Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы. Видовая идентификация микроорганизмов: теоретические и прикладные аспекты 8
1.1 Современные представления о таксономии и номенклатуре микроорганизмов (на примере представителей рода Staphylococcus) и методы их видовой идентификации . 8
1.2 Вероятностно-статистические методы, применяемые для целей межвидовой дифференциации микроорганизмов. 13
1.3 Практические аспекты видовой идентификации микроорганизмов при оценке биологического разнообразия риродных экосистем. 29
Глава 2 Объекты и методы исследования 37
2.1 Объекты исследования - микроорганизмы рода Staphylococcus и методы их выделения . 37
2.2 Методы видовой идентификации стафилококков 39
2.3 Методы математического анализа и программирования. 42
Глава 3 Обоснование использования метода кластерного анализа для целей межвидовой дифференциации и его использование при разработке "Универсальной программы для видовой идентификации микроорганизмов".51
3.1 Сравнительный анализ результатов дифференциации, полученных методами корреляционного, дискриминантного анализа и кластерного анализа. 51
3.2 Использование метода кластерного анализа при разработке «Универсальной программы для видовой идентификации микроорганизмов». 57
Глава 4 Анализ диагностической эффективности различных тест систем с использованием разработанной универсальной компьютерной программы для видовой идентификации стафилококков. АЛ Анализ диагностической эффективности тест-системы 70 ПБДС (пластина биохимическая дифференцирующая стафилококки), производимой НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород, Россия). - 69
4.2 Анализ диагностической эффективности тест-систем для 73 идентификации стафилококков «STAPHYtest-8» и ««STAPHYtest-16» (Lachema, Чехия).
4.3 Анализ диагностической эффективности тест-систем API- 81 Staph и ID32(«bioMerieux», Франция).
Глава 5 Оценка биологического разнообразия стафилококков для оценки техногенного воздействия на природные экосистемы. 88
Заключение 96
Список использованных источников 106
Приложение А 117
Приложение Б 118
- Современные представления о таксономии и номенклатуре микроорганизмов (на примере представителей рода Staphylococcus) и методы их видовой идентификации
- Объекты исследования - микроорганизмы рода Staphylococcus и методы их выделения
- Сравнительный анализ результатов дифференциации, полученных методами корреляционного, дискриминантного анализа и кластерного анализа.
Введение к работе
Актуальность проблемы. Оценка видового биологического разнообразия в настоящее время стала одним из традиционных методов оценки состояния природных экосистем и экологического мониторинга [34]. В наибольшей степени подобный подход разработан применительно к сложным многоклеточным биообъектам (животным, растениям, насекомым и др.), для большинства которых показано снижение показателей видового биологического разнообразия при увеличении антропогенной нагрузки на экосистему [31]. Применительно же к представителям микромира представления о биологическом разнообразии разработаны в значительно меньшей степени [36], что определяется сложностями проведения корректной видовой идентификации.
В полной мере подобное утверждение может быть отнесено и к имеющим важное экологическое и биоиндикационное значение микроорганизмам рода Staphylococcus, в номенклатуре и таксономии которых в 80-90-х годах XX века произошли принципиальные изменения [13]. В результате для решения данной задачи предложено множество миниатюризированных тест-систем для биохимической идентификации с визуальным или автоматизированным учетом результатов и определением вида микроорганизма по прилагаемым каталогам кодов или с использованием специализированных компьютерных программ [38].
Однако, существенным недостатком разработанных на сегодняшний день методов является все еще невысокая достоверность результатов идентификации, определяемая особенностями используемых математических алгоритмов с невозможностью получения диагностических заключений при произвольной комбинации идентификационных тестов. В этой связи актуальным представляется разработка универсальной компьютерной программы видовой идентификации стафилококков, позволяющей максимально оптимизировать данную процедуру и тем самым, создать условия для качественной
5 оценки присутствия данных микроорганизмов в организме человека и объектах внешней среды.
Цель работы: Повышение эффективности идентификации сложных биологических объектов на примере микроорганизмов рода Staphylococcus с использованием вероятностно-статистических методов обработки данных.
Задачи исследования:
Выбор и обоснование многомерного статистического метода для осуществления видовой идентификации микроорганизмов с последующей разработкой компьютерного модуля, унифицирующего и автоматизирующего данную процедуру на примере представителей рода Staphylococcus.
Адаптация разработанной программы к решению задач анализа диагностической эффективности различных тест-систем для видовой идентификации стафилококков с определением причин возникновения возможных диагностических ошибок.
Оценка видового биологического разнообразия санитарно-показательных микроорганизмов рода Stapylococcus в воздушной среде и организме носителей в условиях техногенного химического воздействия, формируемого в зоне влияния крупного объекта газовой промышленности.
Научная новизна. Предложени и обоснован оптимальный вероятностно-статистический метод дифференциации сложных биологических объектов, основанный на использовании процедуры кластерного анализа. Продемонстрированы преимущества подобного подхода перед применяемыми в настоящее время вероятностно-статистическими методами, заключающиеся в высокой точности показателей идентификации, а также мобильности процедуры при введении новых дифференцирующих тестов или расширении перечня идентифицируемых видов.
Впервые проведен анализ диагностической эффективности наиболее распространенных тест-систем для видовой идентификации стафилококков и охарактеризованы основные причины возникновения диагностических оши-
6 бок. На основании проведенных исследований получены новые данные о зависимости диагностической эффективности тест-системы от суммарной информативности входящих в нее дифференцирующих тестов, а также отклонений от значений конвенциональных тестов, приведенных в «Определителе бактерий Берджи» [29].
Получены новые данные об увеличении видового биологического разнообразия стафилококков в организме человека и объектах внешней среды в условиях техногенного химического воздействия на экосистему, преимущественно связанные с расширением перечня определяемых видов и, тем самым, для своей оценки требующие использования индекса разнообразия Шеннона.
Практическая значимость. Разработана, апробирована и внедрена в работу бактериологических лабораторий «Универсальная компьютерная программа для видовой идентификации микроорганизмов» (свидетельство о регистрации № 2004610330 от 2 февраля 2004г.), позволяющая автоматизировать и унифицировать процесс интерпретации биохимических идентификационных тестов. Основным отличием данной программы от существующих аналогов является то, что она представляет из себя «открытую систему», позволяющую получить правильное диагностическое заключение при любой комбинации дифференцирующих тестов, как входящих в состав коммерческих идентификационных систем, так и выполняемых непосредственно пользователем.
Определены направления создания новых и совершенствования существующих тест-систем для видовой идентификации стафилококков на основе отбора комплекса тестов с наибольшей диагностической информативностью.
Продемонстрирована возможность использования показателя видового биоразнообразия стафилококков в организме человека и объектах внешней среды при проведении микробиологического мониторинга природных экосистем в условиях их техногенного химического загрязнения.
7 Положения, выносимые на защиту:
Применение методов кластерного анализа для целей идентификации сложных биологических объектов на примере микроорганизмов рода Staphylococcus.
Сравнение диагностической эффективности наиболее распространенных тест-систем для видовой идентификации стафилококков.
Использование показателей видового биологического разнообразия стафилококков при проведении экологического мониторинга.
Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 4-х всероссийских и региональных научно-практических конференциях, экспонировались на Второй Приволжской Ярмарке «Российским инновациям - Российский капитал» и IX выставке - конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции», отмечены дипломом за разработку «Универсальной компьютерной программы для видовой идентификации микроорганизмов». По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 4 статьи в реферируемых журналах и 2 тезисов докладов в материалах конференций, получено свидетельство о регистрации разработанного программного продукта.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 118 страницах и состоит из введения, пяти глав, заключения, двух приложений и списка использованной литературы, включающего 104 публикации отечественных и зарубежных авторов. Материал иллюстрирован 6 таблицами и 18 рисунками.
Современные представления о таксономии и номенклатуре микроорганизмов (на примере представителей рода Staphylococcus) и методы их видовой идентификации
Вид — одна из наиболее важных таксономических групп (таксонов) в системе органического мира. По существующим нормативам вид определяется бинарным латинским наименованием, первая часть которого отражает его родовую, а вторая собственную видовую принадлежность (например -Staphylococcus aureus).
В современной общебиологической систематике под видом понимают «совокупность скрещивающихся популяций, обладающих общим генофондом, экологическим единством и репродуктивной изоляцией» [40]. Однако, применительно к представителям микромира критерий репродуктивности не имеет такого решающего значения, как в таксономии высших животных и растений в связи с тем, что обмен генетическим материалом может существенно выходить за пределы вида. Соответственно, в систематике бактерий объединение особей в один вид, а также выделение надвидовых или лодви-довых систематических групп основывается на комплексном учете иных признаков (критериев), к которым могут быть отнесены: 1) морфология микробной клетки и ее тиикториальные свойства (форма, размеры, строение, наличие спор, капсул, жгутиков, фимбрий, окрашиваемость различными красителями и др.); 2) физиологические проявления (питательные потребности, типы питания и дыхания, метаболическая активность, характер, скорость и условия роста на жидких и плотных питательных средах, фиксация азота и др.); 3) антигенная структура; 4) экологические особенности (формы и проявления взаимоотношений с живой и неживой средой, роль в круговороте веществ и энергии, тропизм к хозяевам, клеткам и тканям); 5) генетические критерии {% Г+Ц пар в молекуле ДНК, результаты молекулярной ДНК-ДНК гибридизации, последовательность нуклеотидов в 16S-PHK) [40]. Все перечисленные критерии в большей или меньшей степени лежат в основе классификаций микроорганизмов, среди которых наиболее популярной и широко применяемой в международном масштабе является схема, приведенная в «Определителе бактерий Берджи» [29].
Объекты исследования - микроорганизмы рода Staphylococcus и методы их выделения
При проведении работы использована группа из 23 эталонных штаммов стафилококков с известной видовой принадлежностью и биохимическими характеристиками, полученных из музея живых бактериальных культур Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ им.Н.Ф.Гамалеи (Москва) и преимущественно представленных культурами, депонированными в Чешской коллекции микроорганизмов (ССМ), и включающих S.aureus ССМ885, Sxhromogenes ССМ3387, S.cohnii ССМ2736, S.epidermidis CCM2124, S.gallinarum CCM3572, S.haemolyticus CCM2737, S.hominis CCM3474, S.hyicus CCM2368, S.intermedius CCM5739, S.lentus CCM3472, S.saprophyticus CCM883, S.sciuri CCM3473, S.simulans CCM2705, S.warneri CCM2730 и др. Кроме того, ряд культур был представлен штаммами, депонированных в Американской коллекции типовых культур (АТСС) -S.auricularis АТСС33753, S.caseolyticus АТСС13548 и др., а также единичными культурами, полученные из Германии (S.carnosus DSM20501). Идентификация данных микроорганизмов являлась одним из этапов депонирования и проводилась в полном соответствии с современными представлениями о таксономии и номенклатуре стафилококков, что и позволяет рассматривать их в качестве общепризнанных эталонных культур соответствующих видов.
В анализируемую выборку входили также 150 изолятов из коллекции Д.Г.Дерябина (кафедра общей биологии ГОУ ОГУ), выделенных из клинического материала, домашних и сельскохозяйственных животных, а также объектов внешней среды, идентифицированных до вида референс-методом по совокупности используемых для этих целей таксономически значимых конвенциональных тестов, приведенных в «Определителе бактерий Берд-жи», с использованием сред и реагентов фирмы «HiMedia». Кроме того, при анализе видового биологического разнообразия были изучены 326 штаммов стафилококков, из которых 132 изолированы из атмосферного воздуха населенных пунктов, расположенных в зоне влияния крупного предприятия газовой промышленности (72 штамма) и фоновой зоне (60 штаммов), а 194 культур выделены из передних отделов носа бактерионосителей, из которых 136 проживали в населенных пунктах, расположенных в обследуемой и 58 в фоновой зоне.
Сравнительный анализ результатов дифференциации, полученных методами корреляционного, дискриминантного анализа и кластерного анализа
В связи с многоплановостью и сложностью исследуемых объектов -микроорганизмов, данные о которых носят многомерный характер (для каждого вида регистрируются значения множества разнородных и равнозначных переменных), на первый план выходят проблемы построения их группировок и классификаций по многомерным данным [4,14] с использованием современного аппарата статистического анализа.
При этом общая задача классификации, в зависимости от форм задания исходных статистических данных по схеме «на входе - на выходе задачи», выглядит следующим образом:
На «входе» задачи имеется:
1) п классифицируемых объектов, представленных в виде матрицы, где каждая строка матрицы отражает значения характеризующих объект признаков;
2) обучающие выборки, каждая из которых определяет значения анализируемых признаков на объектах, о которых априорно известно, что все они принадлежат определенному виду и каждый вид представлен своей порцией выборочных данных.
На «выходе» задачи должен быть результат в одной из двух форм: 1) если число видов и их смысл выявляются в процессе классификации, то результатом классификации является разделение множества классифицируемых объектов на определенное число однородных групп, каждая из которых объявляется «видом». Так обстоит дело при проведении поисковых таксономических исследований, когда перед исследователем стоит задача упорядочивания некоей группы наблюдений; 2) если число видов и их смысл известны заранее, то каждое из классифицируемых многомерных наблюдений должно быть снабжено номером вида, к которому оно принадлежит. Таким образом дело обстоит в случае, если основные характеристики вида известны из ранее приведенных исследований и законодательно закреплены. Именно этот вариант и является соответствующим поставленной нами задачи проведения видовой идентификации микроорганизмов на примере представителей рода Staphylococcus.
