход биомассы при отсутствии постоянной компоненты затрат энергии на ПКФД («максимальный» выход роста), те0 -удельная скорость затрат субстрата на ПКФД, не зависящих от ju: те0=- f ч (3.3.11) Величина 77x)s находится из соотношения: 1 1 +ие1, (3.3.12) x/s Vx/s где mel=- 1&J г (3.3.13) УРТР/S+ 0(1- /8)
Соотношение тепловыделения и потребления кислорода при росте микроорганизмов
Эта работа имела целью показать экспериментально действие полученной нами общей закономерности (пропорциональность тепловыделения клеточной популяции при аэробном росте потреблению кислорода с универсальным коэффициентом пропорциональности, см. раздел 3.8). Она содержит наши собственные эксперименты с синхронной культурой дрожжей Candida maltosa EH л 5, а также анализ литературных данных, в которых были опубликованы результаты по одновременному измерению скоростей дыхания и тепловыделения микроорганизмов [346]. Опыты с синхронной культурой Candida maltosa проводились в 8 по-вторностях. На рис. 4.2.1 точки изображают Q0 - тепловыделение клеток в расчете на 1 экв. RO кислорода, потребленного клетками. По оси абсцисс отложено время, прошедшее с начала цикла удвоения биомассы. В начале этого цикла происходит массовое образование почек у клеток дрожжей. Поэтому величина t близка к возрасту новообразованных клеток. Всего было сделано 38 измерений. Среднее значение QQ равно 103.68 кДж/экв. RO (± 8%). Это достаточно близко к энергетическому уровню редоксонов этанола HQ = 112.2 кДж/экв. RO (Таблица Ш). Данный эксперимент важен в том отношении, что отношение Q0 измерено вдоль жизненного цикла клеток и не показывает зависимости от возраста клеток. Кроме собственных измерений, нами были использованы литературные данные из работ, в которых измерялось тепловыделение клеток. Одновременно в этих работах измерялось потребление кислорода клетками непосредственно, либо косвенно - путем балансовых расчетов. Основываясь на этих данных, мы рассчитали тепловыделение в расчете на 1 RO потребленного клетками кислорода. Результаты представлены в таблицах 4.2.1 и 4.2.2. Среднее значение Q0 по всем данным из обеих таблиц равно 122 кДж/экв. RO (± 18%). Эта величина также близка к вышеупомянутому значению энер-гетического уровня редоксонов #0 . Большой разброс значений QQ объясняется аппар»атурными проблемами, связанными с тем, что объект измерений - живые клетки (см. раздел 3.8), а также тем, что большинство субстратов -углеводы, метаболизация которых могла быть связана с образованием продуктов брожения, количество и состав которых не определялись. Эта часть нашей работы показала, что предсказанная теорией материально-энергетического баланса пропорциональность метаболического тепловыделения клеток скорости потребления ими кислорода с универсальным коэффициентом пропорциональности подтверждается экспериментальными данными.
Данная часть нашей работы представляет собой приложение результатов теории материально-энергетического баланса к экспериментальным исследованиям выхода биомассы при росте микробных популяций, то есть эффективности преобразования вещества и энергии субстрата в вещество и энергию клеточной биомассы. Рост микробной культуры на субстратах различной степени вос-становленности. Это исследование проводилось с метанол ассимилирующими дрожжами Hansenula polymorpha DL-1 [297,312]. В качестве субстратов использовались метанол, этанол и глюкоза. На каждом субстрате проводили следующий эксперимент: 1) серия культивирований в стационарном хемостатном режиме при различных удельных скоростях роста; при этом определяли выход биомассы и ее элементный состав; 2) нахождение энергетического выхода билмассы в каждом режиме роста; 3) нахождение максимального выхода клеток из субстрата по массе и по энергии Y$s и 7xys не зависимой от ju компоненты удельной скорости расхода субстрата на поддержание клеток в массовом выражении mso и в энергетическом выражении те0. Эти биоэнергетические параметры затем сравнивались для роста на разных субстратах. Из таблицы видно, что we0 одинаково на глюкозе и этаноле, а на метаноле в 1.5 ргіза выше. Метанол отличается от двух других субстратов тем, что у дрожжей 2 RO из 6 уходят на кислород неэффективно, без запасания энер-трансмембранного электрохимического потенциала или образо-Соответственно, скорость затрат RO метанола на поддержание клеток при одной и той же скорости затрат МЭС должна быть выше, чем на других субстратах, в 6/4 = 1.5 раза. Именно такое соотношение значений те0 и было нами получено. Отметим, что величина mso, основанная на количестве массы субстрата и клеток, не выявляет влияния особенностей метаболизма на затраты энергии на поддержание клеток. Для сравнения расходов на поддержание Н. polymorpha с другими микроорганизмами мы, исходя из те0 = 0.02 ч_1; рассчитали величину тАТР (моль АТР/г АСБ ч) [297, 368]. Используя (3.3.11) для случая отсутствия восстановленных продуктов метаболизма (TJP/S=0) И принимая, что Р/О этих дрожжей равно 2 (ї о = 1), мы нашли, что независимая от // компонента скорости затрат АТР на поддержание клеток Хм = 0-02 моль АТР/экв-RO биомассы в час. Пересчет с помощью (3.3.16) с учетом сгвув « 2 дал гпАТР » 3 ммоль АТР/г биомассы в час. Эта величина соответствует нижнему пределу тАТР, опубликованному в литературе [2]. Следовательно, Н. polymorpha принадлежит к микроорганизмам с интенсивностью процессов поддержания, близкой к минимальной, если иметь в виду независимую от ju компоненту этих процессов. Формулы материально-энергетического баланса сделали возможной оценку //-зависимой компоненты затрат на поддержание клеток, определенмы получили [297]: для глюкозы те1 = 0.51 ч" ; для метанола эта величина в 1.5 раза выше из-за влияния потерь в предварительном обмене. Для этанола wel = 1.1 ч-1, что требует дальнейших исследований для объяснения разницы этой величины по сравнению с глюкозой.
Взаимосвязь баланса и кинетики роста микроорганизмов в условиях субстратного лимитирования и ингибирования. Исследования проводились с этанолассимилирующими дрожжами Candida valida при непрерывном культивировании в стационарных режимах роста [331-332, 351-354]. Исследовалось влияние концентраций этанола S и цинка С (соответственно, органического и минерального субстрата) на удельную скорость роста и выход биомассы. Концентрации обоих субстратов изменялись в пределах от крайне низких до столь высоких, что рост практически прекращался, то есть фактически в полном допустимом для роста диапазоне концентраций. Было проведено два эксперимента. В одном из них концентрация остаточного этанола S изменялась от нескольких мг/л до 55 г/л, тогда как концентрация цинка менялась мало и была в пределах плато зависимости //(С) ( 7 мг/л, см ниже). В другом, напротив, S была относительно постоянна в пределах плато ju(S) и YX/S(S) ( 1 г/л, см ниже). Измерены значения удельной скорости роста ju и выхода биомассы из этанола YXJS- Для анализа полученных результатов нами разработана математическая модель роста клеточной популяции. Ее отличие от моделей, опубликованных в литературе;, состоит в следующем. 1) Принято, что кинетической характеристикой, непосредственно зависящей от условий среды, является удельная скорость потребления органического субстрата qs, а не удельная скорость роста ju. Это предположение является естественным, поскольку ферментативные реакции первичной мета-болизации субстрата более подвержены его влиянию, чем реакции синтеза макромолекул биомассы. Кроме того, распространенные в литературе модели микробных культур предполагают, что ju(S) = 0 при S = 0. В то же время существование затрат энергии на поддержание клеток требует ненулевого потока субстрата даже при нулевой скорости роста. Но требование qs 0 при S = 0 противоречит принципам химической кинетики. Поэтому корректным является принятие зависимости именно qs от концентрации субстрата. Нами исследовалось влияние концентраций двух субстратов на рост Candida valida. Поэтому удельная скорость потребления этанола рассматри- валась как функция двух концентраций - этанола S и цинка С: qs(S,C). Эта функция взята нами в виде:
Временной масштаб переходных процессов в непрерывных культурах. Изохроны
Важной проблемой при формулировке и исследовании математических моделей является размерность системы дифференциальных уравнений. Она определяется количеством существенных переменных, описывающих тесно взаимосвязанные свойства объекта. Чем меньше размерность, тем проще система, тем меньше разнообразие ее поведения. На стадии формулирования модели упрощение достигается правильным выбором схемы механизмов, определяющих динамику объекта. Однако в каждом случае существует минимальная схема, такая, что при дальнейшем упрощении утрачивается соответствие объекту, теряются важные особенности его динамики. Существуют, однако, системы ОДУ с такими значениями параметров, которые приводят к реальным упрощениям поведения описываемых ими объектов. Эти системы имеют резко различающийся порядок величин правых частей, что приводит к столь же различающемуся масштабу скоростей изменения переменных и к быстрому приближению части переменных к особым подмножествам в фазовом пространстве [26,27,133,207,214]. Например, на фазовой плоскости таким подмножеством является линия. Дальнейшее движение изображающей точки происходит вблизи такой линии (или подмножества большей размерности, когда фазовое пространство имеет размерность больше, чем 2). Тем самым размерность решения вблизи такого подмножества ниже, чем размерность исходной системы уравнений, на размерность подмножества. Скорость движения вдоль вышеописанных подмножеств намного меньше, чем скорость приближения к ним. Поэтому мы называем такие линии на фазовой плоскости линиями медленного движения (ЛМД) [368-371]. Траектории системы ОДУ состоят из отрезков ЛМД и отрезков быстрых частей траекторий. Эти принципы получили широкое применение в моделях, описывающих динамику полиферментных систем в гомогенном растворе [27,133,207]. В моделях популяций, напротив, до наших работ они практически не использовались. Нами была поставлена задача провести подобный анализ для непрерывной культуры, найти биофизическую интерпретацию ЛМД. Этот анализ необходим не только для изучения точечной модели популяции, но и для подготовки к аналогичному изучению распределенной модели (см. раздел 5.5).
Кроме того, нами была поставлена задача разработать способ отображения временных свойств решений ОДУ на фазовой плоскости, удобный для приложений к конкретным задачам. Формулировка модели и соотношения между входящими в нее величинами. В качестве основы нами взята модель непрерывной культуры микроорганизмов, учитывающая влияние одного субстрата на рост: = -qsX + QsS0-DS, = juX-DX (5.2.1) dtc atc В этой системе уравнений нами сделано обобщение двух известных моделей роста микробных культур - одна для случая, когда субстрат подается с жидкой питательной средой (тогда Qs-D - скорости разбавления), другая для случая подачи субстрата с потоком газа (тогда S0 - равновесная с газом концентрация растворенного субстрата, a Q% = KLa). Здесь tc - обычное размерное время; прочие обозначения - те же, что и выше (Глава 1). В отличие от общепринятых моделей такого типа, мы рассматриваем зависимость от концентрации субстрата не скорости роста ju, а удельной скорости потребления субстрата qs. Как и в разделе 4.6, это сделано потому, что прямое влияние концентрации субстрата имеет место именно на первичные реакции его ме-таболизации. Соответственно, qs = 7s( ) В данной модели учтена известная взаимосвязь qs и // (Глава 1): M gS(sySs-msYSs (5.2.2) Зависимость q{S) взята в виде, учитывающем как лимитирование, так и ингибирование субстратом: 4siS) = 4mS 2/ (5.2.3) Ks+S + S2/Ki Мы исследовали влияние на динамику этой модели следующего факта: для большинства культур величина Ks на порядки ниже, чем концентрация субстрата в подаваемой среде S0, тогда как К{ намного больше, чем Ks и часто имеет тот же порядок, что SQ. Величина S0 связана с концентрацией биомассы, которую необходимо получить, и имеет порядок единиц или десятков граммов на литр. Величины Ks и К{ определяются метаболизмом клеток. Примеры их значений даны в таблице 5.2.1. Из приведенных данных видно, что для многих микроорганизмов Ks имеют порядок 10 2 4-10 3 граммов на литр и даже ниже. Более высокие значения Ks могут быть получены при неправильном подборе состава подаваемой среды, когда рост в действительности лимитируется другим субстратом. В таких случаях полученные «константы насыщения» таковыми в действительности не являются, а реальные Ks столь же низки, как и вышеупомянутые. Отсюда следует, что весьма часто имеет место ситуация, когда Ks « S0. Для субстратов, подаваемых с жидкой средой, это означает, что S Ks, и тогда аналогичное соотношение имеет место для скоростей подачи субстрата и оттока остаточного субстрата из ферментера: DS « DS0. Такое же соотношение имеет место и для газообразных субстратов. Произведение KLaSQ в ферментерах имеет порядок величины 1 ч- 10 г/л ч (иногда и выше), D 0,014-1 ч , Ks для ( - порядка 10 г/л или ниже (таблица 5.2.1). Отсюда в лимите по кислороду DS « KLaS0 - скорость подачи много больше скорости оттока. Общая форма этого соотношения: DS « QSS0. В обобщенной модели (5.2.1) пренебрежение членом DS дает стационарное значение концентрации биомассы: X = —s x/s . Мы поставили за- D + msY$s дачу найти другие следствия соотношенияDS«QSS0 для динамики клеточной популяции. Преобразование уравнений к безразмерной Форме было произведено с использованием следующих переменных и параметров: D + msY$s D + msY s (5.2.4) = a= b = —A— Здесь Vm - максимальное значение qs(S) (плато или экстремум q$(S) в случае субстратного ингибирования). Для (5.2.3) Vm =gm/(l + 2л[к), где к = Ks/Ki . Безразмерные уравнения имеют вид: є— = b[-av(s)x + l-ss], — = av(s)x-x, (5.2.5) dt dt где v( ) =(1 + 2-7 ) г-. Стационарное решение системы (5.2.5) x,s l + s + fcs для x Ф 0 находится из алгебраических уравнений: av{s)=\, x = l-ss (5.2.6) Разделение быстрых и медленных компонент переходных процессов. В хемостатном режиме а \, s 1, х »1.
Собственные значения линеаризованной системы дифференциальных уравнений, при вычислении которых использована малость є: -%гд«/(»)4 - 2=-1 (5-2.7) є as Поскольку в хемостатном режиме роста f(s) 1, UJ , \AJ » l/U. є Последнее неравенство, как и наличие малого множителя є при производной в одном из уравнений (5.2.5), говорит о наличии быстрой и медленной компонент у переходных процессов при установлении стационарного режима. Порядки скоростей этих процессов различаются в l/є раз. Для исследования быстрых и медленных переходных процессов переменные х и 5 были, согласно общему математическому методу исследования сингулярно возмущенных систем ОДУ [214], представлены нами в виде s(t,s)=S (t,) + Us(t{,e), x{t,) = x(t,)+Tbc(tf,), (5.2.8) где У и X - медленно меняющиеся, ШиПх- быстро меняющиеся слагаемые переменных s и х, t{ = t/є - время для «быстрых» слагаемых. Основной прием при таком исследовании - подстановка (5.2.8) в уравнения (5.2.5) и разделение последних на отдельные уравнения для быстрых и медленных компонент [214]. Проблемой при этом является аналогичное представление нелинейных членов. В (5.2.5) такой член один: v(s)x, который обозначим как ф( ,х). Эту величину представляем как Ф($,л;) = Ф + ПФ, где Ф = Ф(?(І,Є\Х(І,Є)), (5.2.9) ПФ = 3 (l(tf є, є) + Us(tf, є), %(tf, є) + Ux(t{, є)) - Ф(?(ґ, є \ %(t, є)). При разделении уравнений на «быстрые» и «медленные» Ф и ПФ включаются, соответственно, в уравнения для медленных и быстрых процессов. Далее каждая из переменных &(ґ,є), x(t,s), Yls(tf,), Ux(t{ ,є) разлагается в ряд по степеням є, начиная со степени 0. После подстановки этих рядов в уравнения (5.2.5) суммы всех членов при одинаковых степенях є приравниваются нулю [214,370]. Таким образом получается цепочка уравнений, дающая при суммировании их решений точное решение для s(t) и x(t). Для этих уравнений формулируется также цепочка начальных условий. При столь малых значениях є, как в данной задаче, нулевое приближение описывает решение с высокой точностью. Обозначая это приближение как (t), x(t), Hs(t), Tbc(t), находим для него следующие уравнения и начальные условия. Для медленного движения: 0 = -av(:r)x + l, — = 1-х (5.2.10) at Для быстрого движения: = М- (0)+Ш( ))[(г(0)+1Ь(%))] + 1}; = 0 (5.2.Ц) atf dtf Начальные условия для (t), %(t), Tls(tf), Tlx(tf) находятся из общих начальных условий для s(t) и x(t), то есть (0) и х(0).
